正交试验法优选神爽片提取工艺的研究.doc

正交试验法优选神爽片提取工艺的研究 学生姓名：陈有山 专业班级：材料工程1101设计总说明目的:研究中药新制剂神爽片的最佳提取工艺条件。方法:采用正交试验法,考察了乙醇浓度、回流时间、溶剂用量、提取次数4个因素,以黄芪甲苷含量和浸膏得率为主要评价指标,采用加权评分法进行综合评价分析。结果:乙醇浓度、回流时间和溶剂用量对黄芪甲苷含量和浸膏得率无显著性影响,提取次数具有显著性影响。结论:确定了优选提取工艺为10倍量体积70%的乙醇提取3次,每次90 min。关键词：神爽片，黄芪甲苷，直观分析法，正交试验法Orthogonal test for optimization of extraction technology Hale tabletsName:Chen you shan Class: Materials engineering first class Design General InformationObjective: To study medicine preparations Hale new piece of optimum extraction conditions . Methods: The orthogonal experiment investigated ethanol concentration, reflux time , the amount of solvent extraction times four factors to Astragaloside content and extract yield major evaluation , a comprehensive evaluation and analysis using the weighted scoring method. Results: The concentration of ethanol , reflux time and solvent consumption Astragaloside content and extract yield no significant effect on the number of extraction has a significant impact. Conclusion : To determine the preferred extraction process is 10 times the volume of 70% ethanol extracted three times, each time 90 min.Keywords : Hale tablets, Astragaloside , intuitive analysis, orthogonal test目录1.前言42.正交试验的原理42.1 正交表的介绍42.2 正交试验设计的基本方法62.3 正交试验的分析方法62.3.1 正交试验的直观分析法62.3.2 正交试验的方差分析法63. 正交试验法优选神爽片提取工艺实验分析73.1 正交试验设计73.1.1 仪器73.1.2 试药73.1.3 方法与结果73.1.4 评价指标的确定83.2正交实验结果分析83.2.1直观分析法93.3.2方差分析法124.结论135.致谢131.前言亚健康是21世纪威胁人类健康的重大问题之一，亚健康 是一种临界状态，处于亚健康状态的人，虽然没有明确的疾病，但却出现精神活力和适应能力的下降，如果这种状态不能得到及时的纠正，非常容易引起心身疾病。亚健康即指非病非健康状态，这是一类次等健康状态，是界乎健康与疾病之间的状态，故又有“次健康”、“第三状态”、“中间状态”、“游移状态”、“灰色状态”等的称谓。世界卫生组织将机体无器质性病变，但是有一些功能改变的状态称为“第三状态”，我国称为“亚健康状态”,约有75%的现代人处于亚健康状态,症状主要表现为疲劳、乏力、失眠、头晕等,病因是多种因素的共同影响导致了机体的神经系统、免疫系统等整体协调失衡和功能紊乱1,2。本课题研究的神爽片是由临床常用的调和肝脾的中药加减并经过现代工艺制成的新型中药制剂,主要由黄芪、白芍、五味子等五味中药组成。它以中医理论为指导,充分利用了中药复方的优势,从调理身体机能的角度出发,来实现其缓解体力疲劳、增强免疫力、改善睡眠的功效。