决明子有效成分黄酮类化合物的提取.doc

决明子有效成分黄酮类化合物的提取生科院093班 谈洋成 09243226一、摘要： 决明子是一种常用中药，富含黄酮，蒽醌和多糖，具有广泛的药理活性。现代药理学研究又表明，决明子具有降血压、降血脂，保肝及抑菌等活性，被应用于多种降脂减肥的成方制剂中。同时，决明子又可作食用中药，是保健饮料的良好原料。 实验过程中测定了决明子中黄酮类化合物的含量，采用乙醇回流水浴提取黄酮，对比研究提取时间、乙醇浓度、浸出温度和料液比等因素对提取效果的影响,再进行正交实验优化工艺条件。含量测定应用紫外可见分光光度法进行测定，并使用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色体系。 实验结果表明乙醇提取法效果最佳。在最佳提取条件75乙醇为提取剂，80下提取，提取时间3.5h，料液比1:30时。以芦丁为标准物质，绘制的标准标准曲线其回归方程为C=96.838A-2.8675，相关系数R2=0.9951。又测得提取液吸光度为0.428，黄酮浓度为37.0m/mL，提取率为88.61%。二、关键词： 决明子，黄酮类化合物，乙醇，提取工艺。三、材料和方法：1、实验仪器 名称型号生产厂家循环水式多用真空泵SHB郑州长城科工贸有限公司电子恒温不锈钢水浴锅HHS2S上海市南阳仪器有限公司可见分光光度计722N上海精科电子有限公司调温电加热套DZHW河北省黄骅市中兴仪器有限公司电子天平AW220慈溪市天东衡器厂大功率粉碎机QE100武汉县工具有限公司索氏提取器-天津北辰区光明仪器厂蒸馏装置M22型中量天津玻璃仪器厂电热干燥箱2023北京金北德工贸有限公司2、 实验药品 选用决明子在药房购得，产地为广西省。名称分子式纯度生产厂家芦丁标准物质C27H30O16A.R西安旭煌生物技术有限公司95%乙醇CH3CH2OHA.R天津永晟精细化工有限公司无水甲醇CH3OHA.R天津光复精细化工研究所丙酮CH3COCHA.R天津风船化学试剂科技有限公司石油醚-A.R天津永晟精细化工有限公司亚硝酸钠NaNO2A.R天津永晟精细化工有限公司硝酸铝Al2(NO3)39H2OA.R天津永晟精细化工有限公司氢氧化钠NaOHA.R天津永晟精细化工有限公司。3、实验流程及装置图 黄酮提取实验流程4、 实验所用仪器装置见图5、实验方案5.1标准溶液的配制和标准曲线制作 将芦丁于120下干燥至恒重，准确称取芦丁标准样品0.0200g，用30乙醇溶解，定溶于100mL，得浓度为0.200mg/mL芦丁标准液。准确吸取芦丁标准液0mL、0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL、3.0mL于10mL容量瓶中，加入5%NaNO2液0.3mL，摇匀，放置6min后加入10%Al(N03)3溶液0.3mL，摇匀，放置6min后加入4%NaOH溶液4.0mL，再用30%乙醇定容，摇匀，以30%乙醇为空白参比，l0min后用lcm比色皿于510nm测定吸光度A，得到芦丁标样含量Y(g/mL)与吸光度A间的关系，画出标准曲线。5.2决明子中黄酮平均含量的提取及测定 决明子中总黄酮平均含量的测定。分3次分别准确称取3.0决明子粉末，用滤纸包住并用棉线捆好，置于索氏提取器中，用100mL甲醇体积浓度75，80水浴加热回流，当索氏提取器中的溶液由黄色接近无色时，取出用滤纸包住的决明子粉末，蒸馏回收甲醇至近干，加水约80mL溶解，加入20mL石油醚脱色2次，弃去醚层。加水于100mL容量瓶中定容，作为待测液17。取待测液10mL于50mL容量瓶中，用30乙醇定容，取2.0mL于10mL容量瓶中，以下按照测定芦丁标准液吸光度的方法测定吸光度A。重复3次，结果取平均值。