肿瘤个体化通路多靶标检测.doc

多通路靶标并行检测-肿瘤个体化治疗的必经之路随着人类基因组学、药物基因组学及肿瘤分子生物学研究的不断深入和发展，人们对肿瘤多成因、异质性的特点有了更加全面的认识。国际肿瘤基因组计划揭示了相同分型分期的肿瘤患者之间携带的变异基因是不同的。少部分患者的肿瘤由单一基因变异驱动，只要针对该变异基因进行相关的靶向治疗即可有效控制病情。譬如仅携带BCR-ABL融合基因的慢性粒细胞白血病患者，使用BCR-ABL融合基因抑制剂伊马替尼治疗能获得高缓解率和长生存期。但是，更多患者的肿瘤则由多基因变异共同驱动，如同时携带EGFR E19和E20突变的患者就不能从EGFR TKI治疗中获益，而且此类患者的肿瘤易发生多发耐药。此外，大量的研究还发现，肿瘤的基因状态还会随病情进展不断变异，转移灶/复发灶的基因状态并不完全同于原发灶。肿瘤治疗在经历了局部治疗时代和化疗时代后，正逐步走向强调系统治疗的个体化治疗时代。随着肿瘤基因组计划的深入展开，肿瘤患者的个体差异将被全面揭示。同时，大量靶向药物获得批准进入临床运用加速了肿瘤个体化治疗前进的步伐。在肿瘤个体化治疗时代，不仅需要临床肿瘤专家对肿瘤诊治有全新的认识，同时需要专业的生物技术机构对肿瘤进行基因层面的诠释。肿瘤与细胞信号通路肿瘤发生发展是一个多因素作用、多基因参与、多信号通路激活的极其复杂的生物学过程。了解肿瘤细胞信号通路是从本质上理解肿瘤、从根本上诊治肿瘤的基石。酪氨酸激酶信号通路是肿瘤细胞主要信号通路，参与了肿瘤细胞生长、增殖、凋亡等重要生理过程的调控。酪氨酸激酶可分为受体酪氨酸激酶和非受体酪氨酸激酶。非受体酪氨酸激酶，包括SRC家族、ABL、JAK家族等。受体酪氨酸激酶根据分子结构可分为若干家族：1）表皮生长因子受体（Her）家族，包括EGFR（HER1）、HER2、HER3、HER4等，此类受体在上皮细胞来源的肿瘤中常呈现高表达；2）血小板衍生生长因子受体（PDGFR）家族，包括PDGFRa、PDGFRb、KIT等，参与肿瘤血管生成；3）成纤维细胞生长因子受体（FGFR）家族，包括FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4等，在肿瘤血管生成中发挥作用；4）血管内皮细胞生长因子受体（VEGFR）家族，是血管生成重要的正性调节因子，包括VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3等；和5)其他，如肝细胞生长因子受体（HGFR，也称cMET）等。受体酪氨酸激酶下游有两条重要的信号通路：1）RASRAFMEKMAPK通路；2）PI3KAKTmTOR通路。新一代抗肿瘤药物与细胞信号通路靶向药物的本质特性，决定了任何一种靶向药物只对部分患者有效。酪氨酸激酶在不同类型肿瘤中过表达，可致使肿瘤细胞内信号的异常激活，导致细胞转化、持续增殖，抵抗细胞凋亡，打乱细胞的生长平衡，使得肿瘤发生发展。因此，酪氨酸激酶通路上的成员均成为开发肿瘤药物的重要靶点。以HER家族为例，其信号通路上几乎所有成员都有相应的靶向药物处于临床试验阶段或已获批准上市（图1）。其中作用于EGFR（HER1）的上市及在临床研究的靶向药物就有近10种，包括西妥昔单抗、厄洛替尼、埃克替尼和GA201等。这些成功进入临床的靶向药物显著提高了肿瘤治疗的缓解率，延长了患者的生存时间，改善了患者生存质量。在不久的将来，靶向药物将成为肿瘤治疗的最主要药物。靶向药物的本质特性，即通过特定靶位发挥治疗作用，决定了任何一种靶向药物只对部分患者有效。明确患者体内是否存在药物疗效相关的靶标是决定患者是否获益的关键。因此靶标检测已成为实施肿瘤个体化治疗的必需部分。图 1 已上市及临床试验中的HER通路靶向药物（益善生物绘制整理）肿瘤个体化治疗与靶标检测的发展单一靶标检测靶向药物的临床使用直接催生了靶标检测在临床的运用。NCCN临床实践指南中明确推荐的检测靶标种类逐年增加。一项全球调查结果显示：2010年，66%的转移性结直肠癌患者会进行KRAS检测来确定他们能否从西妥昔单抗靶向疗法中获益，进行检测的人数比前一年激增了50%。临床研究也同时表明，单一检测某项靶标的指导意义存在明显的局限。如单独检测EGFR突变，能有助于挑选突变型患者选择药物，但不能帮助EGFR阴性患者选到可用药物；而且EGFR突变的患者接受TKI治疗的总缓解率为70%，仍有30%的患者无效。更有甚者，虽然KRAS野生型是使用EGFR抗体药物的前提，但NEJM发表的一项研究显示，即使KRAS为野生型的结直肠癌患者接受EGFR抗体药物治疗的有效率亦仅为12.5%。类似的研究结果均表明仅进行单一靶标的检测存在明显的局限，单一靶标的检测已经不能满足快速发展的肿瘤个体化治疗的需要。单通路靶标检测与检测单一靶标相比较，检测单个信号通路上的所有成员，对实施个体化治疗具有更强的指导意义。