四种分子杂交的原理及方法.doc

Southern杂交基本概念及原理：Southern印迹杂交（Southern blot）是1975年由英国人southern创建，是研究DNA图谱的基本技术，在遗传病诊断、DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。Southern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量。Southern印迹杂交技术是分子生物学领域中最常用的具体方法之一。其基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则形成双链，此杂交过程是高度特异的。由于核酸分子的高度特异性及检测方法的灵敏性，综合凝胶电泳和核酸内切限制酶分析的结果，便可绘制出DNA分子的限制图谱。但为了进一步构建出DNA分子的遗传图，或进行目的基因序列的测定以满足基因克隆的特殊要求，还必须掌握DNA分子中基因编码区的大小和位置。有关这类数据资料可应用Southern印迹杂交技术获得。 Southern印迹杂交技术包括两个主要过程：一是将待测定核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，即印迹（blotting）；二是固定于膜上的核酸同位素标记的探针在一定的温度和离子强度下退火，即分子杂交过程。该技术是1975年英国爱丁堡大学的E.M.Southern首创的，Southern印迹杂交故因此而得名。 早期的Southern印迹是将凝胶中的DNA变性后，经毛细管的虹吸作用，转移到硝酸纤维膜上。印迹方法如电转法、真空转移法；滤膜发展了尼龙膜、化学活化膜（如APT、ABM纤维素膜）等。利用Southern印迹法可进行克隆基因的酶切、图谱分析、基因组中某一基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性片断长度多态性分析（RFLP）等。下面以哺乳动物基因组DNA为例，介绍Southern印迹杂交的基本步骤。 步骤：一、 待测核酸样品的制备 （一）制备待测DNA 基因组DNA是从动物组织（或）细胞制备。1.采用适当的化学试剂裂解细胞，或者用组织匀浆器研磨破碎组织中的细胞；2.用蛋白酶和RNA酶消化大部分蛋白质和RNA；3.用有机试剂（酚/氯仿）抽提方法去除蛋白质。 （二） DNA限制酶消化 基因组DNA很长，需要将其切割成大小不同的片段之后才能用于杂交分析，通常用限制酶消化DNA。一般选择一种限制酶来切割DNA分子，但有时为了某些特殊的目的，分别用不同的限制酶消化基因组DNA。切割DNA的条件可根据不同目的设定，有时可采用部分和充分消化相结合的方法获得一些具有交叉顺序的DNA片段。消化DNA后，加入EDTA，65加热灭活限制酶,样品即可直接进行电泳分离，必要时可进行乙醇沉淀，浓缩DNA样品后再进行电泳分离。 二、 琼脂糖凝胶电泳分离待测DNA样品 （一）基本原理 Southern印迹杂交是先将DNA样品(含不同大小的DNA片段)先按片断长短进行分离，然后进行杂交。这样可确定杂交靶分子的大小。因此，制备DNA样品后需要进行电泳分离。在恒定电压下，将DNA样品放在0.81.0%琼脂糖凝胶中进行电泳，标准的琼脂糖凝胶电泳可分辨7080000bp的DNA片段，故可对DNA片段进行分离。但需要用不同的胶浓度来分辨这个范围内的不同的DNA片段。原则是分辨大片断的DNA需要用浓度较低的胶，分辨小片段DNA则需要浓度较高的胶。经过一段时间电泳后，DNA按分子大小在凝胶中形成许多条带，大小相同的分子处于同一条带。另外为了便于测定待测DNA分子量的大小，往往同时在样品邻近的泳道中加入已知分子量的DNA样品即标准分子量DNA （DNA marker）进行电泳。DNA marker可以用放射性核素进行末端标记，通过这种方式，杂交后的标准分子量DNA也能显影出条带。 （二） 基本步骤 1. 制备琼脂糖凝胶，尽可能薄。DNA样品与上样缓冲液混匀，上样。推荐使用的靶基因的上样量见不同条件下上样本的使用指针比较表。一般而言，对地戈辛杂交系统，所需DNA样品的浓度较低，每道加2.5-5g人类基因组DNA；如果基因组比人类DNA更复杂（如植物DNA）则上样量可达10g；每道上质粒DNA5kb，则需进行脱嘌呤处理。 (1) 把凝胶浸在0.25mol/LHCl中，室温轻轻晃动，直到溴酚蓝从蓝变黄。 注意：处理人类基因组DNA10分钟；处理植物基因组DNA20分钟。 (2) 把凝胶浸在灭菌双蒸水中 2. 如果靶序列8.0时乙二醛将从PNA分子上解离）。另一方法为电泳时每30分钟换一次磷酸钠缓冲液。 6、电泳结束后（溴酚蓝迁移出区8cm），切下分子量标准参照物的凝胶条，浸入溴化忆锭溶液（0.5ug/ml，用0.1mol/L乙酸铵配制）中染色30-45分钟。在凝胶放置一透明迟，在紫外灯下照片上每个RNA条带至加样孔的距离，以RPN片段大小的lg对数值对RNA条带的迁移距离作图，用所得曲线计算从凝胶移到固相支持体后通过杂交检出的RNA分子的大小,棉纱。 7、RNA从凝胶转移至硝酸纤维素滤膜，将RNA转移至尼龙膜。 二、将变性RNA转移至硝酸纤维素滤膜 电泳完毕后，可立即将乙醛酰RNA自琼脂糖凝胶转移至硝酸纤维素滤膜，有以下几种转移方法：毛细管洗脱法、真空转移法和电印迹法。毛细管洗脱法如下所述，真空转移法和印迹法则按有关仪器生产厂家产品说明书进行。尽管有人认为在转移前对琼脂糖凝胶进行预处理实属不必（Thomas，1980）甚至有害（Thomas，1983）。 但我们认为含甲醛的凝胶必须用经DEPC处理的水淋洗数次，除去甲醛。如果琼脂糖中浓度大于1%或凝胶厚度大于0.5cm或待分析的RNA大于2.5kb，需用0.05mol/L氢氧化纳浸泡凝胶20分钟。然后在凝胶上放置硝酸纤维素凝膜或尼龙膜，RNA随向上迁移的缓冲液转移至固相支持体（硝酸纤维素滤膜或尼龙膜）上。 1、将凝胶移至一个玻璃皿内，用锋利刀片修凝胶的无用部分，在凝胶左上角（加样孔一端为上）切去一角，以作为下列操作过程中凝胶方位的标记。 2、用长和宽均大于凝胶的一块Plexiglas有机玻璃或一叠玻璃板作为平台，将其放入大千烤皿内，上面放一张Whatman 3MM滤纸，倒入20xSSC使液面略低于平台表面，当平上方的3MM滤纸温透后，用玻棒赶出所有的气泡。 3、用一把新的解剖刀或切纸刀裁一张硝酸纤维素滤膜（Schleicher &Schuell BA85或与之相当的产品）。滤膜的长度和宽度应分别比凝胶大1mm，接触滤膜时须戴手套或用平头镊子（例如Millipore镊子），用有油腻的手接触过的硝酸纤维素滤膜不易浸温。 4、将硝酸纤维素滤膜浮在去离子水表面，直至滤膜从下向上湿透为止，随后用20xSSC浸泡滤膜至少5分钟，用干净的解剖刀片切去滤膜一角，使其与凝胶的切角相对应。不同批号的硝酸纤维膜，其浸湿速率相差悬殊。如滤膜池浮在水面上几分钟后仍未湿透，应另换一张新滤膜，因为未均匀浸湿的滤膜进行RNA转移是靠不住的。这种滤膜也不必丢弃，可将其夹在用2xSSC浸湿的3MM滤纸中间，高压5分钟。通常上述处理足以使硝酸纤维素滤膜湿透。高压处理的滤膜应夹在经过高压理理并用2xSSC浸湿的3MM滤纸中间，装入塑料袋，密封后于4保存备用。 5、将凝胶翻转后置于平台上温润的3MM滤纸中央，3MM滤纸和凝胶这间不能滞留气泡。 6、用Saran包装膜或Parafilm膜围绕凝胶周边，但不是覆盖凝胶，以此作为屏障，阻止液体自液池直接流至凝胶上方的纸巾层中。并非堆放得十分整齐的纸巾，易于从凝胶的边缘垂下并与平台接触，这种液流的短路是导致凝胶中的RNA的转移效率下降的主要原因。 7、在凝胶上方放置温润的硝酸纤维素滤膜，并使两者的切角相重叠。滤膜的一条边缘应刚好超过凝胶上部加样孔一线的边缘。滤膜置于凝胶表面适当位置后，就不应轻易移动，滤膜与凝交之间不应留有气泡。 8、用2xSSC溶液浸湿两张与凝胶同样大小的3MM滤纸，温润的放置在湿润的硝酸纤维滤膜上方。用玻璃棒赶出其间滞留的气泡。 9、切一叠（5-8cm高）略小于3MM滤纸的纸巾，将其放置在3MM滤纸的上方。并在纸巾上方放一块越境玻璃板，然后用-500g的重物压实。其目的是建立液体自液池经凝胶向硝酸纤维素滤膜的上行流路，以洗脱凝胶中的RNA并使其聚集在硝酸纤维素滤膜上。 10、使上述RNA转移持续进行6-18小时，每当纸巾浸湿后，应换凝的纸巾。 11、转移结束后，揭去凝胶上方的纸巾和3MM滤纸，翻转凝胶和硝酸纤维素滤膜，以凝胶的一面在上，置于一张干的3MM滤约纸上，用一支极软铅笔或圆珠笔，在滤膜上标记凝胶加样孔的位置。 12、从硝酸纤维素滤膜上剥离凝胶弃之。以6x SSC溶液于室温浸泡滤膜5分钟，这一步可以除去粘着在滤膜上的琼脂糖碎片。