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核酸的分离与纯化 核酸在细胞中总是与各种蛋白质结合在一起的。核酸的分离主要是指将核酸与蛋白质、多糖、脂肪等生物大分子分开。 在分离核酸时，应遵循两个原则：一是保证核酸一级结构的完整性，因为完整的一级结构是核酸结构和功能研究的最基本的要求；二是尽量排除其它分子的污染，保证核酸样品的纯度。 核酸分离与纯化的过程一般都包括了材料的选择、核酸的释放、核酸与其它生物大分子的分离、核酸的纯化与鉴定、核酸的浓缩、保存等几个主要步骤。 每一步骤又可由多种不同的方法单独或联合实现。 一、材料的选择 临床常见的标本血液、组织及体外培养的细胞等都可作为提取核酸的原料，具体实验材料的选择应根据实验的目的来确定。二、核酸的释放（一）机械法包括低渗裂解、超声裂解、微波裂解、冻融裂解和颗粒破碎等物理裂解方法。这些方法用机械力使细胞破碎，但机械力也可引起高分子量线性分子的断裂，因而不适用于染色体DNA的分离纯化。 （二）化学法 在一定的pH 环境下，加入表面活性剂或强离子剂使细胞裂解，蛋白质和多糖沉淀， 核酸被从细胞内释放出来。向缓冲液中加入一些金属离子螯合剂抑制核酸酶的活性，保护核酸不被降解。 （三）酶法 通过加入溶菌酶或蛋白酶（如蛋白酶K）使细胞破裂，核酸释放。蛋白酶还能降解与核酸结合的蛋白质，促进核酸的分离。 溶菌酶能催化细菌细胞壁的蛋白多糖N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸残基间的-1,4 键水解。蛋白酶K能催化水解多种肽键，且在65及有EDTA、尿素和去垢剂如0.5%SDS 或1%Triton X-100 存在时仍保留有酶活性，对于高分子量核酸的提取有很大的优势。三、核酸的分离与纯化（一）核酸分离纯化的基本方法 1. 酚抽提法细胞裂解后离心分离含核酸的水相，加入等体积的酚氯仿异戊醇混合液，混匀后离心分离。疏水性的蛋白质被分配至有机相，核酸则被留于上层水相。在含核酸的水相中加入醋酸钾或醋酸钠，形成核酸盐，核酸盐可被一些有机溶剂沉淀，离心得到的核酸可以用70%乙醇洗涤以除去多余的盐分，即可获得一定纯度的核酸。 2. 层析法包括吸附层析、亲和层析、离子交换层析等。因分离和纯化同步进行，并且有商品试剂盒供应而被广泛应用于核酸的纯化。在一定的离子环境下，核酸可被选择性地吸附到硅土、硅胶或玻璃表面而与其他生物分子分离。 3.密度梯度离心法双链DNA、单链DNA、RNA 和蛋白质具有不同的密度，因而可经密度梯度离心的方法形成不同密度的纯样品区带，该法适用于大量核酸样本的制备。 氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心法是纯化大量质粒DNA 的首选方法。 氯化铯是核酸密度梯度离心的标准介质， 梯度液中的溴化乙锭与核酸结合，离心后形成的核酸区带经紫外灯照射产生荧光而被检测。用注射针头穿刺回收后，通过透析或乙醇沉淀除去氯化铯而获得纯化的核酸。（二）基因组DNA的分离纯化1.生物体组织细胞 2酚抽提法玻棒缠绕法3.基因组DNA粗品4.PFGE分离5.特定的DNA片段6.AGE分离PAGE分离7.乙醇沉淀洗涤8.基因组DNA纯品9.精分离10.粗分离11.前处理12.有机溶剂抽提离子交换层析纯化13.细胞裂解14.蛋白质变性沉淀降解15.DNA释放16.甲酰胺解聚法哺乳动物基因组DNA分离纯化的一般技术路线1.