【硕士论文】桑根酮C提取分离工艺的研究.pdf

摘要 桑根酮C 提取分离工艺的研究 摘要 桑根酮C 是具有降血压 抑菌 治疗心脏病和动脉粥样硬化作用 的单一化合物 其中降血压作用尤为明显 通过对桑白皮中抑制酪氨 酸酶的活性成分追踪和分离 发现桑根酮C 为桑白皮中最主要以及活 性很强的成分 而酪氨酸酶是皮肤黑色素生成的限速酶 故桑根酮C 也可作为一种新的添加剂 运用于美白化妆品行业中 以桑叶 桑果渣和桑白皮为提取对象 比较提取产物中桑根酮C 的含量 筛选最佳的提取桑根酮C 的活性部位 结果表明桑白皮提取 物中桑根酮C 的含量较高 而桑叶和桑果渣中基本不含桑根酮C 故 确定桑白皮作为最佳提取部位 在此基础上 考察不同提取方法对提 取物中桑根酮C 含量的影响 通过对提取物浸膏得率和产物纯度两个 指标综合考虑 确定微波提取为最佳提取方法 以提取物中桑根酮C 的提取物浸膏得率和产品纯度为评价指标 考察桑白皮微波提取工艺对提取桑根酮C 的影响 分别探讨了提取溶 剂乙醇的浓度 提取时间 微波功率和液料比对浸膏得率和产品纯度 的影响 在此基础上设计了4 因素3 水平的正交实验 实验结果经过 方差分析 表明影响浸膏得率的主要因素是乙醇浓度 而影响产品纯 度的主要因素是液料比 正交实验得到桑白皮微波提取桑根酮C 的最 佳提取工艺 桑白皮用浓度为9 0 的乙醇在6 0 微波提取2 次 每 次l O m i n 液料比为1 0 1 微波功率为6 0 0 W 以此提取工艺重复提 北京化工大学硕 研究生学位论文 取 提取物平均浸膏得率为2 1 6 0 平均产品纯度为2 5 3 研究了不同大孔吸附树脂对于桑根酮C 的吸附和解吸特性 确定 了最佳树脂为A B 8 优化了吸附与解吸附工艺条件 吸附流速为 3 B V h 上样液浓度为0 5 8 m g m l 解吸液流速为6 B V P a 体积为6 B V 分步洗脱条件为2 B V 的4 0 乙醇溶液洗脱除杂 然后分别以2 B V 的 5 0 和6 0 乙醇洗脱 在此工艺条件下 桑根酮C 的回收率为8 4 7 8 纯度为3 8 8 7 对桑白皮微波提取液和树脂5 0 乙醇洗脱液进行了纳滤浓缩实 验 考察了溶质浓度对截留率和通量的影响 发现纳滤膜 S T A R M E M T M1 2 2 对桑根酮C 的粗提物溶液和5 0 L 醇洗脱液均有着 很好的截留性能 为桑根酮C 的浓缩精制以及后续纯化提供了很好的 条件 采用制备高效液相色谱对树脂5 0 乙醇洗脱组分进行了纯化精 制 并对各步所得产物进行抑制酪氨酸酶活性的测定 其中树脂5 0 乙醇洗脱组分对酪氨酸酶的抑制率为9 7 4 8 活性优于传统的酪氨 酸酶抑制剂 为研究天然美白化妆品的配方提供了理论依据 关键词 桑根酮C 桑白皮 微波提取 大孔吸附树脂 纳滤 H S T U D I E SO NE X T R A C T I O NA N DS E P A R A T I o No F S A N G G E N O NC A B S T R A C T S a n g g e n o nC h a saw i d ev a r i e t yo fp h a r m a c o l o g i c a la c t i v i t i e s s u c h a sa n t i m i c r o b i a la c t i v i t ya n dl o w e r i n gb l o o dp r e s s u r e A n di tc a nc u r et h e h e a r td i s e a s ea n da t h e r o s c l e r o s i s S a n g g e n o nCh a sa l s oe x h i b i t e d s i g n i f i c a n t l yi n h i b i t o r ye f f e c to nm e l a n o g e n e s i sa n da n t i o x i d a n t i v ee f f e c t I tc a nb ea l s ou s e di nc o s m e t i ci n d u s t r y T h ec o n t e n t so fs a n g g e n o nCi ne x t r a c t sf r o ml e a v e s m u l b e r r ya n d r o o tc o r t i c e so fm u l b e r r yw e r ed e t e r m i n e d T h er e s u l tw a st h a tt h er o o t c o r t i c e so fm u l b e r r yw e r et h eb e s tr e s o u r c e T h ee f f e c to fe x t r a c t i o n t e c h n o l o g yo ns a n g g e n o nCf r o mr o o tc o r t i c e so fm u l b e r r yw a ss t u d i e d w i t ht h ey i e l da n dt h ep u r i