老姜王洗发水对蚕豆根尖细胞的08.doc

老姜王黑发防脱洗发露对蚕豆根尖细胞的毒性研究 姓名：辛芝红 同组者：严彩芳等 指导教师：郝雪峰 （生物系 生物科学112班 学号2011131237）摘要 本实验以蚕豆为实验材料，运用蚕豆根尖细胞微核技术，以微核千分率作为指标，研究老姜王黑发防脱洗发露对蚕豆根尖细胞的毒性效应及其污染等级。实验中，用老姜王洗发露对蚕豆根尖进行污染处理后，通过观察微核的形态，记录微核的数目，测定蚕豆根尖细胞的微核率，并且整个实验以自来水处理的蚕豆根尖作为对照，来比较测定该洗发露的毒性及污染等级.结果表明，该洗发露具有轻微毒性，为轻度污染。关键词 蚕豆；老姜王黑发防脱洗发露；毒性效应；污染等级Abstract In this experiment, broad beans as experimental material, the use of Vicia faba root tip cells micronucleus technology to the micronucleus permillage as an indicator, research ginger Black anti-off shampoo toxicity and the potential level of contamination on Root Tip Cells. Vicia faba root tip experiment with ginger shampoo on Root Tip pollution, through the observation of micronuclei form, record the number of micronuclei, micronucleus rate of Vicia faba root tip cells was measured, and the entire experiment in water treatment as a control, to compare the determination of the level of toxicity and pollution shampoo. the results show that the shampoo slightly toxic, light pollution.Keywords beans; ginger Black anti-off shampoo; toxic effects; pollution level引 言 回顾MNT的发展史，不能不提及19世纪末Howell与Jolly等的贡献。Howell与Jolly分别在猫和大鼠外周血中发现一种小体，命名为Howell-Jolly小体，并且发现这种小体也存在于恶性贫血患者外周血中。这一小体便是今日MNT中所见的被称之为微核(MN)的小体。 1959年Evans等将蚕豆根端细胞暴露于电离辐射，观察到辐射诱导MN形成效应，并据此间接推断MN来源于辐射诱导的染色体异常。 1970年Boiler和Sehimd用中国金黄地鼠观察了抗肿瘤药三亚胺给予后骨髓与外周血细胞学的变化。并且提出用本来无核的外周血嗜多染红细胞中MN发生率来作为微核试验的基本指标，并正式命名为MNT。此后至70年代中期，Sehimd以及Heddle研究小组的工作，全面奠定了MNT的理论及应用基础。 随着现代社会的发展，越来越多的化学物质运用到人们的日常生活之中，如种类繁多的食品添加剂。而其中有些物质具有较强的危害，如致畸，致癌，致突变性。为了检测已存在或潜在的危害，各种检测技术应运而生。微核试验是检测染色体或有丝分裂器损伤的一种遗传毒性试验方法。无着丝粒的染色体片段或因纺锤体受损而丢失的整个染色体，在细胞分裂后期仍留在子细胞的胞质内成为微核。用微核试验来评价药物、放射线、有毒物质等对人体细胞或体外培养细胞遗传学损伤仍是一个直观有效可行的方法,在遗传毒理、医学、食品、药物、环境等诸多方面得到了广泛的应用。微核计数经济,迅速,简便,不需要特殊技能,可以统计更多的细胞并实现计算机自动计数。 近年来，随着分子生物学技术的迅速发展和渗透到微核研究中，大大拓展了微核试验的检测和应用范围，已发展成为能同时检测染色体断裂、丢失、分裂延迟、分裂不平衡、基因扩增、不分离、DNA损伤修复障碍、HPrt基因突变、凋亡、细胞分裂不平衡等多种遗传学终点的检测，因而近年来国际上有人提出了新微核试验(newmi一cronucleustest)概念，从而大大拓展了微核试验的应用范围。