茯苓、蜜环菌、黑木耳协同作用对小鼠免疫功能的影响.doc

茯苓、蜜环菌、黑木耳协同作用对小鼠免疫功能的影响哈尔滨师范大学张丽娟【摘要】 观察茯苓、蜜环菌、黑木耳及其配伍对小鼠免疫力的影响。结果表明，三种食用菌联合使用，可显著提高小鼠的淋巴细胞增殖能力和巨噬细胞吞噬能力（P0.05），说明三种食用菌配伍可在特异性免疫和非特异性免疫两面提高小鼠的免疫力，具有联合增效的作用。【关键词】 茯苓，蜜环菌，黑木耳，免疫力，吞噬百分率The effect of compatibility Poria cocos，Armillara mellea with Auricularia auricular on immunological function in miceAbstract： To observe the immunity effect of Poria cocos，Armillara mellea，Auricularia auricular and their compatibility. The results show that three kinds of edible fungus used in combination, can significantly improve the mices capacity of lymphocytes proliferations and macrophages phagocytosis (P0.05). These mean that compatibility of Poria cocos, Armillara mellea with Auricularia auricular has a synergistic effect to enhance the bodys immune system in both specific immunity and nonspecific immunity.Key Words： Poria cocos，Armillara mellea，Auricularia auricular，Immunity，Devouring percentage人类发现、认识、利用食用菌的历史悠久，在我国，几千年前食药用菌就被作为传统中药的重要组成部分，李时珍的药学著作本草纲目和陈藏器的本草拾遗均有记载1。近些年来，食用菌的保健作用越来越引起人们的重视。茯苓、蜜环菌、黑木耳是我国资源丰富的三种食用菌，具有地源优势和开发潜力。茯苓作为一种传统的中药材，医疗和保健作用已经得到了一致认可2,3。蜜环菌可与天麻共生4，具有与天麻类似的药理作用5。黑木耳营养丰富，食味鲜美，不但是营养价值很高的食用菌，而且是药用价值较高的药用菌6，是世界公认的保健品。健康是人类的一项基本要求，也是社会进步的重要标志和潜在动力。据调查显示，90%的疾病与免疫力减弱有关。本实验选择淋巴细胞转化能力和巨噬细胞吞噬能力作为观察指标，研究茯苓、蜜环菌、黑木耳及其配伍对小鼠免疫系统的影响，为其在医药领域的开发利用提供理论依据。1 材料1.1 动物清洁级昆明小鼠，雄性，68周龄，体重1822g。1.2 试剂及配制茯苓、蜜环菌、黑木耳提取物：杭州众生菌蕈生物技术有限公司提供； ConA：Sigma公司；MTT、Hanks液：Sigma公司；PBS缓冲液（pH7.27.4）等。MTT液：将5mg MTT溶于1mL pH7.2的PBS中，现用现配。无菌Hanks液：使用前用3.5%的无菌NaHCO3调节pH7.27.4。鸡红细胞悬液制备：取鸡血置于三角瓶中，加入玻璃珠，摇动脱去纤维。用0.9%NaCl溶液洗涤3次，2000r/min离心10min，弃去上清，用0.9%NaCl溶液配成20%的鸡红细胞悬液。1.3 仪器PL203 型电子天平：上海精天电子仪器有限公司；CO2孵化箱：日本三洋；F200 型多功能酶标仪：瑞士TECAN 集团公司。2 方法2.1 ConA 诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验80只小鼠随机分为8组，灌胃量均为0.5mL，每日一次。分组情况及药物浓度见表1。连续灌胃30d后，颈椎脱臼处死小鼠，无菌取脾脏，用镊子轻轻将脾磨碎，制成单个细胞悬液。经200目筛网过滤，用Hanks液洗涤，1000r/min离心10min，共洗涤两次。然后调整细胞浓度为3106个/mL。将每份脾细胞悬液加入24孔培养板中，1mL/孔，2孔/样品，一孔加75L ConA 液（相当于7.5ug/mL），另一孔作为对照，置5%CO2，37CO2孵箱中培养72h。