t yo ft h ee x t r a c t su s e da se v a l u a t i n gi n d e x e si n t h ed i s s e r t a t i o n T h eb e s tt e c h n o l o g yw a sm i c r o w a v ea s s i s t e de x t r a c t i o n T h ee f f e c t so fe t h a n o lc o n c e n t r a t i o n e x t r a c t i o nt i m e m i c r o w a v e p o w e ra n dt h er a t i oo fs o l v e n tt os o l i do nt h ey i e l da n dt h ep u r i t yo ft h e e x t r a c t sw e r er e s e a r c h e di nt h ee x p e r i m e n t T h e no r t h o g o n a ld e s i g nw a s u s e df o rt h er e s e a r c h F r o mt h ev a l u eo fv a r i a n c ea n a l y s i s t h em a x i m a l f a c t o rt h a ti m p a c t st h ey i e l do fe x t r a c t sw a st h ee t h a n o lc o n c e n t r a t i o n I I I 北京化T 人学颂1 研究生学位论文 w h i l et h em a i nf a c t o ri m p a c t i n gp u r i t yw a st h er a t i oo fs o l v e n tt os o l i d T h eo p t i m u me x t r a c t i o np r o c e s sw a sa sf o l l o w s t h er o o tc o r t i c e so f m u l b e r r yw e r ee x t r a c t e db y9 0 e t h a n o la t6 0 Cf o r2t i m e s e a c ht i m e f o r10m i n u t e s T h er a t i oo fs o l v e n tt os o l i di S10 1 a n dt h em i c r o w a v e p o w e ri s6 0 0 W I nt h i sc o n d i t i o n t h er e s u l ts h o w st h a tt h ea v e r a g eo f y i e l dw a s2 1 6 0 a n dt h ea v e r a g eo fp u r i t yw a s2 5 3 f o rr e p e a t e x p e r i m e n t T h ea d s o r p t i o na n dd e s o r p t i o n p r o p e r t i e s o fs a n g g e n o nCo n m a c r o p o r o u s r e s i n sw e r ec o m p a r e d A B 8r e s i n d i s p l a y e dt h e b e s t a d s o r p t i o na n dd e s o r p t i o nc a p a c i t i e sb a s e do nt h er e s e a r c hr e s u l t s B o t h L a n g m u i ra n dF r e u n d l i c hi s o t h e r m sw e r eu s e d t od e s c r i b et h ei n t e r a c t i o n s b e t w e e nt h es o l u t e sa n dr e s i n sa td i f f e r e n ti n i t i a lc o n c e n t r a t i o n s D y n a m i c a d s o r p t i o na n dd e s o r p t i o ne x p e r i m e n t so nA B 一8r e s i np a c k e dc o l u m n w e r ec o n d u c t e da n dt h eo p t i m u mp a r a m e t e r sf o ra d s o r p t i o nw e r ea s f o l l o w s f l o wr a t ei s3 B V h f e e dc o n c e n t r a t i o ni s0 5 8 m g m l f o r d e s o r p t i o n e l u e n