猪传染性胃肠炎pl株的分离与鉴定.doc

猪传染性胃肠炎pl株的分离与鉴定陈伯祥基金项目：甘肃省农业生物技术研究与应用项目（GNSW-2005-15）陈伯祥（1968-），男，甘肃平凉人，研究员，硕士，主要从事动物传染病和分子生物技术的研究工作。E-mail：,杨明,郭慧琳,贺奋义,常亮, 李杰,豆林涛 甘肃省畜牧兽医研究所,甘肃 平凉 744000摘要:为了调查所致仔猪发病死亡的原因,在开展了流行病学调查、临床症状观察基础上，进行了实验室PK15细胞适应性、细胞毒回归本动物试验、试剂盒检测和间接免疫荧光试验，结果均证明由猪传染性胃肠炎病毒引起，将所分离和鉴定出一株的猪传染性胃肠炎毒株，暂命名为TGEV-pl。关键词：猪传染性胃肠炎；分离；鉴定猪传染性胃肠炎(Transmissible gastroenteritis of swine, TGE)是在世界养猪国家中猪流行的一种病毒性传染病,以呕吐、严重腹泻、脱水和对2周龄以内仔猪的高致死率（100%）为特征的高度接触性传染病，对新生仔猪的危害最为严重。其病原属冠状病毒科冠状病毒属的猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus of swine, TGEV），为不分节的单股正链RNA病毒。我们从当地病亡仔猪的病料中经分离鉴定出一株猪传染性胃肠炎毒株,暂命名为TGEV-pl,为该病毒株的进一步研究奠定了基础。1.材料与方法1.1试验材料PK15细胞由本实验室保存；DMEM培养基，GIBCO生产；小牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限责任公司；96孔细胞培养板，COASTAR；山羊抗小鼠FIFT荧光抗体，Sigma公司生产；伊文思蓝，Solab公司分装；猪传染性胃肠炎高免血清，课题组自制。猪传染性胃肠炎快速诊断试剂盒及猪病毒性腹泻快速检测盒由韩国生产。病料来自甘肃省某猪场，采集病死仔猪的空肠、回肠及其内含物。1.2试验方法1.2.1病料处理将所收集的病料加灭菌石英砂研磨，按110加入灭菌生理盐水，4000rpm离心30min，取上清液，用0.22um滤膜过滤除菌，加入双抗100IU/mL4作用24h，于-20保存备用。1.2.2 病毒分离取上述处理的病料接种于PK15细胞，2d后收集，反复冻融3次后，作为下次上毒材料；连续盲传5代，观察细胞病变。1.2.3病毒的鉴定动物试验将对疑似的病毒细胞培养物经口腔接种5日龄仔猪2头，每头5ml，每日观察2次，观察其精神状态、食欲、粪便等。试剂盒检测对病料处理液用韩国生产的猪传染性胃肠炎快速诊断试剂盒及猪病毒性腹泻快速检测盒按说明书要求进行检测。免疫间接荧光法检测PK15细胞培养物病毒的培养 取生长良好的PK15细胞, 倒去培养液, 用无血清的DMEM 液洗两次, 按1% 体积的培养液加入病毒培养物, 37吸附1 h后, 加无血清DMEM 液培养, 在4872 h 出现病变后, 收获细胞培养物进行免疫荧光检测。间接免疫荧光检测 取接种病毒和未接种病毒的细胞培养物, 倾去培养上清液, 刮取培养物单层,涂于玻片上, 自然干燥后, 用预冷的丙酮液固定40m in,挥干后,用0.01mol pH7.2PBS 洗涤3 次, 每次3min, 自然干燥后, 滴加抗TGEV阳性血清液, 37湿盒作用30min 后, 用0.01molpH7.2 PBS 冲洗后, 在装有0.01mol pH7.2 PBS的3个缸内依次浸泡, 每个缸浸泡5min, 期间不时震荡几次。玻片从玻缸取出后, 用滤纸吸干, 滴加0.01%伊文思蓝稀释的荧光素标记的羊抗鼠IgG后, 将玻片放入湿盒, 37作用30min后取出, 用相同方法洗涤3 次, 挥干后, 滴加磷酸甘油封片, 镜检观察。2.结果3.1病毒的分离 经在PK15细胞上连续盲传5代后,细胞病变出现的较规律，均在培养4872 小时出现许多细胞固缩、破碎，散在分布细胞面上。当细胞面出现7080 %CPE 时收集细胞培养瓶置-20冻存，并经三次冻融后收集冻存。3.2病毒的鉴定3.2.1动物试验 5日龄仔猪经口服细胞培养物，第2d出现精神萎顿、呕吐，黄白色呕吐物，粪便变稀，呈黄绿色，到第3日出现黄绿色水样稀粪，明显脱水。处死剖检:胃内充满黄绿色液体，有凝乳块；十二指肠至空肠段肠管扩大，肠壁变薄、半透明，肠内皱褶减少，内充有大量黄白色液体。肠系膜淋巴结肿胀，淋巴管没有乳糜。心、肺、肾未见明显的肉眼病变。3.22试剂盒检测 试验猪的肠内容物和细胞培养物经处理后，用试剂盒检测呈现TGE阳性，PED为阴性。3.2.3间接免疫荧光法检测 接种疑为TGEV的PK15细胞培养物和未接种的对照PK15细胞培养物所进行间接免疫荧光试验表明，接种疑为TGEV的细胞培养物多数细胞在胞浆和细胞膜上出现黄绿色荧光，未接种的对照细胞培养物被伊文思蓝染成红色，未见有黄绿色荧光染色的细胞存在。3.小结与讨论通过对病料处理物在PK15细胞上盲传、动物试验、试剂盒检测和间接免疫荧光检测1结果综合分析显示，可以确定该猪患有猪传染性胃肠炎，分离出的毒株为猪传染性胃肠炎病毒株，暂命名为TGEV-pl。病毒分离鉴定是对病毒的进一步深入研究基础，主要通过各种检测方法确定病原的种类。自1946年猪传染性胃肠炎报道以来，世界各国进行了大量诊断技术的研究，已建立了多种诊断方法用于指导猪传染性胃肠炎的诊断2,3。猪传染性胃肠炎病毒pl株的分离过程中，结合临床症状、流行病学、病理变化等各种因素选择性采集病料，做出初步诊断后，妨进行实验室检测作以确诊，分离出一株猪传染性胃肠炎毒株。但该毒株理化特性、分子生物学等方面有待进一步深入研究。参考文献1 李丹丹,田志军,关骞,等.应用TGEV N蛋白MCAB间接免疫荧光检测TGEV的研