从决明子中提取的黄酮含量可按下列公式计算：M(%)=Y(100/10)(50/2)1010-6100/w式中：100/10 和50/2稀释倍数；w决明子重(g)。提取率(%)=(提取黄酮含量/决明子中总黄酮的平均含量)10018。5.3决明子中总黄酮的提取及测定 准确称取3.0g决明子粉末置于磨口三颈烧瓶中，按照设计的配方加入一定量的提取剂，在一定温度下回流提取一定时间，趁热减压抽滤，滤渣加适量水洗涤、过滤合并清液后得提取液，再蒸馏，回收溶剂至近干，再按照2中的步骤配置待测液，以下按照测定芦丁标准液吸光度的方法测定吸光度A，计算黄酮提取率。5.4提取溶剂的选择 分别用沸水、碱性水溶液(pH值9.0)、75乙醇溶液、75甲醇溶液、75丙酮溶液16，80水浴下，回流浸提3.0h，料液比为1:20分别提取，测定其吸光度，计算其提取率分别。5.5影响提取效果的因素1）乙醇浓度对浸提效果的影响 分别采用65%、75%、80%、85%、95%的乙醇浓度按3的操作步骤进行试验，在80下，回流提取时间为3.0h，料液比为1:20，提取决明子中黄酮类化合物的试验，得出乙醇浓度对提取效果的影响。2）提取温度对浸提效果的影响 分别采用50、60、70、80、90、的提取温度16按3的操作步骤进行试验，以浓度为75%的乙醇为提取剂，回流提取时间为3.0h，料液比为1:20，提取决明子中黄酮类化合物的试验，得出提取温度对提取效果的影响。3）料液比对浸提效果的影响 分别采用1:10、1:20、1:25、1:30、1:35(g:mL)的料液比例按3的操作步骤进行试验，以浓度为75%的乙醇为提取剂，回流提取时间为3.0h，提取温度为80时，提取决明子中黄酮类化合物的试验，得出料液比对提取效果的影响。4）提取时间对浸提效果的影响 分别采用1.0h、2.0h、3.0h、3.5h、4.0h的提取温度按3的操作步骤进行试验，以浓度为75%的乙醇为提取剂，提取温度为80，料液比为1:20，提取决明子中黄酮类化合物的试验，得出提取时间对提取效果的影响。单因素实验条件见表所示。乙醇浓度提取温度料液比提取时间恒温水浴8075%浓度乙醇75%浓度乙醇75%浓度乙醇提取时间3.0h提取时间3.0h提取时间3.0h恒温水浴80料液比1:20g:ml料液比1:20g:ml恒温水浴80料液比1:20g:ml165%601:101.0h275%701:202.0h380%801:253.0h485%901:303.5h595%601:354.0h正交试验确定提取的最佳条件为了全面考查影响因素，设计了4因素3水平的正交试验，试验因素水平见表。水平因素乙醇体积分数(A) %温度(B) 料液比(C) g:mL浸提时间(D h165701:202.5275801:253.0385901:303.5L9(34)正交表ABCD1111121222313334212352231623127313283213933216、实验过程中主要事项决明子粉碎粒度要均匀，使用前要经过一定的干燥处理。提取过程中，保持提取温度稳定，一定不能使溶剂挥发。蒸馏回收乙醇过程中，温度上升到90左右是，停止加热，防止过热使黄酮分解。脱色除脂过程中，要待分层结束，醚层上部出现澄清液时，再分液。配置黄酮标准液时，加入显色剂后，需静止一段时间，再加下一种药品。四、结果1、芦丁标准曲线的制作本实验过程中，黄酮类化合物检测以标准物质，应用亚硝酸钠-硝酸铝显色法，通过测定吸光度来确定黄酮类物质的含量。可见分光光度计的波长选取510nm。