培养结束前4h，每孔轻轻吸去上清液0.7mL，加入0.7mL不含小牛血清的RPMI1640培养液，同时加入MTT（5mg/mL）50L /孔，继续培养4h。培养结束后，每孔加入1mL酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。然后分装到96孔培养板中，每孔作3个平行样，用酶标仪，以570nm波长测定光密度值7。表1 试验动物分组序号组别剂量（100mg/kg）空白对照组0.9% NaCl茯苓3蜜环菌2黑木耳2茯苓+蜜环菌3+2茯苓+黑木耳3+2蜜环菌+黑木耳2+2茯苓+蜜环菌+黑木耳3+2+22.2 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验80只小鼠随机分为8组，灌胃量均为0.5mL，每日一次。分组情况及药物浓度见表1。连续灌胃30d后，每只小鼠腹腔注射20%鸡红细胞悬液1mL。间隔30min，颈椎脱臼处死动物，将其仰位固定于鼠板上，正中剪开腹壁皮肤，经腹腔注射入生理盐水2mL，转动鼠板1min。然后吸出腹腔洗液1mL，平均分滴于2片载玻片上，放入垫有湿纱布的陶瓷盒内，移置37孵箱温育30min。结束后，于生理盐水中漂洗，以除去未贴片细胞。晾干，以1：1丙酮甲醇溶液固定，4%（v/v）Giemsa-磷酸缓冲液染色3min，再用蒸馏水漂洗晾干。油镜下计数巨噬细胞，每张片计数100个，按下式计算吞噬百分率7。吞噬百分率（%）=吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数100 计数的巨噬细胞数2.3 统计学分析实验结果采用SPSS 17.0 for windows统计软件进行分析，实验结果用均数标准差（XS）表示。3 结果与分析由表2可知，茯苓组（组）可提高光密度差值，但对吞噬百分率影响不显著。蜜环菌组（组）对小鼠的淋巴细胞增殖能力和巨噬细胞吞噬能力上均有一定的提高，但不显著（P0.05）；但将二者联合应用（组），对小鼠的免疫力影响显著，说明二者配伍可起到提高免疫力的作用。黑木耳组（组）可提高巨噬细胞的吞噬能力，但不能增殖淋巴细胞，说明黑木耳可提高小鼠的非特异性免疫能力，对特异性免疫影响不明显。黑木耳与茯苓配伍时（组），光密度差值与单方组比较没有明显变化，吞噬百分率提高，提示二者配伍增效作用存在一定的局限性。黑木耳和蜜环菌联合应用（组）可显著提高光密度差值和吞噬百分率，配伍效果显著。组为茯苓、蜜环菌、黑木耳复合组，在淋巴细胞增殖能力和巨噬细胞吞噬能力上较空白对照组和其他实验组均有显著提高，说明具有配伍增效的作用。表2 实验结果序号组别光密度差值吞噬百分率（%）空白对照组0.0740.01837.515.75茯苓0.0920.014*40.484.40蜜环菌0.0860.01242.142.55黑木耳0.0870.01145.344.76*茯苓+蜜环菌0.1010.009*43.083.31*茯苓+黑木耳0.0860.01745.103.34*蜜环菌+黑木耳0.0970.014*46.122.26*茯苓+蜜环菌+黑木耳0.1200.015*49.982.17*注：与空白对照组相比，* p0.05。4 结论生物有机体是一个复杂的统一的整体，机体的免疫功能通常由特异性免疫和非特异性免疫反应组成8。淋巴细胞是反映机体特异性免疫功能的重要标志，吞噬能力是衡量机体非特异性免疫功能的标志9,10。本研究表明，茯苓、蜜环菌、黑木耳三种食用菌联合使用，可显著提高小鼠的淋巴细胞增殖能力和巨噬细胞吞噬能力，说明三种食用菌配伍可在特异性免疫和非特异性免疫两面提高小鼠的免疫力，具有联合增效的作用。参考文献1 袁广峰. 三种食用菌的活性物质分析及抗氧化、抗肿瘤等功能研究D. 河北师范大学硕士学位论文，2008.2 张敏，高晓红，孙晓萌等. 茯苓的药理作用及研究进展J. 华北大学学报（自然科学版），2008，9（1）：63-68.3 张璐，刘强. 茯苓多糖制备工艺及药理作用研究进展J. 中国实验方剂学杂志，2006，12（4）：61-64.4 黄健屏. 食用菌栽培学M. 长沙：湖南科学技术出版社，1995：242.5 张嘉，杨延旗，淡海等. 蜜环菌的化学成分J. 西北植物学报，2002，22（4）：952-956.6 张大为. 以中药为基质的黑木耳多糖发酵工艺条件的研究D. 贵州大学硕士研究生学位论文，2008.7 保健食品检验与评价技术规范（2003年版）M. 中华人民共和国卫生部，2003：22-24.8 杨颖，蔡玟，黄俊明. 西洋参含片和原粒茶包对小鼠免疫