笔者利用正交试验法,对其主要相关工艺因素进行研究,为优选提取工艺条件提供科学的依据。黄芪为方中君药,药理实验已经证明黄芪具有提高免疫力、缓解疲劳等功效3,4,黄芪甲苷为黄芪的主要活性成分之一,其检验方法比较成熟,故选择黄芪甲苷作为本产品的功效成分。2.正交试验的原理 正交试验设计是利用规格化的正交表，恰当的设计出试验方案和有效的分析实验结果，提出最优配方和工艺条件，并进而设计出可能更优秀的试验方案的一种科学方法。 2.1 正交表的介绍 正交性原理是设计正交表的科学依据，它主要表现在“均衡搭配”和“整齐可比”两方面。正交试验设计是多因素的优化实验设计方法，也称为正交设计，一般是从实验的全部样本点中挑选出部分有代表性的样本点进行实验，利用这些代表点所做的实验能够反映出每个因素各个水平对实验结果的影响。由于这些代表点具有正交性，因此称这组实验为正交试验。挑选正交的样本点，安排正交试验的过程，称为正交试验设计。正交试验一般用正交表(orthogonal array)来安排实验，表1为本次试验所用的3因素(factor)、4水平(1evel)的正交表，记为LM(QN)=L9(43)，其中L代表正交表，M表示要做M次实验；QN表示有N个因素，每个因素有Q个水平。表中每一纵列代表同一因素的不同水平；每一横行代表要运行的一次实验，实验完成后，将实验结果写在右侧4。 表1 L9(43)的正交表试验次数 因素A B C结果11 1 1y121 2 2y231 3 3y341 4 4y452 1 2y562 2 1y672 3 4y782 4 3y893 1 3y9103 2 4y10113 3 1y11123 4 2y12134 1 4y13144 2 3y14154 3 2y15164 4 1y162.2 正交试验设计的基本方法 正交试验法，也称为正交试验设计法，就是一种多快好省地安排和分析多因素试验的科学方法。它是应用正交性原理，从大量的试验中挑选适量的具有代表性、典型性的试验点，根据“正交表”来合理安排试验的一种科学方法。正交设计安排试验方案及分析试验结果的基本步骤和方法如下： （1）明确试验目的，确定参考指标； （2）挑因素，选水平。把直接必然的原因成为正交试验设计中的因素。“水平”是指各因素在试验中要比较的具体情况和取值。对某个因素，需要做仔细考察时，就应多分几个水平；若勿需详查时，就少分几个水平； （3）选择合适的正交表。首先要求表中的水平个数与被考察的水平个数完全一致；其次要求正交表的纵列数大于或等于被考察的因素个数。在此之前必须做实验的研究项目，或计算性的研究项目； （4）用正交表安排试验。按对号入座的方法将数据填入所选的正交表中。 （5）对试验结果进行分析得出最优的实验方案。2.3 正交试验的分析方法 2.3.1 正交试验的直观分析法综合平衡法是先对每个指标分别进行直观分析，得到每个指标的影响因素主次顺序和最佳水平组合，然后根据理论知识和实际经验，对对各指标的分析结果进行综合比较和分析，得出最优方案。综合评分法是根据各个指标的重要程度，对得出的试验结果进行分析，给每个试验评出一个分数，作为这个实验的总指标，显然根据这个总指标，利用单指标实验结果的直观分析法进一步的分析，确定较好的实验方案。 2.3.2 正交试验的方差分析法直观分析法虽具有简单、直观、计算量较少的优点,但其不能给出误差大小的估计。因此，也就不能知道精确的结果。方差分析可以弥补直观分析的不足之处。对于正交试验多因素的方方差分析，先计算出各因素和误差的离差平方和，然后求出自由度、均方、F值，最后检验F值。3. 正交试验法优选神爽片提取工艺实验分析 3.1 正交试验设计 3.1.1 仪器 Agilent 1100高效液相色谱仪,AlltechELSD 2000型蒸发光散射检测器( ELSD) , HeidolphLaborota 4000旋转蒸发仪, Sartorious十万分之一天平。 3.1.2 试药 黄芪甲苷对照品:中国药品生物制品检定所,批号: 1107812200613 (供含量测定用)，甲醇、乙腈:美国merck公司(色谱纯) ，水为超纯水,其它试剂为分析纯。黄芪、白芍等药材均购自广州健和中药饮片有限公司,经鉴定质量合格。3.1.3 方法与结果 色谱条件：色谱柱：Agilent XDB C18 ( 416mm 150 mm, 5m) ；流动相：乙腈2水( 33 67) ；流速: 110 mL /min；柱温：25，ELSD 漂移管温度10012 , 压缩空气流速: 217 L /min；放大系数(Gain) ：2；分流器( Impactor) ：off。