其结果见表3-1表3-1 标准工作曲线的测定结果V芦丁溶液（mL）C芦丁标准溶液（g/mL）吸光度A1000.00020.510.11031.020.23241.530.34852.040.46062.550.57373.060.684由上表，以吸光度值芦丁浓度作图得，用最小二乘法作线性回归，得芦丁浓度C与吸光度A的标准曲线回归方程式：C=96.838A-2.8675，相关系数R2=0.99512、黄酮含量及提取率 黄酮总含量的测定应用索氏提取器，测定3次，求的平均含量。(0.492+0.477+0.480)/3=0.483，由图3-1的，黄酮的浓度为44.1g/mL。M(%)=Y(100/10)(50/2)1010-6100/w。M(%)=44.110251010-6100/3=3.675%。3、提取剂的影响 通常按极性化合物易溶于极性溶剂，非极性化合物易溶于非极性溶剂，同类分子或官能团相似的彼此互溶的一般规律来选择，溶剂选择适当，就可以比较顺利地将需要的成分提取出来。4、选取溶剂的要求是:(1) 溶剂对所需成分的溶解度要大，对杂质的溶解度要小，或反之。(2) 溶耕不能与植物成分产生化学反应，即使反应亦属于可逆性的。(3) 溶剂要经济易得，并具有一定的安全性(4) 沸点应适中，便于回收反复使用。5、本实验中选取沸水、PH=9的碱性水溶液、75乙醇溶液、75甲醇溶液、75丙酮溶液实验结果如图。提取剂种类吸光度A提取率(%)黄酮浓度(g/mL)沸水0.09319.38.2碱性水溶液（PH=9）0.14329.61375%乙醇0.37577.632.875%甲醇0.37076.532.075%丙酮0.35474.331.8提取溶剂种类对黄酮的提取率的影响效果见图 提取剂种类的影响图 从图以看出，在提取时间，提取料液比和一定的情况下，以水为提取剂的提取效果最差。碱性水溶液的提取效果略好，但是提取液颜色偏灰色，杂质较经石油醚脱色，提取效率与沸水相比提取并不多。 以甲醇、乙醇和丙酮作为提取剂时效果较好，三种提取剂提取效率相差不大，综合考虑沸点、分子极性、化学性质、毒性、成本等因素选择提取剂。其中乙醇具有溶解性能好，对植物细胞的穿透能力强的优点，除了蛋白质、粘液质、果胶、淀粉和部分多糖等外，大多数有机化合物都能在乙醉中溶解；乙醇虽然易燃，但毒性小、价格便宜、来源方便、沸点适中，也可回收反复使用，本身还具有杀菌作用，不易发霉变质。考虑到提取效果、提取溶剂成本以及残留等因素，以乙醇提取剂为最佳。6、提取剂浓度的影响 实验过程中选取乙醇提取浓度分别为65%、75%、80%、85%、95%，提取条件保持，在80下，回流提取时间为3.0h，料液比为1:20，结果见表。乙醇体积浓度(%)吸光度A提取率(%)黄酮浓度(g/mL)650.32767.728.2750.37577.632.8800.36776.032.0850.34972.330.4950.33368.928.7提取溶剂浓度对黄酮的提取率的影响效果见图 提取剂浓度的影响图 由图从65到75随着提取时乙醇浓度的增加，黄酮的提取率明显增加，乙醇浓度为80时，黄酮提提取率与75%变化不大，当浓度升到85时黄酮提提取率随着乙醇浓度的继续增加，黄酮提取率下降。原因是当乙醇浓度为75时，溶液的极性与决明子中黄酮的极性最为接近，另一原因是当乙醇体积浓度超过75，由于脂溶性物质的溶出显著增加，会给提纯带来麻烦。因此，确定乙醇的体积浓度以75为好因此，以浓度为75的乙醇作为提取剂时，决明子中黄酮类化合物的提取率达到最高。7、提取温度的影响 实验中选取60、70、80、90，4个不同提取温度，其他提取条件选取75%的乙醇为提取剂，回流提取时间为3.0h，料液比为1:20，结果见下表提取温度()吸光度A提取率(%)黄酮浓度(g/mL)600.30863.826.4700.34771.830.1800.37577.632.8900.36976.431.8提取温度对黄酮的提取率的影响效果见图提取温度的影响 根据图可知提取温度在60到80之间，决明子中黄酮的提取率随着温度的升高呈现明显的增大的趋势，分析其原因可能是因为提取温度越高，分子扩散速度加快，有利于细胞内黄酮的溶解浸出，故认为80为最佳提取温度。