设备管理_培养基灭菌及发酵设备概述

第八章培养基灭菌及发酵设备 一培养基灭菌及灭菌设备培养基灭菌的目的 保证所选用的培养基没有受到其它杂菌的污染染菌产生的不良后果 灭菌的方法有 化学药剂灭菌 射线灭菌 干热灭菌 湿热灭菌 过滤除菌培养基的灭菌方式 1 湿热灭菌 2 过滤除菌3 微波灭菌 1 湿热灭菌法是利用水蒸气的热量将物品灭菌 水蒸气具有穿透能力强 易于传导热量的优点 湿热更容易将微生物细胞中蛋白质的氢键打断 使其发生变性凝固 优点 经济 快速不同微生物菌株 所需湿热灭菌的温度和时间不一样 多数细菌和真菌营养体在60 左右 5 10min死亡 真菌和酵母菌的孢子 80 以上才会死亡 嗜热脂肪芽孢杆菌的芽孢在121 12min才能死亡 常见的湿热灭菌有以下几种 1 常规加压灭菌法因无法了解待灭菌培养基中微生物的热致死特性 常假设杂菌是嗜热脂肪芽孢杆菌的芽孢 灭菌工艺是0 1MPa 维持15 30min 灭菌是靠温度 2 连续灭菌法3 巴斯德消毒法一般60 80 15s 30min 现在超高温巴斯德灭菌法 140 3 4s 急剧冷却至75 4 间歇灭菌法 80 100 15 60min 室温过夜 重复三次 2 过滤除菌法含有酶 血清 维生素 氨基酸等容易热失活的培养基 可以采用此法 过滤介质有膜材料 醋酸纤维素 硝酸纤维素 聚醚砜 尼龙 聚丙烯腈等深层过滤材料 石棉板 烧结陶瓷 烧结金属等过滤器主要有两类 绝对过滤器 过滤介质呈膜状 滤孔比要除去的颗粒直径小 理论上可以完全除去微生物 去除机制为拦截作用 另一类是深层过滤器 空隙的直径比要除去颗粒的直径大 由毡毛 棉花 石棉和玻璃纤维组成 工作机制是通过惯性碰撞 扩散和吸附作用除菌 过滤介质有两类 一类是棉花纤维 玻璃纤维 合成纤维和颗粒状活性炭等 要填充在一定的容器中定形 一类是已制成板状或管状 如石棉板和烧结材料等 实验室常用的滤器孔径是0 45微米和0 22微米 3 微波灭菌法主要是利用微波 300MHz 3000GHz的电磁波 是无线电波中一个有限频带的简称 即波长在0 1毫米 1米之间的电磁波 的热效应微生物在微波电磁场的作用下 吸收微波的能量 产生热效应 同时微波造成分子的加速运动使细胞内部受到损害 从而导致微生物死亡 特点 加热均匀 热能利用率高 穿透能力强 加热时间短 主要内容一 空罐灭菌二 灭菌有关理论三 分批灭菌四 连续灭菌 一 空罐灭菌 1 目的 1 消除罐内死角 确保下一批发酵的成功2 杀灭与罐直接相通的各管路 阀门的微生物3 杀灭上批发酵的活的微生物 减轻环境污染 2 步骤 热蒸汽法 1 先彻底清洗 作用 a 有利于消除死角b 免于料受热 尤其是干热的部位 干焦于罐体 管或阀门 2 从底部通入蒸汽 3 排冷气 4 升压打开各个需灭菌的管路 放气阀等 如接种管 取样管 空气进管 流量计等 5 保压通常1kg cm2 30 60min 6 降温关闭各放气阀 切断汽源 慢慢放气 或自然冷却 或泵循环水加速冷却 Notes a 确保无死角产生b 也可采用甲醛蒸煮或熏蒸的方法c 勿激碎视镜 二 培养基灭菌的有关理论 一 加热灭菌原理 1 微生物的热阻 每一种微生物都有一定的生长温度范围 当微生物处在最低生长温度以下 代谢作用几乎停止 而处于休眠状态 当温度超过最高限度时 细胞中原生质体和酶的基本成分就发生不可逆的变性 使微生物死亡 某些微生物对湿热的相对热阻 与大肠杆菌比较 不同种类微生物对热的抵抗力不同 微生物对热的抵抗力称为热阻 heatresistance 下面介绍与热阻相关的几个概念 1 致死温度 Deathtemperature 杀死微生物的极限温度称为致死温度 2 热力致死时间 ThermalDeathTime TDT 在特定条件 特定温度下 杀死某种微生物所需的最短时间 e g伤寒杆菌58 30min变形杆菌55 60min 3 D值 利用一定温度进行加热 90 的活菌被杀死时所需的时间 min 即为D值 又称1 10衰减时间 D D 10min 0102030405060 加热时间 min 105 104 103 102 10 106 残存活细胞数 残存活细胞曲线 例 含有某种细菌的悬液 含菌数为105 ml 在100 212 