酚抽提法 以含EDTA、SDS及无DNA酶的RNA 酶裂解缓冲液裂解细胞，经蛋白酶K处理后，用pH8.0的Tris饱和酚抽提DNA，重复抽提至一定纯度后，根据不同需要行透析或沉淀处理，获得所需的DNA样品。 一、酚抽提法主要试剂的作用： EDTA： 二价金属螯合剂，抑制核酸酶； 降低细胞膜的稳定性SDS的作用： 溶解膜蛋白和脂肪，从而使细胞膜破裂； 溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸释放出来； 对RNA、DNA酶有抑制作用； 与蛋白质形成复合物，使蛋白质变性。蛋白酶K： 水解蛋白质的作用，消化DNA酶和细胞中的蛋白质。蛋白酶K与其他蛋白酶相比，它具有更强的水解能力，而且在SDS、EDTA存在时仍保持较高活性，可同时使用。 酚可以使蛋白质变性沉淀、抑制DNA酶活性。 PH 8.0的Tris溶液可以使得抽提出的DNA进入水相，减少在蛋白质层滞留。 在酚或酚-氯仿中加入少许的异戊醇，是可以减少实验中的气泡的产生，而且利于分相，保持分相的稳定性。 为什么苯酚要重蒸饱和后才能用于DNA的分离？ 苯酚在空气中经常被氧化生成醌，它能够产生自由基，如果直接用于DNA分离，会使磷酸二酯键断裂，造成DNA降解。氧化苯酚需要经过高温重蒸以除去氧化物，并用Tris-Hcl饱和酚，并调节至中性。另外使用饱和酚减少酚吸收更多的DNA溶液，降低DNA的损失率。2. 甲酰胺解聚法 细胞裂解与蛋白质水解同酚抽提法相似，但不进行酚的抽提，而是以高浓度的甲酰胺裂解DNA与蛋白质的复合物（即染色质），然后通过火棉胶袋的充分透析以除去蛋白酶和有机溶剂。3. 玻棒缠绕法 以盐酸胍裂解细胞，制备的DNA分子量只有大约80kb，其长度不适用于构建基因组DNA文库，但用于Southern 杂交和PCR反应都可以获得很好的结果。 该法简单快速，可同时提取多个样品。4异丙醇沉淀法 通过SDS和蛋白酶K消化与DNA结合的蛋白质，并失活DNA酶，酚氯仿抽提去除蛋白质后，用2倍容积的异丙醇来沉淀含0.1mol/L NaCl的DNA溶液，DNA沉淀是丝状，而RNA在异丙醇溶液中仍为可溶状态，利用这一物理特性从DNA中去除RNA，省去了加RNA酶消化RNA的步骤。（三）质粒DNA的分离纯化 质粒 质粒是细菌内独立于染色体并能自我复制的小环状DNA分子。 其大小范围从lkb至200kb以上不等，已经在形形色色的细菌类群中发现质粒，这些质粒都是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。 质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值，因而质粒的分离与提取则是最常用、最基本的实验技术。选择哪种方法制备质粒DNA，应考虑以下因素： 1菌株类型2质粒的大小3细菌染色体DNA变性条件强弱的控制4细菌的培养与收集 1. 碱裂解法 在NaOH提供的高pH（12.012.6）条件下，用SDS破坏细胞壁，裂解细胞，与NaOH 共同使宿主细胞的蛋白质与染色体DNA发生变性，释放出共价闭环的质粒DNA。 细胞裂解后，细胞壁碎片与变性的蛋白质和染色体DNA形成大的复合物，这些复合物在高钾盐条件下，可有效沉淀，而质粒DNA保留于上清中。通过无水乙醇沉淀质粒DNA，并用70%的乙醇洗涤，获得的DNA纯度可满足测序与PCR等实验的要求。 2. 