生物酶法制备生物柴油.doc

生物酶法制备生物柴油摘要：石油资源日益匮乏，生物柴油已经成为国际新能源研究的热点。生产方法以及生产原料成为生物柴油发展的两大瓶颈。生物柴油主要是以动植物油为原料，通过酯交换反应而制备的长链脂肪酸酯类物质。目前生物柴油的生产工艺主要有化学法和生物酶法。化学法是当前的主流工艺，但存在能耗高、工艺复杂、醇消耗量大、环境污染等缺点。生物酶法具有对原料中脂肪酸和水含量要求低、工艺简单、反应条件温和、选择性高、醇用量小、副产物少、生成的甘油容易回收且无需进行废液处理等优点,因而被认为是取代化学法生产生物柴油的绿色工艺。生物酶法包括游离脂肪酶催化法、离子液体脂肪酶催化法、固定化脂肪酶催化法和细胞内脂肪酶催化法等。全细胞酶法弥补了脂肪酶的生产成本高、使用寿命短、易失活等不足，节省了设备和运行维护费用，成为了未来生物柴油制备的发展方向。收集餐饮废油和工业废油脂，发展高油作物和工程微藻，以此为原料生产生物柴油能够显著降低原料成本。改进传统生物柴油生产工艺，加快脂肪酶酯化工艺的研发，开发原料适应性广、酯化效率高、连续化、自动化程度高的环保经济新工艺，是目前生物柴油产业发展的核心。关键词：生物柴油；生物酶法；全细胞酶法 1、 生物柴油及其利用现状生物柴油(Biodiesel)是指以植物、动物油脂等可再生生物资源生产的可用于压燃式发动机的清洁替代燃油。生物的柴油的制备过程是通过酯交换反应进行的，酯交换法是指通过酯基转移作用将高粘度的植物油或动物油脂转化成低粘度的脂肪酸酯，该过程需要一定的催化剂才能进行。生物柴油作为可再生清洁能源，具有优良的环保特性，无芳烃，含硫低，含氧高，可达11%，十六烷值高，燃烧性能好，润滑性好，闪点高，运输和使用安全等优点。因此，利用生物柴油作为新能源替代传统柴油，在环保和能源领域都有着非常深远的意义。随着石油资源的日益匮乏，原油价格的不断攀升，生物柴油的优势尤为凸显，被国际可再生能源界誉为最具发展前景的替代油品，生物柴油的研究也已经成为国际新能源研究的热点。图1所示为2003年至2008年全球生物柴油生产能力及实际产量。图 1 2003年至2008年全球生物柴油生产能力及实际产量欧盟无疑是全球生物柴油生产的领跑者，2007年欧盟的生物柴油产量为 570 万吨，年增长率为16%；2008 年为 780 万吨，年增长率为 35%；2009年则超过了 900 万吨，年增长率为 16.6%。2009年欧盟生物柴油产量居前4位的国家分别是德国、法国、西班牙和意大利。美国是世界上最大的石油消耗国，也是世界上最早研究生物柴油的国家之一，其生物柴油产量在2005年翻了2翻,2006年又翻了2翻,2007年翻了1翻，达到140万吨/年。美国能源署正在大力推广使用生物柴油，要求到2010年，美国的生物柴油产量将达到1200万吨。中国是仅次于美国的全球第二大石油消费国，对海外石油的依赖程度越来越大。面对经济高速发展、环境保护和能源消耗的巨大压力，我国“十五”计划发展纲要把发展生物液体燃料确定为国家产业发展方向。我国生物柴油行业到2007年底年产能超过300万吨，据不完全统计，现有产能1万吨及以上的生物柴油企业有26家。预计到2020年，我国柴油消费量将约2006年的1.8倍，按生物柴油的替代比例2%计算，生物柴油的年需求量将达到420万吨，可见，我国生物柴油市场前景非常广阔，大力发展生物柴油对我国经济的可持续发展具有重要意义。2、生物柴油原料生物柴油的生产中，原料成本占总成本的70%左右，是决定生物柴油价格的主要因素，已成为生物柴油生产企业的利润制约点。生产生物柴油需要油脂和低级醇两种原料，油脂主要来源于动物和植物。