ti g6 B Ve t h a n o l w a t e r 5 0 5 0 v v f l o wr a t ei s6 B V h A f t e rt h et r e a t m e n tw i t hs t e p w i s ee l u t i o no nA B 8r e s i n t h ec o n t e n to f s a n g g e n o nCi nt h ep r o d u c ti n c r e a s e df r o m2 5 3 t o3 8 8 7 a n dt h e r e c o v e r yy i e l dw a s8 4 7 8 T h ec o n c e n t r a t i o no f9 0 a n d5 0 e t h a n o ls o l u t i o nw a s c o n d u c t e db yn a n o f i l t r a t i o na n dt h ee f f e c t so ff e e dc o n c e n t r a t i o no nf l u x a n dr e t e n t i o nw e r es t u d i e d T h er e s u l t ss h o w e dt h a tS T A R M E M T M12 2 I V A B S T R A C T g a v eh i g hs a n g g e n o nCr e t e n t i o n w h i c hi n d i c a t e dt h a tS T A R M E M T M12 2 c o u l db ea p p l i e dt oc o n c e n t r a t et h e9 0 a n d5 0 e t h a n o ls o l u t i o no f s a n g g e n o nC T h ec o m p o n e n to f5 0 e t h a n o le l u a n tf r o mt h eA B 一8r e s i nw a su s e d a sr a wm a t e r i a lf o rf u r t h e rp u r i f i c a t i o nb yp r e p a r a t i v eH P L C A n dt h e t y r o s i n a s ei n h i b i t o r ya c t i v i t yo fp r o d u c t so b t a i n e df r o me a c hs t e pw a s i s o l a t e d T h et 3 7 r o s i n a s e i n h i b i t i o nr a t eo ft h ec o m p o n e n te l u t e df r o mt h e A B 一8r e s i nw a s 9 7 4 8 w h i c hw a sb e a e rt h a nt r a d i t i o n a l i n h i b i t o r K E YW O R D S s a n g g e n o nC r o o tc o r t i c e so fm u l b e r r y m i c r o w a v e a s s i s t e de x t r a c t i o n M a c r o p o r o u sR e s i n s n a n o f i l t r a t i o n V 第一章文献综述 1 1 桑根酮C 简介 第一章文献综述 1 1 1 桑根酮C 的结构和性质 桑根酮C 分子式为C 4 0 H 3 6 0 1 2 分子量为7 0 8 结构式见图1 一l O H 图1 1 桑根酮C 的结构式 F i g 1 1 T h es t r u c t u r eo fs a n g g e n o nC H 桑根酮C 纯品为淡黄色粉末 常温下性质稳定 熔点为2 3 0 2 4 0 C 分解 属于黄酮类化合物 桑根酮C 易溶于甲醇 乙醇 二甲基甲酰胺和丙酮 可溶 于乙醚及乙酸乙酯 但难溶于水 正己烷 苯 氯仿 二氯甲烷 1 1 2 桑根酮C 的药理作用 1 降血压 桑根酮c 的药理作用主要为降血压作用f l 分别给3 0 k g 雄性家兔静脉注射 l m g k g 5 m g k g 桑根酮C 可分别使血压下降15 m m H g 1 0 0 m m H g 并且可持 续1 h 以上 另外 急性毒性实验表明 桑根酮C 的半数致死量L D 5 0 为1 3 2 m g k g 2 抑菌 S a n g g e n o nC 是抑制噬菌斑形成和龋病生成的活性组分 它对变形链球菌的 北京化工大学硕士研究生学位论文 最低抑菌浓度 I c 5 0 为2 5 1 L g m l 强于小聚碱 2 1 3 抑制花生四烯酸的代谢 3 5 桑白皮分离出的多种黄酮类化合物对大鼠血小板花生四烯酸的脂氧化酶和 环氧化酶代谢产物合成的抑制作用研究表明 桑树根皮中的活性组分S a n g g e n o n C 在1 0 3 一1 0 4 M 