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园艺植物生物技术课程论文题 目： 果树转基因研究方法与进展 姓 名： 柳忆 学 院： 经济与管理学院 专 业： 国际经济与贸易（大类） 班 级： 国经1006班 学 号： 20115829 指导教师： 张梁 2011年 5 月 28 日果树转基因方法研究进展【摘要】本文综述了近年来植物基因转化的方法、主要影响因素、各种方法在实际应用中的局限性及其解决办法和在果树转基因技术的展望。植物基因转化方法包括农杆菌介导法和直接转化法。果树基因转化研究已在10余个树种中取得成功，其中大多数采用农杆菌介导转化法。【Abstract】This paper reviewed recent plant gene transformation method, the main influence factors, various methods in practical application solution and the limitations and prospect of transgenic technique in fruit. Plant gene transformation methods including agrobacterium-mediated technique and direct variations. Fruit trees gene transformation in 10 species has been successful in, most of which adopts agrobacterium-mediated variations.【关键字】果树 转基因 方法 因素 发展引言分子生物学的迅猛发展,有力地促进了植物科学研究的不断深入.人们从分子水平对生物学和遗传学有了深刻的认知,与组织培养技术相结合,分子生物学技术已开始应用于植物基因组的修饰和改变.由于基因编码的同一性,任何有机体内的有用基因都可转入到植物体.外源基因(如抗虫或抗病基因等)的导入,导致了新的基因型的出现或基因型改良的实现,从而为植物的遗传育种开辟了广阔前景.一 转基因技术的发展概况继1983年人类首次获得烟草和马铃薯的转基因植株之后，1988年McGrananhan等1获得了首例转基因果树具US基因的核桃，1990年他们获得了具抗虫基因的核桃。在人们利用基因枪法获得大田作物转基因之后3年，基因枪法即在番木瓜上得到成功应用2。 1994年Kalinski统计了转基因植物的专利，计有巧种植物，苹果也名列其中。国内研究者十分重视转基因研究。黄学森等3发表了葡萄的遗传转化;程家胜等4介绍了苹果基因转移技术;随后将Bt基因导人绿袖及金矮生苹果中获得了转基因苹果苗5j;傅润民等较系统地介绍了基因工程及其在果树上的应用6，7;中国热带农科院热带作物生物技术国家重点实验室在番木瓜转基因上开展了工作811;中国农科院柑桔所和华南农业大学开展了抗菌肤基因导人柑桔的研究12,13;沈阳农业大学获得了苹果主栽品种新乔纳金的转基因植株1416;福建农业大学开展了龙眼17、西番莲18和批把等亚热带果树的遗传转化和转基因研究;华中农业大学等在方法学上促进了果树基因工程的进展19，20。开展转基因或遗传转化的还有不少单位2124。果树的转基因研究已成为一个热点。作者试就迄今果树转基因文献综述于后，也就一些问题提出看法，失当之处欢迎批评指正。二 植物基因转化的方法1.1农杆菌介导的基因转化法目前已探讨的各种基因转化方法中，农杆菌基因转化法是研究最清楚的一种25。这种方法是利用自然界的天然遗传工程体系即根癌农杆菌(Agrobacteriumtum代f玫ciens)和发根农杆菌(Agrobacteriumrh挽oglne:)的发病过程，将人为加工的基因转人植物细胞。根癌农杆菌侵染植物引起冠瘦瘤(Crowngall)。冠瘦瘤有两种状态26，一是无组织的肿瘤，在无激素培养基上不断增殖，但无顶端优势且难以生根，与冠瘦瘤诱导有关的质粒为Ti质粒(Tum。