但温度达到90，提取率略有下降。其原因是达的90时提取剂呈现沸腾状，提取剂有一定损失。或者是在此温度下，黄酮发生氧化分解。8、提取时间的影响 实验过程中分别选取提取时间1.0h、2.0h、3.0h、3.5h、4.0h，提取剂浓度为75%，提取温度为75，料液比为1:20，结果如表3-5。 提取时间(h)吸光度A提取率(%)黄酮浓度(g/mL)1.0.0.24350.320.92.00.31164.427.03.00.37577.632.83.50.38980.533.74.00.40183.035.0提取时间对黄酮的提取率的影响效果见图提取时间的影响图根据图可知，提取时间在1.0h至3.0h黄酮提取率明显增大，3.0h后提取率继续增大但幅度不明显。原因是随着提取时间增加，黄酮提取量随之增加，时间增加到一定程度后，黄酮的浸出量几乎达到饱和，因此提取液中黄酮含量在3.0h后无明显变化。所以认为提取时间在3.0h为宜。9、料液比的影响 实验过程中应用1:10、1:20、1:25、1:30、1:35(g:mL)，5种不同的料液比，提取条件为75%的乙醇为提取剂，回流提取时间为3.0h，提取温度为80，结果见表：料液比(g:mL)吸光度A提取率(%)黄酮浓度(g/mL)1:10.0.27356.524.51:200.37577.632.81:250.39080.733.81:300.40383.434.9料液比(g:mL)吸光度A提取率(%)黄酮浓度(g/mL)1:350.41185.135.7料液比的影响图 根据图可知，黄酮提取率随提取剂量的增大而增大，这是因为乙醇用量越大，可溶解的黄酮也就越大，但当固液比达到1:20后，提取率增大的趋势不是很明显，因此，考虑到采用较大的固液比时，不仅增加了乙醇的用量，还增大了后续工序的难度，最终导致生产成本的增加，故选用l:20的固液比作为最优值。10、正交实验结果 本实验研究过程中应用三因素四水平正交实验，其结果见下表。乙醇浓度/%提取温度/料液比/g:ml提取时间/h实验结果/%实验1111163.8实验2122268.5实验3133383.9乙醇浓度/%提取温度/料液比/g:ml提取时间/h实验结果/%实验4212378.5实验5223181.8实验6231274.7实验7313272.3实验8321374.7实验9332162.7均值172.06771.53371.06769.433均值278.33375.00069.00071.833均值369.90073.76779.33379.033极差8.4333.4679.4339.600 由表可见，乙醇浓度A以A2最好，因时间所在列的均值1，均值2，均值3以均值2最大。同理可知B以B2，C以C3，D以D3。所以，直观分析表明决明子中黄酮的提取实验中，黄酮提取率最高的实验方案为A2B2C3D3，即以75乙醇为提取剂，80下提取，提取时间3.5h，料液比1:30，这一结论与单因素实验基本吻合。 以75乙醇为提取剂，80下提取，提取时间3.5h，料液比1:30，为提取条件时，测得提取液吸光度为0.428，黄酮浓度为37.0m/mL，提取率为88.61%。再对乙醇浓度、提取温度、料液比、提取时间四个因素进行方差分析，其结果见下表因素偏差平方和自由度F比F临界值显著性乙醇浓度115.08721.0414.460-温度18.52720.1684.460-料液比158.68721.4364.460-时间149.76021.3554.460-误差422.068- 由表可知，