实验六 rna提取和

实验六植物RNA的提取和RT PCR RNA研究的重要性 DNA RNA和蛋白质是三种重要的生物大分子 是生命现象的基础 DNA的遗传信息决定生命的主要性状 而mRNA在信息传递中起着重要的作用 rRNA和tRNA同样在蛋白质的生物合成中发挥着不可替代的作用 RNA在不同组织部位的分布情况 RNA提取材料 一般情况下 也可以进行下面处理进行保存 RNA提取过程中的注意事项 1 杜绝外源RNA酶的污染 A 戴好手套 在实验过程中禁止大声说话 必要时要求带口罩 B 实验中涉及的离心管 Tip枪头均要求事先用氯仿处理 C 实验台面要求清洁干净 D 实验中的试剂要求无RNA酶2 阻止内源RNA酶的活性 A 选择合适的匀浆放方法 B 选择合适的裂解液 C 控制好样品的起始量 RNA提取中的污染源 手枪头水和溶液实验台面内源性的RnaseRNA样品RNA保存 几种RNA提取方法 1 TRIzol法2 苯酚法3 异硫氰酸胍 酚法 苯酚法提取RNA的原理 细胞内大部分RNA均与蛋白质结合在一起 以核蛋白的形式存在 因此 提取RNA时要把RNA和蛋白质分离并除去 将细胞置于含有SDS的缓冲液中 加入等体积的水饱和酚 通过剧烈振荡 然后离心 形成上层水相和下层酚相 核酸溶于水相 被苯酚变性的蛋白质或溶于酚相 或者在两相界面处形成凝胶层 异硫氰酸胍 酚法提取RNA的原理 GIT与巯基乙醇共同作用抑制RNase的活性 GIT与十二烷基氨酸钠作用使蛋白质变性 从而释放RNA 酸性条件下DNA极少发生解离 同蛋白质一起变性被离心下来 RNA则溶于上清中 该法所提取RNA纯度高 完整性好 适合纯化mRNA 逆转录以及构建文库 TRIzol法实验步骤 1 100mg植物组织在液氮中研磨充分 2 加入1000 lTRIzol试剂 反复颠倒混匀 3 上述混合物在室温放置5分钟 4 加入0 2ml氯仿 振荡混匀15秒 5 将离心管在室温放置2 3分钟 4 12000rpm条件下离心15分钟 6 将上层溶液转移到新的离心管中 加入500 l异丙醇混合均匀后室温放置10分钟进行沉淀 离心 7 移走上清 并用70 乙醇清洗RNA沉淀一次 8 室温干燥或者真空干燥RNA沉淀 然后 将RNA沉淀溶解在无RNase的水中 并保存在 70 DNA消化 可选择 取提取的RNA产物8ml到离心管中 置于冰上 加入1mlDnase和1ml10 DNase缓冲液 37 水浴锅中温育30分钟 加入1ml终止缓冲液 在65 中终止反应10分钟 RT PCR的原理 RT PCR是将RNA的反转录 RT 和cDNA的聚合酶链式扩增相结合的技术 首先经反转录酶的作用从RNA合成cDNA 再以cDNA为模板 扩增合成目的片段 RT PCR技术灵敏而且用途广泛 可用于检测细胞中基因表达水平 细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列 作为模板的RNA可以是总RNA mRNA或体外转录的RNA产物 无论使用何种RNA 关键是确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染 RT PCR中cDNA的合成 a 以oligo dT 为引物 oligo dT 可与mRNA分子3 末端的poly A 序列相结合 有效的引发cDNA第一链的合成 对mRNA具有高效的特异性 由于其cDNA第一链的合成起始于mRNA3 末端 需越过较长的3 端非编码区才能到达编码区 较长序列的mRNA 3kb 分子较难得到全长的cDNA b 以随机六聚体的核苷酸为引物 当特定mRNA中由于含有使反转录酶终止反应的序列或mRNA分子较大且3 端非编码区序列较长难以得到全长序列的cDNA或完整的读码框时 常采用六聚体随机引物拷贝全长的cDNA 当使用随机引物时 cDNA第一链的合成可能起始于mRNA上的许多部位 从而保证得到mRNA的编码区和5 端旁侧 c 以特异的寡核苷酸为引物 一步法RT PCR 这是最特异的cDNA合成方法 如果PCR反应采用两个特异引物 cDNA第一链的合成可由与mRNA3 端最靠近的配对引物起始 仅产生需要的cDNA 并导致更为特异的PCR扩增 逆转录酶和RT PCR 逆转录酶 reversetranscriptase 是存在于RNA病毒体内的依赖RNA的DNA聚合酶 至少具有以下三种活性 1 依赖RNA的DNA聚合酶活性 以RNA为模板合成cDNA第一条链 2 Rnase水解活性 水解RNA 3 依赖DNA的DNA聚合酶活性 以第一条DNA链为模板合成互补的双链cDNA RT PCR特异基因引物的选择 遵循一般引物设计的原则 合成产物一般在300bp以上 避免产物小导致电泳扩散 一般5 和3 的引物在不同的外显子上面 扩增出的片段大小可以和以基因组为模板扩增的产物相区分 可以检测提取的RNA中是否有DNA的污染 RT PCR的反应体系 模板 总RNA mRNA或者是体外转录的RNA引物 随即引物 OligodT 基因特异性引物反转录酶 AMV 禽成髓细胞瘤病毒 逆转录酶和RNA酶H活性 最适温度为42 M MLV Moloney鼠白雪病病毒 逆转录酶 RNA酶 活性较弱 最适温度为37 或42 QuantReverseTranscriptase 全新高效逆转录酶 与RNA模板的亲和力强 对GC含量高的模板通读效果好 质量温度 最适温度为37 RT PCR方法 cDNA的合成 1 oligo dT 500ng l取1ml RNA 约1mg 取2ml 加入DEPC H2O7ml 使得终体积为10ml 2 将上述混合物在70 水浴锅中加热5分钟 3 室温缓慢冷却混合物 大约30分钟 然后将混合物置于冰上 4 按照下列次序在上述混合物中加入下述试剂 5 缓冲液 含MgCl2 4mldNTPs2 5mmol L each2mlRNasin40U l0 5mlAMVRT酶10U l1mlDEPC H2O2 5ml混合均匀后 在42 保温1小时 5 反应后将反应物置于冰上终止反应 然后 在70 保温10分钟 灭活逆转录酶活性 样品保存在 20 RT PCR方法 PCR 50mlPCR体系的组成 PCR反应条件 94 5分钟 94 1分钟退火温度55 40秒72 50秒29个循环72 10分钟 RT PCR中的对照 RT PCR中的对照 在RT PCR中经常使用在不同组织以及不同发育时间段中表达稳定并且均一的基因作为对照 经常