F 的水浴温度中 活菌数降低到104 ml时所需的时间为10min 则该菌的D值即为10min D100 10min如果加热的温度为121 则常写成Dr 4 Z值 在加热致死时间曲线中 加热时间缩短90 所需升高的温度 即为Z值 100115 100 10 加热时间 min 加热温度 加热致死时间曲线 Z Z 15 2 微生物的热死规律 对数残留定律 微生物的热死是指微生物的受热失活 但物理性质不变 微生物虽然是一复杂的高分子体系 但受热死亡是由于蛋白质变性所致 在一定温度下 微生物热死遵循分子反应速度理论 对数残留定律的概念 数学表达式 dN d N N 培养基中活的微生物个数 时间 s 比死亡速率 s 1 死亡速率常数 dN d 微生物的瞬间变化率 即死亡速率 对微生物进行湿热灭菌时 培养基中的微生物受热死亡的速率与残存的微生物数量成正比 这就是对数残留定律 若开始灭菌 0 时 培养基中活的微生物数为N0 2 303logN0 N dN d N lnN N0 积分 2 303logN0 N or 2 303lgN0 N 可见灭菌时间取决于污染程度 N0 灭菌程度 残留菌数N 和 值 在培养基中有各种各样的微生物 不可能逐一加以考虑 一般只考虑芽孢细菌和细菌的芽孢数之和作为计算依据 灭菌程度 即残留菌数 如果要求完全彻底灭菌 即N 0 则 为 上式无意义 事实上也不可能 一般取N 0 001 即1000次灭菌中有1次失败 例 有一发酵罐内装40m3培养基 在121 温度下进行实罐灭菌 原污染程度为每ml有2 105个耐热细菌芽孢 121 时灭菌速度常数为1 8min 1 求灭菌失败几率为0 001时所需的灭菌时间 3 死亡速率常数 比死亡速率 死亡速率常数 是微生物耐热性的一种特征 它随微生物种类和灭菌温度而异 相同温度下 值越小 则此微生物越耐热 在121 细菌芽孢的 值约为1min 1 而营养细胞的 值为10 1010min 1 121 某些细菌芽孢的 值 4 培养基灭菌温度的选择 培养基灭菌过程中 除微生物被杀死外 还伴随着培养基成分被破坏 在加热下氨基酸 维生素等受破坏 培养基灭菌时 必须选择既能达到灭菌目的 又能使培养基成分破坏减至最少的条件 灭菌过程微生物死亡属于一级反应动力学类型 从对数残留定律表达式可知 在其它条件不变时 比死亡速率 与温度的关系可用阿仑尼乌斯方程式表示 SvanteAugustArrheniuswasaSwedishphysicalchemistbestknownforhistheorythatelectrolytes certainsubstancesthatdissolveinwatertoyieldasolutionthatconductselectricity areseparated ordissociated intoelectricallychargedparticles orions evenwhenthereisnocurrentflowingthroughthesolution In1903hewasawardedtheNobelPrizeforChemistry Ae RT E Arrheniusequation A 比例常数 E 杀死细菌所需的活化能 E 4 18J mol T 绝对温度 K R 气体常数 1 978 4 18J mol K e 2 71 exp Ae RT E lg lgA E 2 303RT 以lg 对1 T作图 得一直线 其斜率为 E 2 303R 截距为lgA 从斜率和截距科求得A和E值 1 T lg 截距 lgA 斜率 E 2 303R 培养基成分受热破坏是化学分解反应 为一级动力学反应 dC d C C 对热不稳定物质的浓度 mol L 分解速率常数 s 1 分解反应时间 s 随反应物质种类和温度不同在化学反应中 其他条件不变 和温度的关系也可用阿仑尼乌斯方程表示 A e RT E A 比例常数 E 分解活化能 E 4 18J mol T 绝对温度 K R 气体常数 1 978 4 18J mol K e 2 71 exp 1 Ae RT1 E 2 Ae E RT2 相除取对数 ln 2 1 E11 RT1T2 