:inducingplas-mid)。发根农杆菌侵染植物可在感染部位产生众多的发状根(Hairyroots)，与此有关的是Ri质粒(Rootinducingplasmid)。只有能够被农杆菌感染的植物才可以利用农杆菌作为基因载体。农杆菌的主要侵染对象是双子叶值物，单子叶植物对这两种病菌一般不太敏感，但最近也有不少感染致病的例子，裸子植物也可以进行人工接种感染致病。目前常用的农杆菌转化方法有3种25：(1)直接感染植物伤口:将新萌发的种子、幼胚、子叶或茎段用刀切出一个伤口，接上过夜培养的农杆菌，然后在无激素的培养基上培养肿瘤组织。此方法实验周期短，但肿瘤组织中常有未转化细胞，易形成嵌合体。(2)叶盘转化法:在幼嫩新鲜的叶片上用打孔器取下直径为3一smm的叶盘，在过夜培养的农杆菌菌液中浸数秒后，转移到培养基上共培养2一3d，再将叶盘转移到加有抗菌素的选择性培养基上，诱导苗的分化，使转化细胞直接再生植株。此方法简单易行，可快速获得转基因植株。(3)原生质体共培养法:当原生质体再生出细胞壁并进行分裂的时侯，其行为与植物伤口细胞相似，此时农杆菌可以感染原生质体。在原生质体中加人农杆菌(1:100比例)其培养2440h后，离心去菌，在选择培养基上培养，诱导愈伤组织再生植株。由于原生质体的遗传均质性，转化细胞是单个独立细胞，得到的转化体一般不会有嵌合现象，在应用方面具有重要价值。1.2DNA直接转化由于农杆菌宿主范围的局限性，使占农作物主要部分的禾谷类难以被农杆菌转化。因此在80年代发展了DNA直接导人技术，即用裸露DNA经特殊的处理直接转移到植物体中。12.1聚乙二醇转化法(Polyethyleneglycol:PEG)PEG是原生质体融合的媒介剂，能影响原生质膜的通透性，在占质粒DNA共培养时，致使原生质体主动吸收外源DNA分子，外源基因能整合到植物基因组进行表达和传递。用PEG处理后，大量的原生质体和DNA分子相互接触，再经高Ca“+和高pH溶液作用时，原生质膜的电荷重新分配，表面出现一些暂时可变性孔隙，DNA分子进人原生质体内。当用培养液冲洗原生质体使PEG、高CaZ+和高pH条件改变后，原生质体恢复原来的形态，进入原生质体后的DNA分子可以进入细胞核内，整合到染色体上25。此方法相对简单易行，不需要昂贵的仪器设备，但要具有原生质体制备、培养和再生系统。1.2.2电穿孔法(Electroporation)将原生质体和DNA分子混合于缓冲液中，并置于小小的器皿内，用短时、高脉冲电处理，导致细胞膜出现可恢复性孔隙，从而发生新的渗透孔(3一4nm)，由此使和原生质体膜直接接触的DNA分子进人细胞。质膜上可逆孔隙的大小和数量取决于电场强度和刺击时间长短。此方法目前多限于标记基因，目的在于建立高效的转化体系巨27。123基因枪轰击法(Genegunbombardment)又称粒子轰击法(partielebombardment)或高速粒子微喷射技术(Hightveloeitypartielemieroprojeetion)，是一种机械转移基因的方法。采用加人Ca+和亚精胺等使DNA吸附在钨金微粒表面，制成DNA一微弹，在基因枪激发的瞬间力量作用下，进人植物细胞中。此方法最大优点是其应用的广泛性。但由于受轰击速度、靶细胞距离、微弹直径、速度、射击的扩散半径、外源DNA的量及结构等因素的影响，转化频率低，同时存在价格昂贵、嵌合体不易排除，不易选择转化体等因素，使其应用受到限制。1.2.4其它转化方法除上述常用方法外，还有显微注射法(Microinjection)、花粉管通道(Pollentubepathway)、脂质体融合法(Liposomefusion)、超声波冲击法(Ultrasonieation)、微激光法(Mierolasar)电泳法(EleetrophoresiS)等被应用于植物基因转化。三 影响果树基因转化的因素2.2.1 农杆菌的侵染能力及载体的影响农杆菌的侵染能力与转化率有着直接的关系,也是转化成败的主要因素之一。农杆菌的侵染能力取决于农杆菌本身的特性及受体植物对它的敏感性。