动物脂肪如猪油、牛油、鸡油及鱼油已用于生物柴油制备的研究，但生物柴油生产所用的油脂主要来自植物，许多食用及非食用植物油如大豆油、菜籽油、葵花籽油、棕榈油、橄榄油、棉籽油、亚麻籽油、蓖麻油、麻风树油和桐油已用于生物柴油生产。为了减少对食用植物油的依赖，废弃烹调油、微生物油和微藻油也已用于制造生物柴油。由于国情不同，各国生产生物柴油使用的油脂原料也有差别，美国主要用转基因大豆油生产生物柴油，欧盟和加拿大生物柴油生产的主要原料是菜籽油，巴西主要用葵花籽油和棕榈油制造生物柴油，东南亚国家马来西亚和印度尼西亚生产生物柴油则主要用棕榈油为原料，中国用废弃烹调油或非食用植物油如麻风树油作为生物柴油的原料则更现实。用于生物柴油生产的低级醇包括甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、2-丁醇和异丁醇，醇的分子量越大，密度越大，沸点也越高，通常脂肪酶催化转酯反应的速率随醇的碳链长度而增加。上述低级醇中甲醇和乙醇的产量最大，价格也最便宜，所以工业上生物柴油生产主要用甲醇和乙醇作为酯酰基的受体。但相较于其它脂醇，甲醇和乙醇对脂肪酶的毒性更强。由于价格便宜，大多数国家用甲醇生产生物柴油，但巴西乙醇的价格低于甲醇，所以巴西生产生物柴油时用乙醇为原料。由于甲醇生产以天然气为主要原料，而乙醇则通过微生物发酵生产，所以巴西以乙醇为原料生产的生物柴油是真正意义上的“绿色可再生”燃料。3、 生物柴油生产技术生物柴油发展至今，国内外很多学者对其合成方法做了大量的研究和探索，使其生产技术基本成熟。目前工业生产生物柴油主要应用酯交换法，在工业中规模化应用的酯交换方法是液体碱催化法(NaOH、KOH等)和液体酸催化法（盐酸、硫酸、磷酸等），但是这两种方法都存在较大缺陷：对反应原料要求高、副产物多、产物后处理工艺复杂、设备腐蚀严重以及污水排放量大等缺点。因此，许多研究者在不断探索中得出了一些更环保、更经济、更有效的生物柴油生产技术，主要包括超临界法、化学固体催化法、生物酶催化法、离子液体催化法、膜反应法、超声波辅助法、微波辅助法等。本文就生物酶催化法进行了概述。表1对几种生物柴油的制备方法的优缺点进行了总结。表1 几种生物柴油的制备方法总结制备方法优点缺点碱催化法催化效率高，腐蚀作用比酸小，反应速度比酸快，成本较低对反应物纯度以及水浓度非常敏感，甲醇用量大酸催化法适用于游离脂肪酸和水含量高的油脂，酯产率高反应速度慢，腐蚀性强，产物不易分离固体酸或碱催化法反应活性高，选择性好，易分离，可循环使用，腐蚀性小，转化率高制备繁琐，成本高，使用周期短超临界法污染小，反应速率快，反应时间短，后处理简单，无需原料预处理反应条件苛刻，设备成本高膜反应法反应物的转化率高，产物收率高原料混合不充分超声波辅助法加速反应，提高了催化活力和生物柴油产率生产能力偏小微波辅助法操作简单，产率高，产品易纯化反应器制造水平低，反应机理研究滞后离子液体法腐蚀小，后处理容易，可重复使用，过程清洁甲醇用量大，生产成本高生物酶法工艺简单,反应条件温和,选择性高,醇用量小,副产物少脂肪酶价格昂贵,使用寿命短，反应时间长4、 生物酶法合成生物柴油生物酶法是一类重要的生物柴油生产新方法，近年来越来越受到人们的重视，国内外研究人员在这方面做了大量的工作。本文主要阐述了细胞内脂肪酶和细胞外脂肪酶技术在生产生物柴油上的进展，并对其中存在的一些问题提供了相应的解决措施，对生物酶法生产生物柴油技术发展提出了建议。生物酶法合成生物柴油技术是指用脂肪酶催化油脂原料与低碳醇间的进行的酯交换反应,制备相应的脂肪酸单酯。