时通过抑制环氧化酶的形成来抑制前列腺素 P G 血栓素A 2 B 2 及1 2 一羟基 5 8 1 0 十七碳三烯酸 H T T 的合成 同时通过影响脂氧化酶来促 进1 2 H P E T E 1 2 羟基花生四烯酸 1 2 一H E T E 的形成 4 治疗心脏病 6 S a n g g e n o nC 能抑制N d C A T P a s e 从而可用于治疗心律不齐 心律失常 等心脏病 5 治疗动脉粥样硬化 6 S a n g g e n o nC 在早期动脉粥样硬化的治疗中起着重要作用 6 抑制酪氨酸酶活性 吴爽f 7 通过对桑属植物抑制酪氨酸酶活性的追踪分离 发现桑根酮C 可以抑 制酪氨酸酶的活性 从而起到抗黑色素美白皮肤的效果 桑根酮C 对酪氨酸酶的 抑制力 高于曲酸 V C 和氢醌 还能抑制酪氨酸酶相关蛋I 刍 T R R 2 多巴色素 互变酶的活性和D H I C A 氧化酶的活性 其美白效果好于熊果苷 维生素C 等产 品 1 1 3 从桑白皮中分离桑根酮C 的提取工艺0 8 I 已有文献报道了一个比较成熟的提取分离工艺 其由4 步工序构成 浸取 萃取 硅胶柱层析 制备型高效液相色谱精制 第一步 浸取 采用合适的溶剂将桑白皮中的桑根酮C 浸取出来 桑根酮C 易溶于乙醇 丙酮和乙醚 乙醇的沸点较丙酮和乙醚为高 易于回收 而且价廉 故选用乙醇作为浸取的溶剂 第二步 萃取 采用合适的溶剂将浸取得到的浸膏中的杂质 糖类 脂类 萜类等 除去 用3 种溶剂依次萃取 先用丙酮萃取以除去不溶于丙酮的多糖 然后用苯洗涤以除去溶于苯的脂类和萜类 桑根酮C 不溶于苯 最后用乙醚除去 强极性的其他杂质 第三步 硅胶柱层析 采用酸性硅胶 调整流动相的极性 得到桑根酮C 含 量较高的粗品 第四步 制备型液相色谱精制 采用C 1 8 制备柱 调整流动相极性 得到含 量为9 8 以上的桑根酮C 2 第一章文献综述 1 2 桑属植物的成分分析及生物活性 桑 M u l b e r r y 作为传统中药始载于 神农本草经 中 桑的根皮 枝叶 果 实等皆可入药 桑叶清肝明目 桑皮泻肺利水 祛风湿 桑枝利关节 补肝益肾 果实补血生津等多种药效 9 桑科桑属植物全球共有1 2 种 分布于亚洲东部和 北美洲 我国有桑属植物约9 种 迄今为止 对桑属植物的化学和药理研究主要 集中于家桑 m o r u sa l b a 鸡桑 m o r n sa u s 仃a l i s 华桑 m o r u sc a t h a y a n a 蒙桑 m o r u s m o n g o l i c a m o r r i sl h o u 等品种 药理作用集中在抗高血压 抗微生物 降血糖 抗肿瘤 抗病毒等方面 桑白皮 别名桑根皮 白桑皮 根皮 系桑科白桑属植物M o r n sa l b aL 除去 外皮的根皮 正品桑白皮在春 秋 冬季挖出桑根部 趁鲜刮去栓皮 纵向剖开 皮部 除去木质部 晒干 主要产地为安徽 河南 浙江 江苏 湖南 其它各 地均产 1 2 1 桑属植物的化学成分分析 桑的化学成分复杂 现就其主要的酚类成分及生物碱等作如下综述 1 2 1 1 酚性成分 1 黄酮类 桑属植物所含的黄酮化合物类型较多 主要有黄酮 异黄酮 二氢黄酮 二 氢黄酮醇 查耳酮等 而且有很多黄酮化合物上带有异戊烯基 异戊烯基在某些 因素的催化作用下又衍生出许多新的化合物 典型的化合物有D i e l s A l d e r 加合 物 黄酮类 桑属植物所含的黄酮化合物多含有一个或多个异戊烯基或拢牛儿基 通常在 3 6 8 3 5 位出现 有的与邻位羟基氧化成五元 六元氧杂环 5 7 2 4 位多具有羟基或是甲氧基 3 位异戊烯基还能与C 环形成六 七元环 此类化合 物有3 6 个 l o l 分别是A l b a n i n sA B C D E 环桑皮素 C y c l o m o m s i n 环桑 素 C y c l o m u l b e r r i n M u l b e r r a n o l 桑索 M u l b e r r i n 桑色烯 M u l b e r r o c h r o m e n e C o m p o u n dA O x y d i h y d r o m o r u s i n 桑根皮素 M o m s i n 桂木黄素 A r t o c a r p i n 桂木生黄素 A r t o e a r p e s i n C y c l o a r t o c a r p e s i n R u b r a f l a v o n e sA B C D 3 北京化工大学硕士研究生学位论文 O x y d i h y d r o a r t o c a r p i n I n t o g r i n C y c l o a r t o c a r p i n 异叶菠萝蜜环黄酮素 C y c l o h e t e r o p h y l l i n H e t e r o p h y l l i n I s o c y c l o h e t e r o p h y l l i n C h a p l a s i n C y d o i n t o g r i n O x y i s o e y d o i n t o g r i n 桑皮酮 K u w