当然，要实现一个实验多个遗传损害终点的检测，需要更多的新的技术手段配合，如FISH技术、图象分析卜技术等等，这也对我国的实验室条件和研究水平提出了更高的要求 微核（Micronucleus,MCN）是真核生物细胞经各种理化因子作用后引起染色体畸变，在间期细胞中的一种表现形式。在细胞间期，微核呈圆形或椭圆形，游离于主核之外，大小应在主核1/31/20，染色与主核一样或稍浅。一般认为微核是由无着丝粒的染色体断片或落后染色体，在分裂末期不能进入主核，便形成了主核之外的核块。当子细胞进入下一次分裂间期时，它们便浓缩成主核之外的小核，即微核。2蚕豆根尖细胞微核试验(Micronucleustest,MC-NT)技术是一种以染色体断裂及纺锤丝损伤为测试终点的植物微核检测方法。它是一种应用于监测环境致突变物对人体和其他生物体的遗传物质产生危害的技术,并从细胞遗传学水平上探讨植物遗传物质的改变状况与环境污染，也可以检测淡水环境的质量。3 蚕豆是一种很好的实验材料。目前，蚕豆根尖微核技术在环境致突变性检测/监测方面已经形成了一套完整的体系。它的可靠性和灵敏性较高，且本底较低，作为检测化学品遗传毒性的方法，得到了广泛应用 4-5。而洗发水是现代日常生活中很容易接触到的化学物品。据有关研究报道,市面上的洗发水大多数含有二恶烷。众所周知,二恶烷是一种有害的致癌物质，但是长时间或者经常使用洗发水护理头发是否会对人体造成危害还没有相关科学依据。所以这也是我们进行本实验的一个原因，希望为其存在的隐患提供一个参考依据。1 材料与用品1.1 实验材料蚕豆、老姜王洗发露、显微镜、镊子、培养皿、剪刀、载玻片、盖玻片、烧杯、Carnoys固定液、NaN3等。1.2 实验器材和试剂显微镜、试管、蚕豆培养盆、纱布、毛巾、烧杯、载玻片、盖玻片、 卡诺氏固定液（用乙醇和冰醋酸以3:1（v/v)混合配制）、 盐酸（1mol/L）、改良苯酚品红染液。2 实验方法 2.1 浸种 按实验需要选取大小均匀、饱满的蚕豆种子20粒，直接放入盛水的塑料盆中，在常温下浸泡1天，期间要注意水的多少。 2.2 催芽 待种子吸胀后，用潮湿的纱布松散包裹置于盆中，纱布上载盖一层湿水的毛巾，催芽2天。 2.3 处理根尖2.3.1选取老姜王洗发露，按平时所用比例与水混合均匀。2.3.2 选取初生根生长良好的种子一半，放入盛有老姜王洗发露的纱布中，进行根尖处理1天。另一半继续清水培养（作为对照组）。2.4 根尖细胞恢复培养处理后的种子用自来水浸洗，洗净后再置入潮湿纱布中，再恢复培养1天左右。2.5 取材、制片 2.5.1 固定 将恢复后的种子，从根尖顶端切下1cm长的幼根，用卡诺固定液固定24小时。 2.5.2 解离 用蒸馏水浸洗固定好的幼根，吸净蒸馏水，加入6mol/L盐酸将幼根浸没，室温下酸解10分钟，幼根软化即可。 2.5.3 染色吸去盐酸，用蒸馏水浸洗幼根三次，每次12分钟。最后浸于水中。制片前取出置载玻片上，截下12mm左右长的根尖，滴1-2滴改良苯酚品红染液染色2030 min。2.5.4 压片观察对各种不同处理的根尖分生组织进行常规压片，每个处理各取3个根尖压片。在高倍镜下观察压片根尖分生区细胞分散良好的区域，并统计不少于1000个细胞中的微核数，然后再统计算出每个根尖的MCN。63 结果3.1标准规定73.1.1 对于蚕豆微核实验中微核千分率的计算可采用以下公式：MCN=某测试样点（或对照组）观察到的MCN数某测试样点（或对照组）观察到的细胞数10003.1.2 对于污染指数（PI）的计算可采用以下公式：PI=实验组MSN总数对照组MSN总数污染指数（PI）判断8如果采用市售蚕豆种子，按规范操作标准实验条件（其对照本底为10以下），其监测样品污染程度的划分可采用“污染指数（PI）”判断。根据全国生物技术监测规范蚕豆根尖微核技术规定的污染指数划分标准，采用污染指数（PI）值来划分受污染程度。此方法可避免因实验条件等因素带来的MCN本底的波动，标准见表19 。凡数值在上、下限时定为上一级污染。