在灭菌时 当温度变化 菌死亡速率常数 和培养基成分破坏速率常数 都变化 温度由T1升高到T2 值分别为 同样 灭菌时培养基成分的破坏也可得类似关系 ln 2 1 RT1T2 E 11 ln 2 1 ln 2 1 E E 上面两式相除 得 由于灭菌的E大于培养基成分分解的E 因此ln 2 1 ln 2 1 即随着温度的上升 灭菌的速度常数的增加倍数大于培养基成分破坏的增加倍数 或者说 当灭菌温度上升时 微生物杀灭速度的上升超过培养基成分破坏的速度 根据这一理论 培养基灭菌采用高温短时间的方法 有利于减少营养成分的破坏 二 影响培养基灭菌的主要因素 1 微生物热阻 前述 2 pH 微生物在pH6 0 8 0范围内耐热性最大 pH低于6 0时 氢离子极易渗入微生物细胞 从而改变细胞的生理反应而促进其死亡 故培养基酸度愈高 则所需的杀菌时间愈短 影响培养基灭菌的主要因素 continued 温度孢子数灭菌时间 min 个 ml pH 6 15 35 04 74 5120100008753311510000252516131311010000706535302410010000740720180150150 pH对灭菌时间的影响 影响培养基灭菌的主要因素 continued 3 菌的浓度 浓度越高 所需灭菌时间越长 例如 如肉毒梭状芽孢杆菌 在105 湿热灭菌时间芽孢杆菌数 ml时间 min 9 108489 106369 104209 1021492 影响培养基灭菌的主要因素 continued 4 培养基成分 油脂 糖类及一定浓度的蛋白质会增加微生物的耐热性因高浓度有机物会环绕细菌的四周形成一层薄膜 影响热的传入 而高浓度的盐类 色素等则削弱其抗性 影响培养基灭菌的主要因素 continued 5 泡沫泡沫中的空气形成隔热层 使热量难以渗透进去杀死其中潜伏的微生物 易产生泡沫的培养基在灭菌时 可加入少量消泡剂 6 颗粒颗粒小 灭菌容易 颗粒大 灭菌难 影响培养基灭菌的主要因素 continued 三 分批灭菌 实罐灭菌 一 操作 1 在进行培养基灭菌之前 通常应先把发酵罐的分空气过滤器灭菌并用无菌空气吹干 若已先行空罐灭菌 此步可不进行 2 预热 向夹套或蛇管中通入蒸汽 间接将培养基加热至70 左右 作用 利于糊化 减少冷凝水的生成 减轻噪音 有的工厂省却此步 需通过试验掌握冷凝水的生成量 确保培养基的浓度 3 开启蒸汽管 向培养基中通入蒸汽 升温 4 罐压达1kg cm2 0 1MPa 时 安装在发酵罐封头的接种管 补料管 消泡剂管等应排汽 升温阶段 5 保温调节好各进汽和排汽阀门 使罐压和温度保持在一稳定水平 维持一定时间 在保温阶段 凡进口在培养基液面下的各管道都应通入蒸汽 在液面上的其余管道则应排放蒸汽 这样才能保证灭菌彻底 不留死角 保温阶段 6 保温结束后 依次关闭各排汽 进汽阀 待罐内压力降至0 5kg cm2左右时 向罐内通入无菌空气 向夹套或蛇管中通入冷水 使培养基降至所需温度 通入无菌空气的作用 加速降温 保持罐内正压 降温阶段 A B C D 升温保温降温 小型罐升降温快 可忽略 但大型罐不可忽视 min 二 灭菌时间的计算 V V加热 V维持 V冷却 RT2 E 2RT V加热 t加热 T T0 E2 RT2 E 2RT V冷却 t冷却 T T0 E2 R 气体常数 1 986 卡 克分子 K E 耐热孢子致死的活化能 65000 卡 克分子 T 灭菌维持温度 121 393K T0 开始计算灭菌效果的温度 100 373K 例 1 小型发酵罐在120 灭菌维持15分钟 由100 100 以下灭菌效果不计 加热至120 的时间为5分钟 由120 冷却到100 的时间为3分钟 计算总的灭菌时间 1 986 3932 65000 2 1 986 393 V加热 5 1 15 393 373 650002 1 986 3932 65000 2 1 986 393 V冷却 5 0 69 393 373 650002 V V加热 V维持 V冷却 1 15 15 0 69 16 6 min 例 如果灭菌条件不变 大罐由 加热到 需 分钟 冷却至 的时间为 6分钟 求大罐的维持时间 1 986 3932 