此法具有对原料中脂肪酸和水含量要求低、工艺简单、反应条件温和、选择性高、醇用量小、副产物少、生成的甘油容易回收且无需进行废液处理等优点，且此过程还能进一步合成其他一些高价值的产品,包括可生物降解的润滑剂以及用于燃料和润滑剂的添加剂。生物酶法合成生物柴油的工艺流程如图2图2 生物酶法合成生物柴油的工艺流程4.1 脂肪酶简介脂肪酶（酰基甘油水解酶，E.C. 3.1.1.3）是一种广泛分布于动物、植物和微生物中的酶，能够进行可逆的甘油酯键水解，也能够进行甘油酯合成。在一定的条件下，脂肪酶也能够催化许多酯化反应。微生物来源的脂肪酶种类较多、生产方便和酶活较高,在生物柴油生产中应用较多。微生物脂肪酶主要分为细菌类脂肪酶和真菌类脂肪酶。细菌类脂肪酶主要有单假胞菌脂肪酶;霉菌类脂肪酶主要有根霉脂肪酶、毛霉菌脂肪酶、镰刀霉脂肪酶、青霉菌脂肪酶、假丝酵母脂肪酶、隐球酵母脂肪酶等。不同的脂肪酶在催化生产生物柴油的反应过程中表现出的反应活性和催化特性不同。无论在小规模的还是工业规模的酯合成中，作为催化剂，脂肪酶已经得到成功应用。4.2 细胞外脂肪酶催化合成生物柴油细胞外脂肪酶催化法主要包括游离脂肪酶催化法和固定化脂肪酶催化法。4.2.1 游离脂肪酶催化法游离脂肪酶催化法是脂肪酶游离在溶剂介质中，催化合成生物柴油的方法，溶剂主要分为传统溶剂（水、有机溶剂）和新型离子液体。4.2.1.1 传统溶剂脂肪酶催化法脂肪酶催化酯交换反应生产生物柴油，最初是脂肪酶游离在水或有机溶剂介质中进行的。Kamini等利用脂肪酶在以水为介质的反应液中催化米糠油醇解，反应结束后反应液中甲酯的质量分数达到了80.2%。P.v.Lara，E.YPark研究了有机溶剂系统中，脂肪酶催化吸附在活性白土中的植物油来制备生物柴油，用从Candida cylindracea中提取的酶，在正己烷溶剂中，催化植物油制备生物柴油，开始反应的4 h中，得到了超过78%的短链脂肪酸甲酯。游离脂肪酶虽然对酯交换反应具有催化活性高和选择性好等优点，但其价格昂贵，限制了其在工业化生产中的应用。游离脂肪酶分离困难，难以循环使用，重复利用性不好。游离脂肪酶在有机溶剂中不易分散，导致其催化效率较低。解决这些问题的方法：对脂肪酶进行修饰、印记和交联处理，能够提高酶的活性和对应体选择性；对酶进行固定化处理，能够提高酶的稳定性, 便于回收利用, 将酶固定在恰当载体上,还可提高酶催化效率；以全细胞生物催化剂的形式来利用脂肪酶，可以实现酶的长期使用，有望降低工艺成本。4.2.1.2 新型离子液体溶剂脂肪酶催化法离子液体是在室温或室温附近下完全由离子组成的液体物质，具有无臭、无味、不易燃烧、易分离、易回收、可循环使用、良好的热稳定性和化学稳定性等优点。在催化反应中用离子液体取代传统有机溶剂，可提高反应速率，简化产物分离，同时也避免了传统有机溶剂使用造成严重的环境污染以及设备腐蚀等问题，是真正意义上可设计的环境友好型绿色溶剂和液体催化剂，近年来，广受人们的关注。 JAINN等研究发现，离子液体在生物催化反应中能为酶提供稳定适宜的环境，酶在离子液体中能够维持自身的催化活性，并且酶催化反应在这种非水性环境下能够较好的进行。西北大学的王贵军研究了脂肪酶在BMIMPF6离子液体中催化桐油制备生物柴油，得出了优化的实验条件：醇油比为3:1，加酶量为油重的15%，反应温度为45 ，反应时间为24 h，实际酯转化率为76.3%。并且对比了有机溶剂体系发现，以BMIMPF6为溶剂的反应体系中，脂肪酶经过6次重复使用，酯转化率仍维持在50%以上，而在正己烷有机溶剂的体系中，脂肪酶催化的酯转化率已降到40%以下。表明了脂肪酶在BMIMPF6离子液体中具有更好的稳定性。离子液体作为一种新型的环境友好溶剂，在生物催化反应中能更好的保持脂肪酶的稳定性和催化活性，弥补了传统溶剂的不足，在生物柴油的制备中具有良好的应用前景。