煮沸裂解法 是将细菌悬浮于含Triton X-100和溶菌酶的缓冲液中，Triton X-100和溶菌酶破坏细胞壁后，沸水浴裂解细胞的同时可破坏DNA链的碱基配对，并使宿主细胞的蛋白质与染色体DNA变性，但共价闭环质粒DNA因结构紧密不会解链。当温度下降后，共价闭环质粒DNA可重新恢复其超螺旋结构。通过离心去除变性的蛋白质和染色体DNA，然后回收上清中的质粒DNA。 适用于小质粒DNA（15kb）的制备。3. SDS裂解法 是将细菌悬浮于等渗的蔗糖溶液中，用溶菌酶和EDTA处理以破坏细胞壁，去壁细菌再用SDS裂解，从而温和地释放质粒DNA到等渗液中，然后用酚/氯仿抽提。 该法有利于大质粒DNA（15kb）的提取。4. 小量一步提取法 直接将酚/氯仿与细菌培养物混合，同时完成细胞裂解与蛋白质变性两个过程，然后离心去除大部分胞核DNA与蛋白质，最后从上清中回收质粒DNA。 该法简单快速、经济可行，可用于内切酶图谱分析。 5. 质粒DNA的纯化（1）聚乙二醇沉淀法 质粒DNA的粗制品首先用LiCl沉淀大分子RNA，并用RNase消化小分子RNA；然后在高盐条件下，用PEG选择性地沉淀大的质粒DNA；沉淀的质粒DNA进一步用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀。（2）柱层析法 柱层析法纯化质粒DNA的关键是其填充的树脂。 树脂可分为两类：一类是利用疏水的相互作用来纯化质粒DNA样品；一类则通过离子交换与吸附的相互作用进行纯化。 以硅基质作为填充材料的柱层析，其作用原理是在多盐条件下，依靠DNA与硅基质的可逆性结合来进行纯化。通过暴露的磷酸盐残基，DNA吸附到硅基质上，以50%的乙醇溶液洗去RNA和糖类等生物大分子，然后加入TE或水溶液使DNA 分子重新水合，并通过离心洗脱出来。（3）CsCl-EB法 是一种沉降平衡离心法。经超速离心，离心介质CsCl形成一连续的密度梯度，在过量EB存在的条件下，各种不同密度的物质经离心平衡后得以分开。其中蛋白质密度小（1.3 g/cm31.4g/cm3），浮于液面；RNA密度大（2.0g/cm3），沉于管底；各种DNA密度介于蛋白质与RNA 之间，处于中部。五、质粒DNA的纯化 过量EB处理前，细菌染色体DNA与不同分子构型的质粒DNA的密度均为1.7g/cm3左右，难以区分。经过量EB处理后，不同分子构型的DNA与EB的结合能力不一样，因而密度下降不一致，可有效分离。 闭环质粒DNA为超螺旋三级结构，EB不易插入，结合量少，密度下降小，约为1.59 g/cm3。 染色体DNA、开环质粒DNA以及带切口的环状质粒DNA可以嵌入更多的EB，密度下降较多， 约为1.54 g/cm3。 （四）DNA片段的回收 无论采用何种方法从何种支持介质中回收DNA片段，都要注意两个原则，一是要提高DNA片段的回收率；二是要去除回收DNA样品中的污染。 DNA的回收率与DNA片段的大小有一定关系，随着分子量的增大，回收率明显下降，大于20kb时，回收率低于20%。 DNA片段的含量与回收率也有密切关系，量越少回收率越低，若DNA片段量小于500ng时，几乎很难回收。因此回收DNA片段时，要正确选择回收方法，并要注意提高DNA上样量，减少DNA回收时的洗脱体积以达到提高回收率的目的。 1. 从琼脂糖凝胶中回收DNA片段 主要包括二乙基氨基乙基（DEAE） 纤维素膜插片电泳法、电泳洗脱法、冷冻挤压法及低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法等。（1）DEAE纤维素膜插片电泳法 DEAE是一种阴离子交换纤维素，可以结合带负电荷的DNA分子。