表1 污染指数PI值评价水质标准表Table1 Pollution Index for evaluation of water quality standards value of PI table污染指数PI值 水质污染等级0 1.5 基本无污染1.5 2.0 轻污染2.0 3.5 中污染3.5以上 重污染3.2 观察首先在显微镜低倍镜下找到分散均匀的分生区组织细胞，分裂相较多的部位，再转至高倍镜下进行观察。3.3表2 诱变剂诱发蚕豆根尖细胞产生微核统计表Table 2 mutagen-induced Vicia faba root tip cells micronucleus Statistics根尖实验组对照组123123微核数(个/1000)332121MCN2.6671.333污染指数2.0污染等级轻污染毒性轻微有毒4 结论分析由表可知：被老姜王洗发露污染的根尖MCN%为2.667，污染指数（PI）为2.0，属于轻度污染。用清水处理的根尖MCN%为1.333。由实验可知，老姜王洗发露对人体细胞遗传物质损伤有潜在危险，其水样排入水体也对水环境有一定的影响，但影响不是很大。所以我们不必过多担忧，但是在平时生活中，我们应合理利用，将其存在的毒性作用降到最低，也减少不必要的浪费，达到安全、保护健康的作用。5 讨论在做此实验之前，我们根据所查的一些资料做了个预测，预期结果为空白对照组对蚕豆无害，无污染，应该没有或有少数微核出现；经老姜王洗发露处理的实验组溶液具有毒性，有污染，所以预测细胞中微核出现较多。由上述表格中数据及结果分析中，我们可以看到该实验结果基本符合预期结果。在实验中，我认为，由于不同蚕豆生理状况不一致，它们对同样的有毒溶液敏感性也不同，这也会使得实验有一定的误差。但这个影响应该不大，实验证明，微核试验作为一种监测方法，还是非常行之有效的。在此试验中，我们只能得出老姜王洗发露有一定的毒性，但并不能证明是其中的哪种物质起着主要的毒性作用，也不能证明毒性是否会随着用量的增多而加强，而这些问题也是我们所关注及在以后生活中选择洗发露或使用时需注意的，所以我觉得应该在此实验的基础上增加一些具体的对照实验。比如我们猜想可能由于不同浓度洗发露溶液对蚕豆根尖的毒性作用不同，那我们可以设置不同浓度的该溶液，来证明这个猜想；又或者可以用某种物质的特征反应来证明主要起毒性作用的某种物质，为我们以后的选择及使用提供一定的依据。参考文献1 陈光荣、金波、李明等.污染指数在微核技术监测水质污染中的应用.中国环境科学，1986，6（2）：6063.2 陈光荣，金波，李明等.蚕豆根尖微核技术.见：环境监测技术规范第四册生物（水环境部分）.国家环保局，1986,7578.3 金波、欧光鉴等，蚕豆根尖微核试验敏感品种的筛选.华中师范学院学报(自然科学版），1984，（2）：101108.4钟晓芝，钱晓薇.明矾对蚕豆根尖和大蒜毒性效应的细胞遗传学比较研究J.江西科学，2003,21（2）：101-105.5张江丽，陈海峰，菅立峰，等硫酸镁对蚕豆根尖细胞遗传毒性的研究J.环境与健康杂志，2008,25（5）：420-422.6 陈光荣、金波、李明等.蚕豆叶尖细胞威吓测定（MCNT）及其监测大气污染的研究.中国环境科学，1988，6（2）：38.7 陈光荣、金波、李明等.蚕豆细胞微核技术监测农业土壤污染的研究.环境科学，1988，13（2）：7477.8 王永兴等.应用蚕豆根尖细胞微核技术监测太湖水质的研究.中国环境科学，1997，17（3）：252.9 希媛媛.蚕豆根尖细胞微核技术监测黄河兰州段水质污染的研究.甘肃联合大学学报，2005，19（3）：51.3.2结果在对照组和实验组中均可见到一定数量的微核，也发现少量有丝分裂期微核，各种染色体畸变等。根据镜检统计结果，对3个实验组玻片以及对照组（蒸馏水）共计4个样本的MCN进行统计（表2）。表2洗发水安全指数MCN总数PI污染指数对照组2.11（1.42，1.46，3.45）一4.37（3.52，3.73，5.86）2.07中污染二5.13（4.51，4.71，6.17）2.43中污染三4.42（3.57，4.57，5.12）2.09中污染结论：各样品MCN差异不大，但都和对照组相比差异较显著，表明洗发水存在一定致突变性，且对人体有危害，但不是很大。4. 讨论从以上的实验结果及分析可看到，洗发水使蚕豆根尖细胞产生微核。微核试验是一种以染色体断裂及纺缍丝损伤等为测试终点的植物微核监测方法，是监测致突变性污染的一种经济快速方法。致突变性和致癌高度相关, 致突变污染物中可能存在致癌危险物。通过实验表明，洗发水也具有一定的致癌性。实验证明