分子生物学实验讲义2010.doc

实验一 植物DNA提取一、实验目的了解植物DNA提取和纯化的一般方法和基本原理。二、实验材料及设备1、材料 新鲜的小麦叶片或保存于-80冰箱的小麦叶片2、仪器水浴锅 离心机 冰箱 移液枪 液氮罐 研钵（研棒，药勺）3、耗材2ml Eppendorf管 枪头（灭菌后使用） 吸水纸三、主要试剂液氮 DNA提取液 氯仿/异戊醇（24：1） 乙醇 TEDNA提取液（100ml）： 1mol/l Tris-HCl pH8.0 10ml（pH7.8-8.0） 0.5mol/l EDTA pH8.0 10ml 5mol/l NaCl 10ml10% SDS 12.4ml 偏重Na2SO3 0.38gdd H2O 0.5mol/l EDTA（500ml）： EDTA Na2 93.05g NaOH 10g d H2O充分溶解后调pH至8.0。1mol/l Tris-HCl（1000ml）：Tris-HCl 121.1g浓HCl 49ml d H2O充分溶解后调pH至8.0。TE（100ml）： 1mol/l Tris-HCl pH8.0 1ml 0.5mol/l EDTA pH8.0 0.2ml四、操作步骤1. 将研钵洗净干燥，倒入液氮预冷。2. 取适量（0.6g）左右新鲜叶片，加入液氮充分研磨后放入加有0.8ml提取液的离心管。3. 颠倒混匀，65温育0.5小时，期间摇动一次。4. 冷却5至室温加入适量（0.9ml）氯仿/异戊醇（24：1）用力摇匀后，放置5分钟左右。5. 平衡后，13000rpm离心10分钟。6. 转移上清液至一新管，加等体积氯仿/异戊醇（24：1）用力摇匀后，13000rpm离心10分钟。7. 将上清转移至一新管，加入2倍预冷的酒精，翻转7-8次，室温放置20分钟。8. 用枪头挑取DNA至一新管。加0.9ml 70%酒精，翻转几次。倒掉酒精，再洗1次。9. 倒尽乙醇，用纸吸干DNA，加适量（50ul）TE溶解（65度10分钟），-20贮藏待用。五、思考题描述你所得到的DNA的外观；谈谈本次实验中的得和失，还有哪些需要改进的地方？本实验用到的主要试剂有哪些？它们的作用是什么？实验二 DNA的酶切与电泳一、实验目的了解限制性核酸内切酶的原理，掌握DNA电泳和酶切的方法。二、实验材料及设备1、材料小麦叶片DNA2、仪器离心机 移液枪 电泳仪 电泳槽 凝胶成像系统 制冰机 恒温箱3、耗材0.5ml离心管（灭菌后使用） 枪头三、主要试剂EcoR I及其酶切缓冲液琼脂糖凝胶电泳上样缓冲液及电泳缓冲液四、实验步骤1. 在0.5ml Eppendorf管中，加入 4ul DNA，2ul 内切酶Buffer，2ul EcoRI，加水定容至20ul。2. 混匀后，放入37恒温箱1小时。3. 取100mL 1TAE在三角瓶中配制1%的琼脂糖凝胶。在微波炉中将溶液煮沸，待冷却至60-70时，加6ul染色剂，倒入两头封好并插入梳子的胶板内。4. 在电泳槽内倒入适量1TAE。胶凝固后小心拔出梳子。5取全部样品上样电泳。6按学号顺序将样品点入点样孔。100V（恒压）电泳40分钟。7. 电泳结束后，关掉电泳仪，拔出导线。8. 在凝胶成像系统中记录观测记录电泳结果。五、主要试剂配方6上样缓冲液： 0.25%溴酚蓝 40%蔗糖50TAE（1L）： 242g Tris碱57.1 ml冰乙酸100ml 0.5mol/L EDTA (pH8.0)六、思考题观察酶切后DNA图谱并解释原因。实验三 感受态细胞的制备及转化一、目的掌握用CaCl2制备感受态细胞的方法。二、材料及设备1、材料 保存于-80冰箱的DH5或DH10B甘油菌2、仪器恒温摇床 冷冻离心机 移液枪一套 制冰机 水浴锅3、器材离心管 50mL4个（非常洁净，灭菌）三角瓶 500mL4个（非常洁净，灭菌）Eppendorf管 1.5mL若干（灭菌后使用） 三、试剂1、LB培养基（灭菌后使用）胰蛋白胨（bacto-tryptone） 10g/L酵母提取液（bacto-yeast extract） 5 g/LNaCl 10g/L用NaOH调pH至7.0。2、 0.1M CaCl2（灭菌后使用）3、 0.1M CaCl2+15%甘油（灭菌后使用）四、操作步骤1、细菌培养1） 从平板上挑取大肠杆菌（DH5或DH10B）单菌落，放到LB培养基中。2） 在37，220 rpm培养10h左右。3） 从中吸取1 mL培养液到装有100 mL LB培养基的三角瓶中，37，220 rpm培养2-3hrs，使其OD600达0.3-0.6。2、细菌收集将培养液倒入预冷的50 mL离心管中，置于冰上30-40min。4000 rpm，4 度，离心5min。3、感受态制备1） 倒弃上清后，加入15mL预冷的0.1M CaCl2，悬浮菌体，冰上放置30 min。