将DEAE纤维素膜插入到经琼脂糖凝胶电泳分离的核酸条带前，继续电泳直至所需回收的DNA片段刚好转移到膜上。取出DEAE纤维素膜， 低盐条件下洗去杂质，高盐条件下洗出DNA分子。 该法操作比较简单，可同时回收多个DNA 片段，对500bp5kb的DNA片段回收率好，纯度高，能满足大多数实验的要求。 DNA片段大于5kb时，因结合力增大而回收率下降。至10kb或为单链DNA时，其与膜的结合变得很牢固而难以回收。因此，本法不适合于分子量大于10kb的DNA片段的回收，也不能回收单链DNA。 （2）电泳洗脱法 包括两个主要步骤，一是将待回收的DNA 片段电泳出凝胶介质，使其进入一个便于回收的小容积溶液中；二是分离纯化出DNA片段。 按是否使用透析袋可分为透析袋电泳洗脱法与非透析袋电泳洗脱法两大类。 透析袋电泳洗脱法需要切下含待回收DNA 片段的凝胶条，然后放入透析袋内进行电泳，使DNA分子迁移出凝胶条进入透析袋的溶液中，最后经抽提纯化回收DNA分子。 该法操作很不方便而且不适合于同时回收大量不同的DNA片段，但可有效回收从200bp至大于50kb的DNA，尤其对大于5kb的DNA有良好的回收率。 （3）低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法 是从低熔点琼脂糖凝胶中切出含待回收DNA的凝胶块，利用其纯度高、熔点低（65）及凝固温度低（30）的特点， 在室温大于30，琼脂糖仍为液态的情况下，对DNA片段进行回收的方法。 回收片段的纯化方案，可分为有机试剂提取法、玻璃珠（或玻璃粉）洗脱法和琼脂水解酶（agarase）法。 有机试剂法以酚、氯仿抽提DNA，可以有效回收0.5kb5kb的DNA片段。 玻璃珠（或玻璃粉）洗脱法是将琼脂糖凝胶溶于高浓度的碘化钠溶液或高氯酸钠溶液中，然后加入玻璃珠（或玻璃粉）以结合DNA，经分离、洗涤后，在低盐缓冲液中将DNA洗脱下来。玻璃珠（或玻璃粉）洗脱法较有机试剂提取法快，但回收率略低。 琼脂水解酶法对切下的含DNA的凝胶块进行消化，将琼脂糖水解为二糖，释放的DNA用酚抽提，乙醇沉淀回收。 2. 从聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA片段 从聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA的标准方法是压碎与浸泡法。即将含待回收DNA条带的凝胶块切出，用吸头或接种针将其压碎，然后以洗脱缓冲液浸泡，使DNA洗脱出来。 能很好回收小于1kb的单链或者双链DNA，且纯度很高，无酶抑制剂，也无对转染细胞或微注射细胞有毒的污染物，虽费时但操作简单，是小片段DNA回收的较好方法。依分子量不同，其回收率从小于30%至大于90%不等。（五）RNA的分离纯化1. RNA制备的条件与环境 为防止RNase对RNA 的水解. 全力避免细胞外RNase的污染并抑制其活性. 尽快抑制细胞内RNase的活性并极力地去除RNase。 从RNA提取的初始阶段开始，就选择性地使用针对RNase的蛋白质变性剂、蛋白的水解酶和能与蛋白质结合的阴离子去污剂并联合使用RNase的特异性抑制剂（如DEPC）能极大地防止内源性RNase对RNA的水解。 在变性液中加入-巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）等还原剂可以破坏RNase中的二硫键，有利于RNase的变性、水解与灭活。 