4.2.2 固定化脂肪酶催化法固定化脂肪酶在保持其高效、专一及温和催化反应特性同时，还具有稳定性高、容易回收、可多次重复使用、操作连续及可控、工艺简便等一系列优点，降低了酶法合成生物柴油的成本，可有效促进酶法合成生物柴油在工业规模生产中的应用。表2对几种常用的固定化酶的制备方法进行了总结。表2 几种常用的固定化酶的方法方法概念优点缺点吸附法物理吸附法：酶被载体吸附而固定的方法酶活力部位及其空间构象不易被破坏酶附着在载体上,易于脱落离子吸附法：将酶与含有离子交换基团的水不溶性载体以静电作用力相结合的固定化方法处理条件温和, 酶活力部位的氨基酸残基不易被破坏载体和酶的结合力比较弱,容易受缓冲液种类或pH 的影响,在离子强度高的条件下进行反应时,酶往往会从载体上脱落交联法用双功能试剂或多功能试剂进行酶分子之间的交联,使酶分子和双功能试剂或多功能试剂之间形成共价键,得到三向德交联网状结构,除了酶分子之间发生交联外,还存在一定的分子内交联酶之间连接牢固, 具有良好的稳定性及重复使用性难以控制反应条件, 反应剧烈时引起酶蛋白的高级结构发生变化,并导致活性中心受到破坏，交联剂价格昂贵共价结合法酶蛋白分子上功能团和固相支持物表面上的反应基团之间形成化学共价键连接, 以固定酶的方法酶与载体间连接牢固, 不易发生酶脱落, 有良好的稳性及重复使用性反应条件比较苛刻，常常会引起酶蛋白高级结构发生改变，导致酶的活性中心受损包埋法将聚合物的单体与酶溶液混合，再借助于聚合助进剂的作用进行聚合，酶被包埋在聚合物中以达到固定化一般不需要与酶蛋白的氨基酸残基进行结合反应，很少改变酶的空间构象，酶活回收率较高，可以应用于许多酶的固定化不适用于高分子量底物的传质，不适用于柱反应系统,且常有扩散限制等问题国内外科研工作者通过选择不同固定化脂肪酶制备生物柴油，进行了大量的研究。Mamoru Iso等研究发现，在相同的条件下，采用固定化Pseudomonas fluorescens脂肪酶催化甘油三酯与乙醇反应制备生物柴油，10 h后反应基本完成，而采用游离脂肪酶作催化剂，反应25 h后，反应物产率只有90。周丽亚等利用固定化脂肪酶Novozym435催化废餐饮油与乙酸甲酯反应制备生物柴油，得出最佳工艺条件：废餐饮油2.0 g，固定化脂肪酶Novozym435用量为油重的8.0%，乙酸甲酯与废餐饮油摩尔比为10：1，反应温度为60，反应时间为18 h，有机碱三羟甲基氨基甲烷用量为油重的40.0%，有机溶剂叔丁醇用量为0.5 mL。在此条件下生物柴油得率为86.43%。对酯化所得生物柴油的部分理化性能进行测试，结果表明基本符合美国生物柴油质量标准和我国-50#轻柴油标准，具有良好的柴油机燃烧特性。Oznur等在无任何溶剂的体系中，研究了固定化脂肪酶Novozym435催化棉籽油的醇解反应。在温度为50 ，酶的质量为油质量的30%，油与醇的摩尔比为1:4的条件下，反应7 h，反应液中甲酯质量分数最大能达91.5%。邓利等以硅藻土为载体，吸附法制备固定化脂肪酶，用固定化脂肪酶催化油酸和甲醇溶液制备生物柴油，并找出酯化工艺的最佳条件：石油醚体系，5(wt)固定化脂肪酶，温度为40 ，油酸和甲醇摩尔比为1：1.4，低碳醇分两次等摩尔流加，在反应过程中加入硅胶吸水剂，反应时间为24 h，酯化率可以达到92。试验结果还表明，脂肪酸和低碳醇的碳原子数越多，酯化率越高。固定化脂肪酶虽然弥补了游离脂肪酶的一些缺陷，但其自身也存在不足：（1）甲醇的影响。甲醇等短链醇易使脂肪酶变性失活，对催化作用有很强的抑制作用。解决方法：分批加入甲醇或者乙酸甲酯代替甲醇作为酰基受体。