a n o n s A B S T A w i t r a l o n e A 桑根酮 S a n g g e n o n s J K 二氢黄酮类 从桑属植物中得到的二氢黄酮类化合物在5 7 位有羟基 3 5 有异戊烯基 或拢牛儿基 有的与邻位羟基氧化成环 此类化合物有1 0 个 分别是桑根酮醇 S a n g g e n 0 1 A K u w a n o n sD E F U 桑酮醇 K u w a n o l s C S a n g g e n o n sF H I N I I H 二氢黄酮醇类 从桑属植物中得到的二氢黄酮醇类化合物在3 3 5 有异戊烯基 有的与 C 环形成五元杂环 此类化合物有6 个 1 2 1 分别为S a n g g e n o lC D E S a n g g e n o n s A L M 查耳酮类 查耳酮类化合物只有两个 M o r a c h a l c o n eA K u w a n o l sD i 霪 D i e l s A l d e r 加合物 1 3 D i e l s A l d e r J J l 合物富有特色 多数环己烯上连有异戊烯基黄酮 异戊烯基二 氢黄酮醇 异戊烯基查耳酮类 在环己烯上形成三个手性碳 此类化合物较多 共有2 5 个 分别为A l b a n i n sF G H 桑白皮素 M o r a c e n i n D K u w a n o n sI J K L M N O Q R V W S a n g g e n o n sB C D E G O P Q T S 其它 S a n g g e n o lB K u w a n o nM S a n g g e n o nR 2 二苯乙烯类化合物及其衍生物 1 4 二苯乙烯类化合物多数属于D i e l s A l d e r 加合物 有的含有异戊烯基 多羟 基 此类化合物共有l O 个 分别为K u w a n o l sA B E K u w a n o n sP X Y Z 氧化芪三酚 O x y r e s v e r a t r 0 1 4 p r e n y l o x y r e s v e r a t r o l A l b c t a l o l 3 苯骈呋喃衍生物 苯骈呋喃衍生物是以2 苯基苯骈呋喃为基本骨架 5 7 2 4 6 位常有 异戊烯基或拢牛儿基取俐1 5 有些化合物的异戊烯基与邻位羟基形成六元 七 元杂环 有的则形成D i e l s A l d e r 加合物 类似于黄酮 此类化合物较多 共有 5 5 个 分别为桑辛素 M o r a c i n s A B C D E F G H l J K L M N O P Q R S T U V W X Y z t l 6 1 桑I t 失喃 M u l b e r r o f u r a n s A B C D F G H I J K M N O P Q R T U C h a l c o m o r a c i n 4 第一牵文献综述 C h a l c o m o r a c l n o l A l b u f u r a n sA B C A l b a n o l sA B o D h y d r o x y m o r a c i nN 双桑辛素 D i m o r a c i n 1 7 1 1 2 I 2 生物碱及其甙 桑属植物中多含四氢吡咯类生物碱 去甲莨菪烷类生物碱 六氢毗啶生物碱 及其甙 但由于其具有与糖类似的多羟基结构 2 位被还原 故多被看成含氮糖 N c o n t a i n i n gs u g a r s 此类化合物共有1 8 个 1 8 分别为1 一d e o x y n o j i r i m y c i n N m e t h y l d e o x y n o j i f i m y c i n 桑叶生物碱 F a g o m i n e 3 e p i f a g o m i n c l 4 d i d c o x y 1 4 i m i n o D a r a b i n i t o l 1 4 一d i d e o x y 1 4 i m i n o D r i b i t o l C a l y s t e g i nB 2 C a l y s t e g i n C t l 4 d i d e o x y l 4 一i m i n o 一2 0 一 一D g l u c D p y r a n s y l 一D a r a b i n i t o l 2 一O D g a l a c o p y r a n s y l 一1 一d e o x y n o j i r i m y c i n s 6 O D g a l a c o p y r a n s y l l d e o x 1 1 0 j i f i m y c i n s 2 一O 一 O g l u c o p y r a n s y l 1 一d e o x y n o j i r i m y c i n s 3 O 一 一D g a l a c o p y r a n s y l 一1 d e o x y n o j i r i r n y e i n 4 0 一 D g a l a c o p y r a n