DEPC（焦碳酸二乙酯） 高度活化的烷基化试剂，破坏RNA酶活性。用来灭活缓冲液或器皿中的RNA酶。DEPC水制备：0.1%DEPC 在37C处理1h，并高压灭菌15min。玻璃制品和塑料制品应浸泡在0.1%的DEPC水溶液中， 37C处理1h或室温下过夜。DEPC非选择性的修饰蛋白质和RNA，且与一些缓冲液不相容，故在分离和纯化RNA的过程中不使用DEPC。2. 总RNA的分离与纯化 创造无RNA酶环境的工作主要包括两个方面：极力避免外源RNase的污染和尽力抑制内源性RNase的活力。 前者主要来源于操作者的手、实验的器皿和试剂；后者主要来源于样品中的组织细胞。 避免外源性RNase污染的措施主要是用0.1%的DEPC处理所用试剂和玻璃器皿，塑料器材最好使用灭菌的一次性用品，实验人员在操作过程中应戴口罩和手套，在超净工作台内完成提取过程等。 抑制内源性RNase的活性主要是尽可能早的去除细胞内蛋白，加入RNase抑制剂。在-巯基乙醇的协同作用下，高浓度的（异）硫氰酸胍可以极大极快地抑制RNase的活性，能从胰腺等富含RNase 的组织细胞中分离出完整的RNA分子，目前已成为常规使用的试剂。（1）（异）硫氰酸胍-酚氯仿一步法 是经典的一步法。以含4mmol/L的（异） 硫氰酸胍与0.1mmol/L的-巯基乙醇的变性溶液裂解细胞，然后在pH4.0的酸性条件下，用酚/氯仿抽提裂解溶液，最后通过异丙醇沉淀与75%的乙醇洗涤来制备RNA。 主要用于从培养细胞和大多数动物组织中分离纯化总RNA。（2）可同时制备RNA、DNA与蛋白质的一步法 以（异）硫氰酸胍-酚的单相裂解试剂裂解细胞，然后加入氯仿后形成两相。变性的DNA与蛋白质位于两相的界面，保留于上层水相的RNA在RNA沉淀溶液中通过异丙醇沉淀与75%的乙醇洗涤进行制备。 该法制备的RNA样品极少有多糖与蛋白多糖的污染，可用于mRNA的纯化、Northern杂交、逆转录和RT-PCR反应等。 处于界面的DNA与蛋白质可通过乙醇和异丙醇分别分级沉淀出来。该法制备的DNA，大小约为20kb，可作PCR反应的模板，蛋白质样品则主要用于免疫印迹。 3. mRNA的分离与纯化（1）oligo(dT)-纤维素柱层析法 它是以oligo(dT)-纤维素填充层析柱，加入待分离的总RNA样品，其中poly(A)+RNA在高盐条件下，通过碱基互补，与oligo(dT)-纤维素形成稳定的RNADNA杂交体，洗去未结合的其它RNA， 然后在低盐缓冲液中洗脱并回收poly(A)+RNA。 从哺乳动物细胞提取大量的非放射性RNA 时，oligo(dT)-纤维素柱层析法是首选方法，回收的poly(A)+RNA量可达总RNA的1%10%。但该法分离速度慢，易阻塞， 不适合同时对多个标本的处理，而且很难回收全部的poly(A)+RNA，故不适合对少量RNA样品的分离。（2）oligo(dT)-纤维素液相结合离心法 原理与oligo(dT)-纤维素柱层析法完全相同，只是不经填柱，而是直接将oligo(dT)-纤维素加入到一系列含不同RNA样品的微量离心管中，通过离心收集吸附有poly(A)+RNA的oligo(dT)-纤维素，经漂洗后，用含70%的乙醇洗脱液将吸附的poly(A)+RNA从oligo(dT)-纤维素上洗脱并沉淀出来。 该法可同时批量处理多个样品，而且能从少量的RNA样品中分离出poly(A)+RNA。用本法分离poly(A)+RNA时，应选用等级较高的oligo(dT)-纤维素，如oligo(dT)18-30纤维素，而一般的柱层析填充的是oligo(dT)12-18纤维素。