2） 4000rpm离心5min，弃上清，加入15 ml 0.1M CaCl2悬浮菌体。3） 4000rpm离心5min，加1.5mL0.1M CaCl2 悬浮细胞。冰浴3小时后使用。冰上放到第二天上午也可使用。4、感受态保存将上述感受态细胞分装于1.5 mL Eppendorf管中（100ul/管），加15%甘油，液氮速冻后置于-70贮存备用。5、转化在1.5mL试管中加100ul感受态细胞和13 ul质粒，混匀，冰上放置25分钟。42度热击90秒，迅速放到冰上15分钟，取20ul涂布于LB+Amp平板上。37度过夜培养。实验四 质粒提取与电泳一、目的掌握用质粒提取试剂盒提取质粒的方法。二、材料及设备1. 材料 保存于4冰箱的菌落2. 仪器恒温摇床 冷冻离心机 制冰机 移液枪一套 电泳仪、电泳槽 涡旋仪3. 器材1.5-2.0 mL Eppendorf管、吸头（灭菌后使用）三、主要试剂1. LB（+Amp）培养基LB液体培养基内加入100g/mL的氨苄青霉素2. 质粒抽提试剂盒四、操作步骤1. 挑单菌落接种到1mL含有氨苄青霉素的培养基中37振荡过夜培养。2 将上面1mL菌液接种到100mL LB培养基中37振荡过夜培养。3 按照质粒提取试剂盒的方法提取质粒。4 质粒电泳。取2L质粒电泳。5 凝胶成像系统观察拍照。五、作业碱裂解法提质粒方法中solution I,II,III的成分有哪些？如何判断质粒提取质量的优劣？实验五 质粒PCR一、目的掌握PCR的原理、PCR仪的使用、反应体系的组成及PCR结果检测。二、实验材料及设备1、材料 保存于4冰箱的质粒溶液2、仪器PCR仪，离心机，移液枪，电泳仪及电泳槽，紫外观测仪，制冰机3、器材Eppendorf管 0.5ml，0.2ml若干（灭菌后使用） 三、试剂10PCR Buffer，25 mM MgCl2，2.5 mM dNTP，Taq DNA聚合酶（5U/l），dd H2OM13引物，电泳上样缓冲液及电泳缓冲液，琼脂糖凝胶，核酸染色液四、操作步骤1、反应液的配制在0.2ml Eppendorf管中加入0.5l质粒，再加入以下反应混合液： M13(F) 1l (10M) M13(R) 1l (10M) 10PCR Buffer 2.5l dNTP 2l MgCl2 1.5l Taq酶 0.2l加水使反应体系调至25l。简单离心混匀。2、PCR反应将Eppendorf管放入PCR仪，盖好盖子，调好扩增条件。扩增条件为： 95 3 min 94 45sec 55 50sec 25 cycles 72 1.5min 72 7 min10 for ever3、PCR 产物的电泳检测在PCR管中加5l上样缓冲液，混匀。取10l, 1%的琼脂糖凝胶中电泳30min。在紫外灯下检测扩增结果。. 实验六 植物总RNA的提取与分析一、目的掌握RNA提取的方法，及操作RNA过程中需注意的事项。二、实验材料及设备1材料 小麦叶片，储存于70冰箱中备用。2仪器冷冻离心机， 70冰箱， 恒温水浴锅， 涡旋仪3器材吸嘴（灭菌）， 可调微量取样器， 一次性手套， 塑料离心管,四、主要试剂RNA 提取液：TrizoL试剂；乙醇；氯仿, 异戊醇；DEPC（二乙焦碳酸盐）处理水（DEPC有毒，操作时必须带一次性手套）为了灭活RNase，RNA提取中所用的溶液除含Tris外，均用0.1% DEPC处理并高压灭菌，含Tris的溶液用经高压灭菌的DEPC 水直接配制，玻璃器皿则于 160干热灭菌 6 h以上，塑料离心管、吸嘴、牙签、镊子和玻璃棒等均用DEPC 水浸泡过夜后高压灭菌，次日用ddH2O清洗待用，同时还应该常换一次性手套，忌操作时说话。五、实验步骤1、将研钵洗净干燥，倒入液氮预冷。在1.5ML管内加入600ulTrizoL2、取适量叶片，加入液氮充分研磨后放入加有600ulTrizoL的离心管。3、颠倒混匀，室温放置5分钟。4、加入适量（0.5ml）氯仿/异戊醇（24：1）用力摇匀后，放置5分钟左右。5、12000rpm，4度离心10分钟。6、转移上清液至一新管,加入与上清等体积的异丙醇，颠倒几次摇匀。室温静置10分钟。12000rpm，4度离心10分钟，弃上清。7、70%酒精洗涤2次。8、倒尽乙醇，吹干，加适量（40ul）DEPC处理的水或TE溶解，-20贮藏待用。9、取5 ul琼脂糖凝胶电泳30min。实验七 RNA电泳分析一、目的掌握RNA纯度检测的方法，注意避免RNA电泳中RNA的降解。二、实验材料及设备1材料 储存于20冰箱中的RNA。2仪器电泳仪、电泳槽 紫外分光光度计3器材吸嘴（灭菌）， 可调微量取样器， 一次性手套， 塑料离心管等三、实验步骤1. 将电泳所用到的电泳仪、电泳槽、梳子等用NaOH溶液浸泡后，再用ddH2O冲洗。2用DEP