s y l 一l d e o x y n o j i r i m y c i n s 2 O 一D g l u c o p y r a n s y l I d e o x y n o j i r i m y c i n s 3 O 一D g l u c o p y r a n s y l l d e o x y n o j i r i m y c i n s 4 O 一 一D g l u c o p y r a n s y l 一1 一d e o x y n o j i f i m y c m s 6 一O 一D g l u c o p y r a n s y l 一1 d e o x y n o j i r i m y c i n s 1 2 1 3 其他类型的化合物 桑属植物所含的化合物类型较多 除酚类物质及生物碱外 尚含有甾体及三 萜化合物 如牛膝甾酮 羟基促蜕皮甾酮 谷甾醇 羽扇豆醇 菜油甾醇 豆甾 醇等 香豆素类化合物如伞形酮 羟基香豆素 挥发油及酸性成分如丁酸 缬草 酸 丁香油酸 氨基酸 脂肪酸等化合物 1 2 2 桑属植物的生物活性 1 抗高血压作用 许多药物学家一直在寻找桑白皮作为传统药物的作用机理 在分离桑属植物 有效成分的过程中 发现了许多抗高血压成分 例如 K u w a n o n sG H M 2 t g k g i v S a n g g e n o n sC D M u l b e r r o f u r a n sC F G 等成分均有较好的抗高血压作 用 1 9 1 2 抗茵和抗病原微生物作用 T a k z s u g i 等研究受伤或被病原微生物感染的桑 从中提取出许多抗病原微生 北京化工大学硕士研究生学位论文 物的成分 如A l b a n i n sA E F G M o r u s i n K u w a n o n sC E M o r u s i n K u w a n o n s C E M o r a c i n 等化合物 T a r oN o m u n a 认为 桑属植物中凡有异戊间二烯结构 的黄酮均具有抗菌作用 主要是格兰氏阳性菌及某些真菌化合物 如K u w a n o n s C J L S a n g g e n n o n sA B C 等 1 8 3 抗炎镇痛 桑白皮的甲醇提取物对组胺 5 羟色胺 缓激肽和透明质酸等诱发的皮肤浮 肿既有抑制作用又能抑制炎症引起的蛋白渗出及白细胞游走 对植如棉球诱发的 肉芽肿 甲醛及佐剂关节炎也有疗效 l9 其水溶性成分给小鼠口服后抑制醋酸 诱导的扭体反应 上述提取物的水溶部分和丁醇部分对压迫刺激有镇痛作用 2 0 1 4 抗病毒作用 L u oS h i d e 等报道K u w a n o nH M o r a c i n 有抗H I V 作用 T a r oN o m u r a 等报道 O x y d i h y d r o m o r u s i n C h a l e o m o r a c i n C o m p o u n dA 有很强的抗鼻病毒的作用 2 l 5 降血糖作用 F u j u nC h e n 等报道2 0 XDg a l a e t o p y r a n c o s y l D N J F a g o n i n e 1 4 d i d e o x y 1 4 i m i n o D a r a b i n i t o l D A B 等均有降血糖作用 1 9 1 一般认为作用机制为抑制葡 萄糖苷酶活性 其中F a g o m i n e 能显著提高唾液中蛋白含量 对糖尿病症状有显 著改善作用 2 2 1 6 抗癌作用 T a r oN o m u r a 报道M o r a e i n K u w a n n o n sG M M u l b e r r o f u r a nG S a n g g e n o n D 能抑制p r o t e i nk i n a s eC 的活性 其中M o r a c i n 有显著抑制小鼠皮肤肿瘤的生长 作用 2 l 桑属植物的研究曾在上世纪七 八十年代掀起一个高潮 日本学者T a r o N o m u r a 1 3 领导的一个研究小组做了许多工作 发现了许多酚类的新化合物 其 中有降压作用的黄酮 抗菌作用的苯骈呋喃等化合物 八十年代后期以来 人们 又对桑的水提物进行研究 从中发现含多羟基生物碱类有较好的降血糖作用 其 作用机理为抑制小肠a 葡萄糖苷酶的活性 从而抑制双糖向单糖的转化 达到降 低和控制血糖的目的 根据这一作用机理 9 0 年代后期 桑枝已被研制成了治 疗糖尿病的药物 目前 围绕着桑属植物降血糖作用的化学和药理研究仍在继续 从而展示了在寻找先导化合物方面的广阔前景 1 3 黑色素的形成 存在于黑色素细胞组织中的酪氨酸在酪氨酸酶等酶的作用下经多巴 多巴 醌 多巴色素 二甲基吲哚等中间体逐步转化为黑色素 在此过程中 酪氨酸酶 6 第一章文献综述 可传递0 2 并通过0 2 的引发和酪氨酸酶的催化作用使酪氨酸逐步氧化 最终形 成黑色素 酪氨酸酶是黑色素合成的主要限速酶 该酶活性大小直接决定黑色素 合成的数量 它涉及到两类催化活性 2 3 单酚氧化酶活性 即L 酪氨酸 L t y r o s i n e 的氧化生成L 多巴 又称3 4 