（3）磁珠分离法 是利用oligo(dT)与poly(A)互补配对的特性，用生物素标记oligo(dT)，通过它与mRNA3末端poly(A)的退火形成杂交体，然后用标有亲和素的顺磁球珠和磁性分离架捕获并洗涤生物素oligo(dT)/mRNA杂交体，最后用无RNase的去离子水将之洗脱下来，达到从总RNA中分离mRNA的目的。1.总RNA中的poly(A) +RNA分子退火形成杂交体2.链亲和素标记的磁珠3.生物素与链亲和素的特异性结合4.磁性分离5.洗涤与洗脱6.水相(含纯化的mRNA) 固相7.生物素标记的oligo(dT) 8.磁铁磁珠分离法纯化poly(A) +RNA的原理 该方法可对poly(A)+RNA进行高效、灵敏、快速的分离。其产量甚至比常规的oligo(dT)-纤维素柱层析法还高，且分离的poly(A)+RNA能用于几乎所有的分子生物学实验。但它对组织或细胞的最大处理量每次不超过1克，而且磁珠很贵并需要专门的磁性分离架。四、核酸的浓缩、沉淀与洗涤 沉淀是核酸浓缩最常用的方法，其优点在于核酸沉淀后，可以很容易地改变溶解缓冲液和调整核酸溶液至所需浓度；另外，核酸沉淀还能去除部分杂质与某些盐离子，有一定的纯化作用。 加入一定浓度的盐类后，用有机溶剂沉淀核酸。其中常用的盐类有醋酸钠、醋酸钾、醋酸铵、氯化钠及氯化镁等，常用的有机溶剂则有乙醇、异丙醇和聚乙二醇。 核酸沉淀往往含有少量共沉淀的盐，需用70%75%的乙醇洗涤去除。对于浓度低并且体积较大的核酸样品，可在有机溶剂沉淀前，采用固体的聚乙二醇或丁醇对其进行浓缩处理。五、核酸的鉴定和保存（一）核酸的鉴定1浓度鉴定（1）紫外分光光度法OD260=1.0相当于 50g/ml双链DNA 40g/ml单链DNA（或RNA） 20g/ml寡核苷酸紫外分光光度法：测定DNA在A260nm的光吸收值。如计算DNA浓度A260稀释倍数50 g/ml (A值等于1时，相当于50g/ml双链DNA， 40g/ml单链DNA 或RNA，20 g/ml单链寡核苷酸） 这种方法只用于测定浓度大于0.25g/ml的核酸溶液。（2）荧光光度法 核酸的荧光染料溴化乙锭（EB）嵌入核酸分子的碱基平面后，使本身无荧光的核酸在紫外线激发下发出橙红色的荧光，且荧光强度与核酸含量呈正比。该法灵敏度可达1ng5ng，适合低浓度核酸溶液的定量分析。2纯度鉴定（1）紫外分光光度法 主要通过A260与A280的比值来判定有无蛋白质的污染。 在TE缓冲液中，纯DNA样品A260/A280比值为1.8，纯RNA样品A260/A280比值为2.0。比值升高与降低均表示不纯。 蛋白质与核酸提取中加入的酚均使比值下降。蛋白质的紫外吸收峰在280nm与酚在270nm的高吸收峰可以鉴别主要是蛋白质的污染还是酚的污染。 RNA的污染可致DNA制品的比值高于1.8，故比值为1.8的DNA溶液不一定为纯的DNA溶液，可能兼有蛋白质、酚与RNA的污染，需结合其它方法加以鉴定。 A260/A280的比值是衡量蛋白质污染程度的一个良好指标，2.0是高质量RNA的标志。但要注意，由于受RNA二级结构不同的影响，其读数可能会有一些波动，一般在1.82.1之间都是可以接受的。（2）荧光光度法 用溴化乙锭等荧光染料示踪的核酸电泳结果可用于判定核酸的纯度。 由于DNA分子较RNA大许多，电泳迁移率低；而RNA中以rRNA最多，占到80%85%，tRNA及核内小分子RNA 占15%20%，mRNA占1%5