就农杆菌而言,其侵染能力与农杆菌种类及载体质粒的结构有关。农杆菌分三大类菌系,即胭脂碱型( Nopalinetype ,Nop)、章鱼碱型(Ocopine type,Oct)及农杆菌碱型( Agropine type )亦称琥珀碱型(Succinemopine type, Suc)。Nop型菌株的特点是染色体背景为C58,生长速度快、不结球、易操作,常用的工程菌株有C58、pGV3850、A208SE等。Oct型菌株的特点是其染色体背景为Achs,生长慢,菌株培养过程中结球,在转化实验中不利于操作,共培养后不易洗掉,常用的工程菌株有LBA4404、LBA104。Suc型菌株的特点是染色体背景为A281或A136,具有Nop型菌株的特点,常用的工程菌为EHA101和EHA105,它们具有生长快、不结球等优良特性,这两种菌株的侵染能力都很强。我们进行了菌株种类对多种果树的侵染能力比较研究,结果表明EHA105是理想的果树基因工程转化载体系统,该菌株具有生长快、不结球、转化中易操作、共培养后易洗脱、对Cef敏感、侵染能力强、寄主范围宽等特性。我们利用该菌株已成功获得了苹果、樱桃、草莓等多种转基因植株。2.2.2 农杆菌vir基因的活化vir基因的活化是农杆菌转化的域阀。vir区有virA、B、C、D、E、F、G、H 7个操纵子共24个基因,共同起调控作用,它们与T-DNA的加工和转移有关。vir区基因的活化在农杆菌转化中的作用十分重要,因此凡能增强vir基因活化的因子都能提高其侵染能力。常用的vir基因诱导物是乙酰丁香酮(acetosyringone,AS)。关于诱导物的使用常采用以下3种方法:在农杆菌液体培养时加AS,加入时间一般在制备工程菌侵染液使用前46小时加入。AS加在农杆菌和外植体共培养的培养基中在农杆菌液体培养基中及共培养基中都加入AS。这种方法似乎最牢靠,只不过是使用的AS诱导剂太多了。然而,也有很多实验表明不加诱导物同样可以实现转化的目的。另外在苹果叶片转化中发现,与AS同时加入诱导稳定剂甜菜碱(lmmol/L)或脯氨酸(lumol/L),对vir基因活化有协同作用。研究发现, pH值对vir区的活化有着明显的影响,从理论上讲含AS的培养基pH值为5.05.6时,vir区基因的诱导达到最高水平,pH值改变0.3,即对多种植物的转化率有明显的影响。章鱼碱型和农杆菌碱型菌系比胭脂碱型需要更低的pH值。通常农杆菌培养时pH值为7.2。这种生长旺盛的菌株vir基因均处于不活化状态。植物组织培养基中的pH值常为5.8,有利于vir基因的活化。在vir基因活化诱导中应注意调整培养基的pH值。此外,vir基因活化还受到其他因素的影响,如温度,virD及virG的活化必须低于28;培养基中还应加酵母提取液;培养基中的糖或高浓度的肌醇可促进vir基因表达。四 植物转基因研究中存在的问题及解决之法通过转基因技术可以优化植物的农艺性状,获得良好的经济效益,并且已经取得了举世瞩目的成就.尽管如此,植物转基因研究中还存有一些潜在问题.31食品安全性问题把影响蛋白酶活性的抑制剂基因导入植物体后,能够使取食其叶片的昆虫的消化功能受到损害,那么转基因植物的叶片、果实、种子等是否会对人畜产生类似的伤害?其他种类的基因导入植物体后,对人畜会产生怎样的后果?尽管目前还没有直接证据证明转基因植物是否对人畜有害或其危害程度,但这种疑虑使人担心.32病虫的抗药性问题病虫的抗药性问题是困扰农业生产的重大问题.最近研究表明,若每年喷施苏云金杆菌杀虫剂1020次,5年后害虫死亡率降低50%,其半死剂量提高10倍.如果大规模种植能自行产生苏云金杆菌毒蛋白的转基因植物,类似情况有可能会发生.此外,由于生物共同进化,抗性植物在逆境条件下能够生存,那么病虫也会很快发展其对不良生境的适应性,从而使转基因植物逐渐失去对病虫的抗性.33环境生态平衡问题目的基因导入植物后,使其性状得以改良.但这些基因如果被一些野生植物尤其是一些杂草俘获,就会产生一些新的杂草类型.如:除草剂对已俘获了抗除草剂基因的杂草不再具有除草性能.