从6xSSC溶液中取出滤膜，将滤膜上的溶液滴尽后平放在一张纸巾上。于室温晾干30分钟以上。为估计RNA的转移效率，可将胶置于溴化乙锭溶液（0. 5 ug/ml ，以0.1mol/L乙酸铵配制）中染色45分钟，于紫外灯下观察。 13、将晾干的滤膜放在两经张3MM滤纸中间，用真空炉于80干烤0.5-2 小时。如干烤时间过长，滤膜极易脆裂并可能发黄。如果滤膜并不立即用于杂交实验，可用铝箔宽松地包裹起来，在真空下贮存于室温。 14、仅适用于滤膜上含有乙醛酰PNA的情况：杂交前需用20mmol/L Tris-Cl（pH8.0）于65洗膜，除去RNA上的乙二醛分子。 三、转移至硝酸纤维素滤膜前后进行的RNA染色 当RNA自琼糖凝胶转移至硝酸纤维素滤膜之前，溴化乙锭的染色时间一般不宜过长，这是因为被染料饱和的核酸分子，其转移效率有所降低。然而，用溴化乙锭作短暂染色，既不至于对核酸转移过程产生可以察觉的掏作用，又独具同时检测凝胶和凝膜上的RNA的优点。 （一）方法I 1、电泳结束后，含乙二醛-DMSO的凝胶应浸入含溴化乙锭（0.5 ug/ml）的10mmol/L磷酸钠（pH7.0）溶液。甲醛凝胶需用无RNA酶的水淋洗，用20xSSC溶液浸泡，随后用含溴化乙锭（0.5ug/ml）的20xSSC溶液染色。 2、于室温染色5-10分钟，在紫外灯下观察，照像,屏风。 3、按前所述方法，将凝胶中的RNA转移至硝酸纤维素滤膜，转移后能常在学光下也可看出已染色的RNA条带。 这种方法仅适用于每一泳道均含有相当大量（如5ug 以上）的RNA的情况。 （二）方法 硝酸纤维素滤膜上的RNA也可以用下述方法染色：从干烤后的硝酸纤维素滤膜上剪下所需的条带进行染色，也可以用经过杂交并经X光片曝光后的整张滤膜进行染色（A.Efstratiadis，未了表材料）。 1）将干燥的滤膜浸入5%冰乙酸中，于室温浸泡15分钟。 2）再将滤膜转移至0.5mol/L乙酸钠（pH5.2）、0.04%亚甲蓝溶液中，于室温浸泡5-10分钟。 3）用水淋洗滤膜5-10分钟后，可见RNA分子量标准参照物带型锐利而poly（A）+mRNA为一模糊带型，由许多长度范围从500碱基以下至5kb以上的各种mRNA共同组成，mRNA的平均长度约为2kb。 四、杂交和放射自显影 固定于滤膜上的RNA的预杂交、杂胶及淋洗等条件，与DNA杂交的相应条件基本相同。现简述如下： 1、用下列两种溶液之一进行预杂交，时间1-2小时。若于42进行，应采用： 50%甲酰胺 5xSSPE 2xDenhardt试剂 0.1%SDS 若于68进行，应采用： 6xSSC 2xDenhardt试剂 0.1%SDS 2、在预杂交液中加入变性的放射性标记探针，如欲检测低丰度mRNA，所用探针的量至少为0.1ug，其放射性比活度应大于2x108计数/（分?ug）在适宜的温度条件下继续温育16-24小时。切记RNA只与双链DNA中一条单链互补,滤纸，因此如用单链探针，则必须是能与RNA互补的一条单链。 3、用1xSSC、0.1%SDS于室温洗漠20分钟，随后用0.2xSSX、0.1%SDS于68洗膜3次每次20分钟。 4、用X光片（Kodak XAR-2或与之相当的产品）进行放射自显影，附加增感屏于-17曝光24-48小时Western杂交原理：是将蛋白质电泳、印迹、免疫测定融为一体的特异性蛋白质的检测方法。其原理是：生物中含有一定量的目的蛋白。先从生物细胞中提取总蛋白或目的蛋白，将蛋白质样品溶解于含有去污剂和还原剂的溶液中，经SDS-PAGE电泳将蛋白质按分子量大小分离，再把分离的各蛋白质条带原位转移到固相膜（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，接着将膜浸泡在高浓度的蛋白质溶液中温育，以封闭其非特异性位点。然后加入特异抗性体（一抗），膜上的目的蛋白（抗原）与一抗结合后，再加入能与一抗专一性结合的带标记的二抗（通常一抗用兔来源的抗体时，二抗常用羊抗兔免疫球蛋白抗体），最后通过二抗上带标记化合物（一般为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶）的特异性反应进行检测。根据检测结果，从而可得知被检生物（植物）细胞内目的蛋白的表达与否、表达量及分子量等情况。步骤：(1)用已制备好的SDS-PAGE分离的蛋白凝胶。 (2)用一张滤纸，剪成与胶同样大小，在转移电泳缓冲液中预湿，放在