绿僵菌孢子粉的小规模制备.doc

绿僵菌孢子粉的小规模制备中国热带农业科学院附属中小学 曾祥宇应用绿僵菌防治害虫的研究已有100多年的历史，目前，生产绿僵菌分生孢子的方法有三种：液体发酵、固体发酵和液固双相发酵，其中液固双相发酵是迄今国内外气尘分生孢子最成熟的生产工艺，是最有可能在农业生产中大规模应用的。 1、液体深层发酵 宋璋等(2001)利用液体深层发酵获得的液生分生孢子产量较高。液体发酵的优点是发酵过程易于操作，控制简单，而且发酵速度周期较短；缺点是绿僵菌液体发酵所产生的菌丝体和芽生孢子的细胞壁太薄，发酵后的干燥、田间应用时受到紫外线照射等不利环境很容易使其丧失活性，而且液体发酵的产物无法悬浮在油里，这些缺点使液体深层发酵的应用受到了很大限制。 2、固体发酵 固体发酵是采用自然底物做碳源及提供能源，或者采用惰性底物来做固体支持物，整个发酵过程体系无水或者接近无水。因为虫生真菌大部分都是好氧的，所以固体发酵相对而言比较适合生产真菌杀虫剂，大量的气生分生孢子可在固态培养物的细小颗粒表面形成。而这种分生孢子不论从形态学来看还是从侵染力方面分析都很类似绿僵菌侵染寄主昆虫使寄主昆虫死亡后在体表长出的气生分生孢子，很明显要优于液体深层发酵产生所的菌丝体和芽生孢子。气生分生孢子同时也是一些植物病害的生防制剂的首选。固体发酵过程一般不需要非常严格的无菌操作，通气不需要连续通风，而且空气一般也不需要严格的无菌空气。但是固体发酵生产周期较长，菌剂含孢量较低，投入的成本较大。 3、液固双相发酵 液固双相发酵工艺，综合了液体深层发酵和固体发酵的优点：提高所培养真菌对环境的耐受力，降低污染绿；缩短气生孢子生产周期，减少不必要的空间和时间损耗；在液体培养阶段可预先筛选排除污染；便于发酵液与固体颗粒物质的均匀接触，产孢均匀。从物理学、酶学及生物学特性的角度看，液固双相发酵是目前为止国内外获取气生分生孢子最成熟的发酵生产工艺，因为其经济实用、生产效率高而被广泛应用。具体的发酵过程包括液体发酵和固体发酵两个环节，首先是通过摇瓶或发酵罐经液体深层快速生产大量菌丝和芽生孢子，然后将发酵液转接到固体培养物(或惰性基质)上或者转接到固体发酵罐继续发酵产孢。 张丽萍等(2002)通过对绿僵菌的液固双相发酵进行初步研究，确定了培养绿僵菌的培养基、培养温度等为几个主要影响因素。农向群等(2007)着重研究了昆虫病原真菌绿僵菌R8-4菌株在液固双相发酵培养过程中的固相培养阶段的相关影响条件，包括培养基载体、接种量、接种后基质含水量以及在培养过程中的温度、光照和通气量等因素对产孢量的影响，得出蛭石和稻壳均是固相培养的优良载体，以蛭石为载体时的产孢量略高于稻壳等。Lomer等人（1997)以水稻或谷子为基质应用液固双相发酵生产黄绿绿僵菌，所获得孢子产量为100gkg。也有研究者认为这种液固双相发酵系统不太适合大规模的生产，只能通过增加成本和劳动力的投入来提高孢子产量，但是目前来看这种液固双相发酵系统还是最佳选择。 本研究以大米为培养基质，调整发酵配方，获得绿僵菌孢子粉。 一、材料 l、培养基平板菌种培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基。其做法是称取200g马铃薯，洗净去皮切成小块，加水煮烂(煮沸2030分钟，能被玻璃棒戳破即可)，用四层纱布过滤，再加葡萄糖20克和琼脂(1520)克。液体摇瓶培养基：以马铃薯葡萄糖培养基为基础，加入营养液。200g马铃薯去皮后切成小块，煮沸2030分钟，然后用纱布过滤，加水到1000mL。营养液(g/L)：硫酸镁0.05；磷酸铵0.05；硫酸锌0.01。 二、方法 2、平板菌种培养 将购得的孢子粉(上海神微生物)配置成孢子悬浮液涂板培养。 3、液体摇瓶培养基菌种的培养 按液体培养基配方，配制需要量的液体培养基，分装于1L三角瓶中，每瓶装500ml，放入高压灭菌锅灭菌30min，取平板菌种，切成均匀小块接入液体培养基。以上所有操作均在无菌环境下完成。将接种好的液体培养基于室温、180rpmmin的摇床上摇培三天。 4、固体培养基质的配制 将大米浸泡滤水后，加入少量尿素和硝酸钾，于下湿热灭菌30min，灭菌完成后放置于超净工作台中冷却待用。 5、发酵 将摇培好的液体菌种在超净工作台上接种到固体培养基质。接种后，放于自然培养室培养，培养过程注意保持无菌。在发酵培养过程中，前期为菌丝生长阶段，三天后开始形成孢