Sabine Tejpar教授领导的全球多中心研究结果明确地阐释了通路检测的优势。该研究成功对747位均接受西妥昔单抗联合化疗治疗的结直肠癌患者的EGFR通路基因突变进行检测，检测位点包括KRAS、BRAF、NRAS和PIK3CA共71种突变，覆盖这四个基因突变的90%以上位点。研究结果显示：患者的总缓解率为24.4%，KRAS野生型患者的缓解率为36.3%，KRAS和BRAF均为野生型患者的缓解率为38.4%，KRAS、BRAF和NRAS均为野生型患者的缓解率为39.9%，KRAS、BRAF、NRAS和PIK3CA均为野生型患者的缓解率为41.2%（图2）。从该研究结果可见，通过检测EGFR通路系列靶标，针对EGFR的西妥昔单抗靶向药物的有效率大幅提高了近70%。我们有理由相信，随着肿瘤信号通路研究的深入，将有更多的与药物疗效相关的靶标被揭示，相关靶标的检测必将使药物治疗效率进一步提高。Sabine Tejpar教授等进一步提出了将来对不同基因突变的患者实施不同靶向治疗策略的设想（表1），进行通路靶标检测是选择靶向药物的决策依据。图 2 多基因并行检测，更有效预测治疗缓解率（Lancet Oncol 2010;11:753-62）表 1 对携带不同基因突变患者的靶向治疗策略设想（Lancet Oncol 2010;12:594-603）携带的基因突变可能的治疗方案KRASMAP2Ki+PI3Ki 或 mTORi，EGFRi+MAP2KiBRAFMAP2Ki，BRAFiPIK3CAPI3Ki 或 mTORiPTENPI3Ki 或 mTORi，EGFRiKRAS 和 PIK3CAMAP2K+PI3Ki 或 mTORiKRAS 和 PTENMAP2Ki+PI3Ki 或 mTORiBRAF 和 PIK3CAMAP2Ki+PI3Ki 或 mTORiBRAF 和 PTENMAP2K+PI3Ki 或 mTORi，BRAFi+PI3Ki 或 mTORiPIK3CA 和 PTENPI3Ki 或 mTORii：抑制剂多通路靶标并行检测，为患者选择适合的药物单一靶标检测能预测具体某个药物的疗效，进一步的通路靶标检测则提升了该药物的总体疗效，从而实现为药物选择适合的患者。但是，临床更需要通过靶标检测为患者选择适合的药物。前者似乎已经逐步成为现实，发达国家的药物监管当局也在修改药物评审规则，促使药物研发机构在提交新药申请的同时，递交能有效确定可能获益患者的靶标检测产品。后者却是更加迫切的临床需求，但由于缺乏传统药物企业的参与，面临的困难比前者艰巨，前进的步伐也缓慢的多。M.D. Anderson癌症研究中心于2006年启动的BATTLE临床研究，为基于个体分子差异的肿瘤个体化治疗带来曙光。该研究依据肿瘤标本的生物标志物检测结果，从四种靶向疗法中进行选择，已初步证明可改善对化学治疗耐药肺癌患者的治疗效果。国际肺癌学会的执行理事Bunn博士指出：“这是一项有助于改变现有科研模式的研究。”而扩大病例规模的BATTLE II研究正在进行。Bunn博士回顾了近年肺癌中基因突变检测与在研靶向药物的多项关键研究（J Clin Oncol 2011;29:1943-5），均证明非小细胞肺癌中可存在多种驱动基因突变，如EML4-ALK与EGFR或KRAS基因突变并存。该观点在肿瘤基因组项目中已经得到证实，相同分型分期的不同患者个体的驱动基因亦有很大差异。因此，我们不能期望一种能消灭患者肿瘤中所有驱动基因的药物，但是我们能够通过多通路靶标扫描获得每位患者肿瘤的全面基因信息，从而为肿瘤患者制定出针对这些驱动基因的最佳药物组合。美国国家肿瘤研究所（NCI）资助的肺癌突变联盟正在进行一项研究，通过对致癌基因突变进行并行检测，从10种靶向药物中选择患者适合的疗法。随着越来越多肿瘤驱动基因突变被明确，越来越多靶向药物进入临床，通过靶标检测为患者选择适合的药物这一肿瘤治疗模式终将实现。单一靶标及单通路靶标检测实现为药物选择适合的患者。多通路靶标并行检测则可为患者选择适合的药物。多通路靶标并行检测的技术挑战与对策无论是单通路靶标检测还是多通路靶标扫描，都需要对一个样本中的多种基因多个位点进行同步检测。但是，很多常用的基因突变检测技术，如测序法、Taqman定量PCR法、DHPLC法和ARMS法等，都无法实现多位点并行检测。不能并行检测则只能分开多次进行检测，必然导致以下问题：1）使用样本量成倍递增：每增加一个检测靶标即增加一个反应所需样本量，这对于宝贵的临床肿瘤样本是不可接受的；2）增加系统误差：一个样本检测的多个位点只能在不同反应管中进行，人为增加实验误差；3）检测过程耗时费力、费用昂贵，难以实现规模化：以检测一个样本中的80个突变位点为例，ARMS法需要做80多管（加上内参基因）反应，每个反应管所用试剂是不同的，操作相当复杂，检测成本也大幅提高；而使用测序法或DHPLC法检测更是需要大量人工解读结果图谱