（2）水分的影响。水分过多破坏酶的微环境导致酶活性和稳定性的下降。影响酶的催化效率。解决方法：加入吸水剂除去过量的水分。（3）副产物甘油的影响。甘油在固定化脂肪酶的亲水性载体表面积累,抑制反应物向酶表面的扩散,从而降低甲酯的收率。解决方法：利用硅胶等吸水剂除去生成的甘油。（4）溶剂的影响。对比无溶剂体系，发现反应体系中加入溶剂后，反应底物的浓度降低，与酶接触的表面积增大，酯化率明显提高。不同溶剂对脂肪酶酯化反应的影响主要是由于溶剂的疏水性的不同引起的。疏水性越强，脂肪酶的活性越高，酯化效果越好。从经济角度考虑选用石油醚较为合适。4.3 细胞内脂肪酶催化合成生物柴油细胞内脂肪酶催化是指固定化全细胞酶催化。固定化脂肪酶在生产过程中的提取、纯化和固定化等繁琐的工序中，会使大量酶损失和失活，增加了酶的生产成本，限制了其作为催化剂在工业生产中的应用。目前降低酶法催化剂成本的最有前景的方法之一是以全细胞生物催化剂的形式来利用脂肪酶，这是因为全细胞脂肪酶作为一种特殊形式的固定化酶可以免去上述工序而直接利用，有望降低生物柴油的生产成本。贺芹等研究发现华根霉全细胞脂肪酶在无溶剂以及有机溶剂体系中均可以有效地催化合成生物柴油。在无溶剂体系中最佳工艺条件为：甲醇分3次等量加入、总醇/油摩尔比为3:1、含水量2.0、反应温度30 、加酶量8.0。在此反应条件下，脂肪酸甲酯最高收率可达86.0以上，当甲醇过量时脂肪酸甲酯收率最高可达93.0。在有机溶剂体系中，以正庚烷为助溶剂时，脂肪酸甲酯的最高收率为86.7。研究结果表明，利用廉价的华根霉全细胞脂肪酶在无溶剂体系中合成生物柴油具有成本低、底物用量少、对原料要求低、环境友好和反应条件温和(常压，较低的温度，无须强酸和强碱)等优点，有很好的工业应用前景。Ban等研究了将米根霉IFO4697细胞固定于载体上，直接催化大豆油生产生物柴油，为了增强固定化细胞的转酯化活性，在培养时添加相关底物，加入橄榄油和油酸的作用比较显著，但不能含有葡萄糖。固定化细胞用有机溶剂处理，但较未处理的细胞均未表现出更高的活性。在反应体系含水质量分数为15%和分步添加甲醇的条件下，反应液中甲酯的质量分数达90.0%，达到了用胞外酶催化的水平。Hama等首次报道利用重组真菌全细胞酶法合成生物柴油。将异孢镰刀菌中的异种脂肪酶编码基因重组到米曲霉上,形成重组异孢镰刀菌脂肪酶(FHL),得到的米曲霉作为全细胞酶催化脂肪酸酯的合成。添加5%的水可有效抑制甲醇对酶的毒害并利于酰基转化反应,脂肪酸甲酯产率达到94%,可重复使用10次。对比试验表明,重组米曲霉较米根霉稳定性高,催化活性强,这种重组真菌全细胞催化剂有望应用于生物柴油的工业化生产中。 全细胞酶催化存在的问题：全细胞酶的催化活性和稳定性分别受细胞膜的通透性和刚性的影响。在脂肪酶不泄漏到胞外的情况下,反应底物需要通过细胞壁进入细胞内与酶结合,因此细胞的通透性是影响传质阻力的主要因素。细胞重组技术可以改善细胞膜的通透性，但操作比较复杂，通过改变培养液中脂肪酸的中脂肪酸种类和含量来控制细胞膜的脂肪酸组成和不饱和度，可以得到细胞膜通透性和刚性都较好的霉菌细胞催化剂。在生物酶法合成生物柴油技术中，固定化全细胞酶克服前面两种方法的不足，在工业化生产中更具应用潜力，是未来生物柴油制备的发展方向。5、前景展望发展生物柴油对生态环境的保护、国家能源安全的保障和国民经济的可持续发展都具有十分重要的意义。生物酶法是一种非常有潜力的环境友好的生物柴油的生产方法，但是脂肪酶的生产成本高、易失活、使用寿命短，原料价格昂贵和酯化工艺水平较低等缺点成为制约其工业化的瓶颈。全细胞酶法弥补了脂肪酶的生产成本高，使用寿命短，易失活等不足