一二甲基苯丙氨酸 3 4 一d i h y d r o x y p h e n y l a l a n i n e 多 酚氧化酶活性 即L 一多巴的氧化生成多巴醌 D o p a q u i n o n e 其催化活性如图1 2 所示 H O C O O H 2H 2 H O 2 T y r o s i n a s e H O 酪氨酸酶 M e l a n i n 黑色素 O O C O O H J T 洳r o a s e 图l 2 黑色素合成的生化历程 F 蟾 1 2B i o s y n t h e t i cp a t h w a yo f m e l a n i n C O O H C O O H 由此可以看出酪氨酸酶在黑色素的生物合成过程中起着关键性的作用 是 皮肤黑色素合成反应的限速酶 参与决定了哺乳动物皮肤 头发的颜色 部分色 素沉着性皮肤病 如黄褐斑 雀斑等 就是由于过量水平的黑色素在表皮沉积形 成 因此 可以选择应用酪氨酸酶抑制剂通过抑制酪氨酸酶的活性 阻断黑色素 的合成反应链 减少其在皮肤内的生成从而达到祛斑增白的效果 7 o 一桃巢 北京化工大学硕士研究生学位论文 1 4 酪氨酸酶抑制剂的研究进展 对于酪氨酸酶的抑制机制大概分为四类 即竞争性抑制 非竞争性抑制 混 合型抑制 缓慢结合型抑制 1 4 1 竞争性抑制物 1 壬二酸 是直链饱和二羧酸 C 9 C 1 2 为酪氨酸酶的竞争性抑制剂 为2 7 3 m m o l 1 它的抑制机制可能是它的一个羧酸基团可以与酪氨酸的羧酸基 团共同竞争酶的活性位点 壬二酸能抑制酪氨酸酶活性 阻断酪氨酸酶催化多巴 到多巴醌的反应 从而阻断黑色素的细胞内合成 壬二酸有选择性的细胞毒性 影响功能活跃的黑色素细胞的生长 如恶性黑色素细胞 但对正常色素细胞没 有作用 2 熊果苷 化学名称为4 羟苯基 p D 吡喃葡萄糖苷 是从杜鹃花科的一种多 年常绿小乔木 熊果果实中提取的 它能迅速渗入肌肤 在不影响细胞增殖浓 度的同时 能有效地抑制皮肤中的酪氨酸酶活性 阻断黑色素的生成 它通过自 身与酪氨酸酶直接结合 竞争多巴的结合位点 加速黑色素的分解与排泄 从而 减少皮肤色素沉积 用2 5 0 m g 齐U 量作用人的皮肤模型发现 细胞的分化生长没有 变化 但黑色素的生成比对照组减少6 0 2 4 j 动力学研究发现它的竞争性抑制作 用是可逆的 有研究证实熊果苷对黑色素细胞酪氨酸酶家族的三种酶 酪氨酸 酶 酪氨酸酶相关蛋白 1 和酪氨酸酶相关蛋白 2 的含量及分子大小均无影响 因 此认为熊果苷是在转录后阶段抑制酪氨酸酶活性的 2 5 这些研究表明 熊果苷 使用的安全性较高 3 黄酮类化合物 包括栎精 高良姜精 桑色素 毛地黄黄酮 非瑟酮等物 质 通过研究其对黑色素生成过程中多巴氧化成多巴醌的反应 发现这类化合物 对酶具有可逆性的抑制作用 反应动力学研究其抑制效应 莱一伯标示图表明黄 酮类化合物多为竞争性抑制剂 但是例外的是 毛地黄黄酮却是非竞争性抑制剂 比较不同物质的作用效果 其抑制作用从大到小依次是栎精 高良姜精 桑色素 非瑟酮和毛地黄黄酮 2 州 4 苯甲醛类取代物 4 苯甲醛作为一种酪氨酸酶抑制剂具有与传统的竞争型 抑制剂相似的功能 它可以抑制酪氨酸酶催化的多巴的氧化反应 此外 4 苯甲 醛还可以抑制酪氨酸的氧化 还有研究证实 苯甲醛肟和苯甲醛一O 烃基肟也有 微弱的抑制酪氨酸酶的作用弘 最近 日本有研究报道从药用植物 红花的培养细胞中提取了一种新的酪 第一章文献综述 氨酸酶抑制剂k i n o b c o nA 它具有抗氧化剂的作用 可以抑制从酪氨酸生成多巴 以及后者生成多巴醌两个反应阶段 并且研究发现其抑制效应随着剂量的增加而 增加 作用效果比曲酸 熊果苷都要明显 2 8 1 1 4 2 非竞争性抑制剂 1 曲酸 为吡喃酮类化合物 主要由曲霉类和青霉类等丝状真菌发酵产生的 在体外的非细胞试验中 能够有效抑制酪氨酸酶的活性 方式为非竞争性抑制 它可以通过螯合铜离子 而使酪氨酸酶失活 同时 它也可抑制从多巴色素到 5 6 二羟基吲哚 2 一羧酸 由酪氨酸酶相关蛋白 2 催化 的互变反应 因此也是一 种酪氨酸酶相关蛋白 2 抑制剂 曲酸以一种非传统方式抑制酪氨酸酶的活性 抑 制的初始速度在几分钟后降低到一个稳定值 这种时间依赖性不会随着酶与抑制 剂的优先结合而改变 近年来 由于曲酸在空气中易氧化 在制备中不稳定 使 研究方向转向了一些曲酸类衍生物如曲酸二棕榈酸酯等 2 茴香酸 是从常用的一种食物香料 茴香子中提取出来的 作为一种酪 氨酸酶抑制剂 它抑制了酪氨酸酶对多巴的氧化作用 研究发现茴香酸随着酶功 能的改变呈现可逆性的变化 方式为非竞争性抑制 同时 它也有抑制酪氨酸氧 化的作用 以及降低酶的稳定性等功能 2 9 J 目前发现从茴香子中还可以提取5 羟甲基 2 糠醛 通过抑制反应动力学研究 发现其也可以通过非竞争性方式 抑制酪氨酸的氧化反应 3 4 一羟基 3 甲氧基肉桂酸 是从白头翁根中提取出来的 针对酪氨酸酶对多 巴的氧化作用 以非竞争性抑制方式影响多巴醌的生成 研究者将之与几种苯乙 烯酸衍生物和酪氨酸酶抑制物 茴香醛 茴香酸 苯甲酸 苯甲醛 肉桂酸 肉桂醛比较 4 羟基一3 甲氧基肉桂酸抑制酪氨酸酶活性的效果要更好一些1 3 0 l 另外 对苯甲醛 肉桂醛的研究表明 