在上述色谱条件下，黄芪甲苷色谱峰的保留时间约为16130 min ，理论塔板数以黄芪甲苷峰计算大于5 000。对照品溶液的制备：精密称取黄芪甲苷对照品10145 mg，置5 mL 容量瓶中，用甲醇溶解,定容至刻度，即得2109 mg/mL对照品储备液。供试品溶液的制备：精密量取各正交试验所得浓缩液100 m，, 70水浴旋转蒸发仪回收溶剂,残渣加水40 mL微热使溶解,用氯仿萃取3次，每次30 mL,弃去氯仿层;水溶液用水饱和的正丁醇振摇提取3次,每次40 mL，弃去水溶液层;合并正丁醇提取液,用氨试液充分洗涤3次，每次30 mL,弃去氨液层；正丁醇提取液用水洗涤2次，每次40mL,弃去水液，正丁醇液用70 水浴旋转蒸发仪回收溶剂蒸干,残渣加甲醇使溶解，转移至5 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，用0.45m有机系微孔滤膜过滤4，即得提取工艺供试品溶液。根据预试验结果， 选出乙醇浓度(A) 、回流时间(B ) 、溶剂用量(C) 、提取次数(D) 4个试验因素,每个因素分3个水平(见表1) 。按处方称取每日4倍量药材,共18份,每份72 g。按34正交试验表进行试验安排,用乙醇回流提取,每组试验做2次平行对照,提取液滤过后,旋转蒸发仪减压回收溶媒,浓缩至约500 mL,室温置冷,容量瓶定容至500 mL,分别测定浸膏得率和黄芪甲苷含量5,取2次平行对照的平均值,结果见表2。 样品含量测定：在上述色谱条件下，吸取提取工艺供试品溶液20L进样，测定黄芪甲苷峰面积，按标准曲线方程计算黄芪甲苷的总量，再与药材总量比较得到黄芪甲苷的含量,结果见表2。 表2 因素水平表 因素水平A /% （乙醇浓度）B /min（回流时间）C /倍（溶剂用量）D /次（提取次数）1606081270901023801201233.1.4 评价指标的确定 以黄芪甲苷含量和浸膏得率作为评价指标,采用加权评分法进行综合评价。考虑到黄芪甲苷含量较为重要,故其权重系数取0.8,浸膏得率的权重系数取0.2,综合评分=(黄芪甲苷含量/最大黄芪甲苷含量)1000.8+(浸膏得率/最大浸膏得率)1000.26,结果见表3.3.2正交实验结果分析根据正交因素水平进行正交设计试验，获得试验结果见表3。 表3 正交试验及其结果试验号 水平ABCD黄芪甲苷含量/(mg/g)浸膏得率/%综合评分111110.0349 15.8652.04212220.0635 22.8990.17313330.0640 25.7892.89421230.0702 21.7196.80 522310.0485 17.4368.82623120.0610 20.4985.41731320.0585 19.0381.45832130.0607 21.3785.76933210.0538 15.7373.46 3.2.1直观分析法直接观察在本实验中，黄芪甲苷含量和浸膏得率越大越好，效果越显著，就指标来说数值越大越好。经比较9组数据，A2B1C2D3一般计算分析根据表 6 所测得的数据，求出个因素水平之和K1、K2、K3、K4以及相应平均值 k1、k2、k3、k4和每列的极差 R，如下：表4 回流提取工艺正交试验设计及结果 水平 试验号ABCD黄芪甲苷含量/(mg/g)浸膏得率/%综合评分111110.0349 15.8652.04212220.0635 22.8990.17313330.0640 25.7892.89421230.0702 21.7196.80 522310.0485 17.4368.82623120.0610 20.4985.41731320.0585 19.0381.45832130.0607 21.3785.76933210.0538 15.7373.46K1235.10 244.75 223.21 194.32 K2251.03 244.75 260.43 257.03 K3240.67 251.76 275.45 275.45 k178.37 76.76 74.40 64.77 k283.68 81.58 86.81 85.68 k380.22 83.92 81.05 91.82 R5.31 7.16 12.41 27.05 主次顺序 DCBA优水平A2B3C2D3优组合 A2B3C2D3 为直观分析，做因素和指标的变化规律图：表5 因素和指标的变化规律图由指标因素图看试验指标与因素D，即提取次数对指标评分的影响较大。