如果抗逆基因被杂草俘获,就会增强其对环境的适应性和生存竞争能力,而使其加剧繁衍蔓延,一些稀有植物种会由于竞争替代而消亡,同种植物的遗传多样性便会减少,昆虫群落也会受到影响.尽管转基因研究会引发上述问题,但随着研究的不断深入,人们会寻求新的对策来解决这些问题.通过立法等手段来加强转基因研究的管理,以使转基因研究所带来的负面影响减小到最低.通过时间、空间和遗传隔离等方法,可以基本控制植物基因的扩散,降低其对生态环境所带来的危害.五 转基因技术的展望定点、定量将外源基因导入受体细胞基因组DNA中,获得稳定、高效表达和遗传的新个体是转基因研究的主要目标.并且随着生物技术产业化进程的加快,转基因技术将会产生越来越重要的作用. (1)利用多基因转化培育超级抗病虫害新品种 许多病毒、真菌、细菌及害虫不仅给果树生产造成巨大的经济损失,而且农药的大量使用造成了环境的污染。现已克隆出许多抗病虫害的基因,如cp、bt、icp、cpti、抗菌肽、几丁质酶及雪莲凝集素、PRP基因等,为培育抗病新品种打下了基础,但是这些基因的专一性很强,只能对某一类病虫害有效。近年来植物基因工程的重要进展是构建了人工染色体载体,建立了多基因转化系统,实现了多基因转化。这些新进展为果树导入多个不同类型的抗病虫害基因打下基础,为培育普抗病虫害的超级新品种开辟了新的途径。(2)利用基因工程培育砧木新品种 砧木新品种的育种是果树重要研究课题。果树的抗逆性、矮化、丰产性、生根能力等都与砧木有关。现在已有许多抗逆基因、生根激素基因、矮化基因等,把这些基因导入现有的砧木将有力推动果树产业的发展。而且,砧木基因工程育种几乎不存在转基因的安全性问题,容易被社会接受。(3)利用反义基因操作培育耐贮的新品种.根据反义RNA的原理,人工构建反义基因导入细胞,表达能与靶mRNA互补的部分序列,并与其配对结合形成复合物,从而阻断DNA经过RNA到蛋白质的信息流,调控靶基因表达。反义基因操作技术在植物基因工程方面的应用已取得可喜的成果。 (4)改良水果的品质 迄今已克隆出许多与果实品质有关的基因,如果聚糖合成酶基因、海藻糖合成酶基因、甜蛋白基因、赖氨酸等必须氨基酸合成酶基因等,把这些基因导入果树将培育出优质新品种。参考文献：1 MGraahGsliCUrasuS脚bacddraformof词sommbandreratftrans罗nieplants.Bio.Teehnolo盯，1988，6:8印一8以2 FitehMMM ManshaxdtRM.GonsalvesD.SrabletransfOrmationofppayaviamieroproJeetilebombardment.PlantCellRep.，1990，9:189一1943黄学森，MullinsMG.用生物工程技术将外源基因转人葡萄的研究遗传，1989，n(3):9一114程家胜，DandekarAM，Ura记J51.苹果基因转移技术研究初报.园艺学报，1992，19(2):101一1045程家胜，鄂超苏.转Bt抗虫基因苹果植株的再生.中国果树，1994，(4):14巧6CheZM.StrategiesfornetieenneeringofapevinesfOrerowngaldiseaseresistanceandatteI11ptedtransfOrmationviagrobreriumTiplasnl以liaveetorsandthebiolistiep，es。:phD，Diss.Ithaca，N.Y.:eonellUniv.，1991.1一807傅润民主编.果树瓜类生物工程育种.北京:农业出版社，1994.364一3898周鹏，郑学勤.PRSv一CP转基因番木瓜表达与抗病能力关系的研究.热带作物学报，1996，17(2):77839周鹏，郑学勤.PRv一CP一SN转基因番木瓜表达与抗病能力的研究.热带作物学报，1996，17(2):848710周鹏，郑学勤.转基因番木瓜小规模田间攻毒试验.热带作物学报，1997，18(l):586211赵志英，周鹏.核酶基因转化番木瓜的研究.热带作物学报，1998，19(2):2012陈善春，