醛基易与巯基 氨基或羟基等亲核性基团 结合 增加了抑制作用 实验也证实了茴香醛要比茴香酸更有效 1 4 3 混合型酪氨酸酶抑制剂 1 芦荟素 作为一种皮肤脱色剂 芦荟素越来越成为化妆品研究的热点 它 本身是一种混合型抑制剂 通过多种途径的作用方式来抑制酪氨酸酶的活性 与 芦荟素相似的还有苯乙烯酸 作为天然化合物 研究发现苯乙烯酸的抑制作用相 对于其他种类的抑制剂要更强一些 3 1 2 氢醌 作为传统的酪氨酸酶抑制剂 氢醌通过作用于酪氨酸酶的组成氨基 9 北京化T 大学硕士研究生学位论文 酸 使酪氨酸酶失活 是一种混合型抑制剂 近来发现有一种物质 扁柏素 2 羟基 4 异丙基苯甲醛 它可以和酪氨酸酶的主要氨基酸区域形成席夫碱 从 而抑制了酪氨酸酶的活性 作用机制与氢醌有相似之处 3 2 1 但是由于发现氢醌 对黑色素细胞具有高度毒性作用 容易引起皮肤毒性反应 此外 它本身会引起 黄褐斑 因此在临床方面 作为一种脱色剂 它已经被逐渐禁止使用 1 4 4 缓慢结合型酪氨酸酶抑制剂 缓慢结合型抑制属于非经典模式的抑制 1 4 位取代的间苯二酚 其抑制机制以存在一个长的缓冲阶段为特征 抑制 剂存在时的酶促反应过程曲线显示 随抑制剂浓度的增大 反应初速及稳定时的 速度都会减少 动力学分析证实的抑制机理为 酶与抑制剂快速的形成E I 复合物 然后经历一个缓慢的可逆异构化过程 形成的E o x y I 越多 抑制效果越好 研究 其抑制机制可知 抑制剂不与酶的还原型结合 而只与其氧化型结合 在氧化型 酶的存在下 双酚底物两次与酶的结合完成了一个反应循环 氧化型酶在此循环 中是专一性的媒介 底物对此缓慢结合型抑制的循环也是必需的 因此 此抑制 过程有别于经典的抑制模式 它要在一个酶促反应循环中才能显示出抑制剂的作 用 3 3 2 环庚三烯酚酮 它与酶形成的E I 复合物迅速形成后会经历一个缓慢的可逆 异构化过程 缓冲阶段 增大抑制剂浓度会引起产物积累的初速及稳态速率下 降 3 4 1 此外 P e r e z G i l a b e r t 等 3 5 研究了二甲基硫化物对酪氨酸酶活性的影响 结果 表明该化合物能抑制酪氨酸酶活性 呈现出缓慢抑制特性 1 5 桑属植物对酪氨酸酶的抑制作用 桑属植物主要成分多以酚性成分为主 其分子结构含有多个还原性羟基 O H 的功能基团 研究表明 桑提取物是有效 天然的多种自由基清除剂和抗 氧化剂 桑叶提取物参与调节和提高超氧化物歧化酶 谷胱甘肽过氧化物酶等抗 氧化酶活力 同时可直接清除O O H 脂质过氧化自由基等 桑提取物对酪氨酸酶活性的抑制机制可能为以下几点 3 6 1 桑提取物及时清除了过氧自由基从而终止了自由基链的引发 减弱了酪氨 酸氧化 桑提取物作为抗氧化剂可拮抗氧对酪氨酸酶激活 1 0 第 章文献综述 桑提取物结构中的 O H 具有孤对电子可与酪氨酸酶分子中的C u 2 络合 影响酶的活性 虽然桑科植物用于中药美自已有相当久的历史 如山桑 M o r u sb o m b y c i c 桑l 兰t M o r u sa l b a 等 主要是采用树皮或树根 不同种类的桑树含有不同比例的 有效成分 1 9 9 6 年韩国学者发表了对近3 0 0 种植物萃取物对酪氨酸酶的抑制作 用的研究证实了M o r u sa l b a 的有效性 3 7 同时期法国的C o t e s 公司在法国也有类 似发现精制提取的桑树精华 m u l b e r r i n 对酪氨酸酶有很强的抑制作用 B a u r i n 等 人 3 8 1 研究了分布于3 8 个属的6 8 种热带植物对酪氨酸酶的抑制活性 结果表明 马齿 桑叶等对酪氨酸酶的抑制作用明显 刘之力等 3 9 在研究5 4 种中药乙醇提取物对酪氨酸酶的抑制作用时 发现在 1 3 种对酪氨酸酶有抑制作用的提取物中 桑椹排在第五位 说明在桑椹中也存 在有对酪氨酸酶有抑制作用的物质 有关其有效成分的确定 目前各类文献中存在两类物质与其酪氨酸酶活性抑 制相关 一类是黄酮类物质 有文献报道查耳酮类和二氢黄酮类的物质对酪氨酸 酶活性有抑制作用 另一类是二苯乙烯类化合物 4 0 1 如o x y r e s v e r a t r o l 2 3 4 5 t e t r a h y d r o x y s t i l b e n e 目前已经查明桑属植物中的黄酮类物质桑根酮C 对酪氨酸酶有很好的抑制作 用 如何优化其提取分离纯化工艺 降低其生产成本 找到合适的美白配方从而 达到工业化生产成为当前工作的重点 1 6 提取方法综述 传统提取方法是加热回流 近些年来有一些新的提取方法不断被用于中草药 有效成分的提取 如超声波提取 超临界流体 酶法提取 微波辅助提取等等 1 超声波提取 超声波是一种弹性机械振动波 它产生强烈振动 高速度 强烈的空化效应 搅拌作用 因此能破坏植物药材的细胞 使溶媒渗透到药材细胞中 从而加速药 材中的有效成分溶解 以提高有效成分的提取率 研究证明 超声提取不会改变 有效成分的结构 并且缩短了提取时问 提高了提取效率 但是目前在应用中还存在一些问题 选择不同的参数如频率 超声强度及提 取时间等 其提取率会受到一定的影响 不同的药材应根据其本身的特性 选择 不同的参数 以本法提取无需加热 因此溶剂的选择也会影响到药材的提取率 若药材中含有挥发油 则应另外