65000 1 986 393 V加热 V冷却 393 373 650002 min 则大罐维持时间V维持 V V加热 V冷却 16 6 9 2 7 4min 在不同规模的发酵罐中达到同样灭菌效果所需时间 发酵罐规模 升 维持时间 分 20017 550012 6500011 3500008 8 三 分批灭菌的优缺点 优点 不需专门的灭菌设备 投资少 设备简单 灭菌效果可靠 对蒸汽的要求较低 一般3 4kg cm2即可满足 缺点 在灭菌过程中蒸汽用量变化大 造成锅炉负荷波动大 中小型罐经常采用 四 培养基的连续灭菌 连消 将配制好的培养基在向发酵罐输送的同时加热 保温和冷却 进行灭菌 温度 时间 min 12124 81304 11380 721460 141540 0291630 0061 灭菌时间与温度的关系 以杀死细菌芽孢为准 一 连续灭菌流程 1配料罐3连消装置4维持罐6冷却装置 配料罐 兼作预热 输料泵 连消塔 器 维持罐 管 冷却器 发酵罐 连续灭菌流程 1 预热 可在专门的预热罐 也可用配料罐兼作 温度 一般预热至70 左右 预热的物料用泵泵入连消装置 输料泵 常用旋涡泵 往复泵 螺杆泵 旋涡泵 往复泵 螺杆泵 2 加热 常用连消装置有三类 套管式连消器汽液混合式连消器喷射式加热器 物料泵入加热器 培养基与蒸汽混合 温度迅速上升至130 140 套管式连消塔 上疏下密 45 小孔 孔径6毫米左右 培养液流动线速度小于0 1m s 在管内逗留时间为15 20秒 汽液混合式连消器 1喷嘴2吸入口3吸入室4混合喷嘴5混合段6扩大管 喷射加热器 3 保温 保温设备 维持设备 保温材料包裹 两种形式 罐式 管式 1 维持罐 连续灭菌时 关2开1 预热罐中的物料输送完后 关1开2 培养基的平均停留时间 V FM 平均停留时间 s V 维持罐的体积 m3 FM 培养基的流量 m3 s Note 培养基在维持罐的流动不可能非常均匀 可能产生沟流 造成一部分培养基在罐内的停留时间少于平均值 为保证灭菌彻底 在设计罐式维持器时 通常取平均停留时间的3 5倍 经验 在灭菌温度为130 时 实际平均时间可取10分钟 在140 时则可取3 4分钟 2 管式维持器 在设计管式维持设备时 须采用停留时间分布的概念 而不能采用单纯的停留时间 圆管内不同流动形式流体的速度分布情况 湍流Vaverage 0 82Vmax 活塞流Vaverage Vmax 粘滞流Vaverage 0 5Vmax 在管式维持器中 若培养基流动为活塞流 可根据维持管的内径 培养基的流量求出管长 但实际上培养基不可能呈活塞流 当培养基处于粘滞留状态时 管内速度呈抛物线 管中心部位的最大流速为平均流速的2倍 若以平均流速确定管长 则会造成边缘部分的培养基过热 加热过长 确定维持管的长度 应采用扩散模型 Dispersionmodel 复杂 略 4 冷却 喷淋冷却器板式冷却器真空冷却器 喷淋冷却器 结构简单 广泛使用 板式换热器 体积小 换热效率高 但流动阻力较大 板式换热器 板式换热器 板式换热器原理图 喷射加热 真空冷却连续灭菌系统 二 连续灭菌的优缺点及注意事项 1 可采用高温短时灭菌 培养基受热时间短 营养成分破坏少 有利于提高发酵产率 2 蒸汽负荷均衡 锅炉利用率高 操作方便 3 适于自动控制 降低劳动强度 缺点 设备复杂 投资大 优点 连消注意事项 1 连消前 应先进行空罐 维持罐 管 冷却系统的灭菌 2 确保管路无渗漏 3 当培养基含有较大固体颗粒或有较多泡沫时 采用连消容易发生灭菌不彻底 思考题 1 为什么培养基灭菌 湿热灭菌 一般采用高温短时灭菌 2 培养基连续灭菌的设备有哪些 按安装顺序 二发酵设备 发酵设备是微生物工程中最重要的设备之一 一个优良的培养设备应该具备的条件 1 严密的结构2 良好的液体混合性能3 高的传质和传热速率4 可靠的检测及控制仪表 发酵罐的分类 厌氧发酵罐和好氧发酵罐好氧发酵罐分为通风和搅拌式按能量输入方式可分为三类 1 内部机械搅拌型发酵罐2 外部液体搅拌型发酵罐3 空气喷射提升式发酵罐 1 机械搅拌发酵罐利用机械搅拌器的作用 使空气和发酵液充分混合 满足的要求 1 适宜的高径比2 能承受一定压力3 通风装置