（1） 计算级差 确定因素的主次顺序。首先解释表4中引入的三个符号。 Ki： 任一列上水平号为i（本例中i1，2或3）时所对应的试验结果之和。例如，在表2中，在C因素所在的第4列上，第1，6，8号试验中C取C1水平，所以K1为第1，5，9号试验结果之和，即K152.0585.4185.76235.1；第3，5，7号试验中B取B3水平，所以K3为第3，5，7号试验之和，即K392.8985.4173.46251.76；同理可以计算出其他列中的Ki，结果如表4所示。 ki = Ki/s 其中s为任一列上各水平出现的次数，所以ki表示任一列上因素取水平i时所得试验结果的算术平均值。例如，在本例中s3，在B因素所在的第3列中，k3251.76/383.92。同理可以计算出其他列中的ki，结果如表4所示。 R：称为极差，在任一列上RK1,K2,K3maxK1,K2,K3min，或Rk1,k2,k3maxk1,k2,k3min。例如，在第3列上，最大的Ki为K2（86.81），最小的Ki为K1（74.40），所以R86.81-74.4012.41。通常各列的极差是不相等的，这说明各因素的水平改变对试验结果的影响是不相同的，极差越大，表示该列因素的数值在试验范围内的变化，会导致试验指标在数值上有更大的变化，所以极差最大的那一列，就是因素的水平对试验结果影响最大的因素，即最主要的因素。在本例中，由于RDRCRBRA，所以各因素从主到次的顺序为提取次数(D),溶剂用量(C),回流时间(B ),乙醇浓度(A)。(2) 通过极差确定优方案优方案是指在所做的试验范围内，各因素较优的水平组合。在选择确定时，各因素优水平的确定与试验指标有关，若指标越大越好，则应选取使指标大的水平，即各列Ki（或ki）中最大的那个值对应的水平；反之，若指标越小越好，则应选取使指标小的那个水平。在本例中，试验指标是综合评分，指标越大越好，所以应挑选每个因素的K1，K2，K3(或k1，k2，k3)中最大的值对应的那个水平，由于： A因素列：K2K3K1 B因素列：K3K2K1 C因素列：K2K3K1 D因素列：K3K2K1 所以优方案为A2B3C2D3，即优选提取工艺为10倍量体积70%，的乙醇提取3次,每次120 min。3.3.2方差分析法 表6 实验结果处理表试验号 水平ABCD黄芪甲苷含量/(mg/g)浸膏得率/%综合评分综合评分-80111110.0349 15.8652.04-27.96 212220.0635 22.8990.1710.17 313330.0640 25.7892.8912.89 421230.0702 21.7196.80 16.80 522310.0485 17.4368.82-11.18 623120.0610 20.4985.415.41 731320.0585 19.0381.451.45 832130.0607 21.3785.765.76 933210.0538 15.7373.46-6.54 K1-4.9-9.71-16.79-45.68K211.034.7520.4317.03K30.6711.763.1635.45K1224.0194.28281.92086.66K22121.6622.56417.38290.02K320.45138.39.991256.7S43.5779.91231.291205.99自由度2222均方 -39.955115.645602.995F -1.8345.30827.68令：F=（各因素方差/各因素方差的自由度）/（误差方差/误差方差的自由度）通过比较上表的F值，由表2分析可知,影响提取的主次因素为D C B A,即提取次数溶剂用量回流时间乙醇浓度,最佳提取工艺为A2B3C2D3。方差分析(见表6)可知,D因素为显著因素,即提取次数对黄芪甲苷含量和浸膏得率有显著性影响。乙醇浓度、回流时间及溶剂用量对黄芪甲苷含量和浸膏得率无显著影响。根据统计分析的效应曲线图,从节约时间考虑将B3 改为B2 ,即回流时间120 min改为90 min。由此确定提取工艺为A2B2 C2D3。即10倍量体积70%的乙醇,提取3次,每次90 min为