第07章 痘病毒科(Poxviridae).doc

此文档收集于网络，如有侵权，请 联系网站删除第七章 痘病毒科(Poxviridae)一、概述 三、早、晚期转录二、痘病毒基因组结构 四、痘病毒的繁殖（一）DNA末端的发夹结构 五、重组痘苗病毒（二）DNA末端的倒置重复序列 （一）重组痘苗病毒的基本原理（三）痘病毒基因组的保守区与变异区 （二）进行重组痘苗病毒必要条件（四）我国痘苗病毒天坛株DNA结构的基本特征 （三）几种可能的重组痘苗病毒活疫苗（五）痘病毒基因变异株 （四）重组痘苗病毒表达活性多肽（六）痘病毒基因组的多肽编码区 主要参考文献（七）痘苗病毒基因组表达调节的特点 一、 概 述 痘病毒科是一大群长方形或卵圆形病毒，长方形粒子长220450nm，宽140260nm，厚140260nm。卵圆形粒子长250300nm，直径160190nm。病毒粒子由1个核心、2个侧体和2层脂质外膜组成，是动物病毒中体积最大、结构最复杂的病毒。痘病毒在宿主细胞的胞浆内增殖，这在DNA病毒是独特的。根据病毒的特征、自然宿主和特异性抗原，痘病毒分为两个亚科，即脊索动物痘病毒亚科和昆虫痘病毒亚科。脊索动物痘病毒亚科包括正痘病毒属、禽痘病毒属、羊痘病毒属、兔痘病毒属(粘液纤维瘤病毒属)、猪痘病毒属、副痘病毒属、软疣痘病毒属和牙塔病毒属等8个属。昆虫痘病毒亚科则只含昆虫痘病毒A、B、C 3个亚属。各属内的成员可发生遗传性重组，各属间的成员则可发生非遗传性复活。目前仍有一些未定属的痘病毒(表7-1)。 表7-1 痘病毒科分类一、脊索动物痘病毒亚科(Chordopoxrinae) 1.正痘病毒属(Orthopoxvirus) 牛痘病毒(Cowpox virus) 天花病毒(Variola virus) 痘苗病毒(Vaccinia virus) 兔痘病毒(Rabbitpox virus) 小鼠传染性脱脚病病毒(Infectious ectromelia virus) 水牛痘病毒(Buffalopox virus) 骆驼痘病毒(Camelpox virus) 马痘病毒(Horsepox virus) 猴痘病毒(Monkeypox virus) 2.禽痘病毒属(Avipoxvirus) 鸡痘病毒(Fowlpox virus) 鸽痘病毒(Pigeonpoxvirus) 火鸡痘病毒(Turkeypox virus) 金丝雀痘病毒(Canarypox virus) 麻雀痘病毒(Sparrowpox virus) 燕八哥痘病毒(Starlingpox virus) 鹌鹑痘病毒(Quailpox virus) 雪鸡痘病毒(Juncopox virus) 3.羊痘病毒属(Capripoxvirus) 绵羊痘病毒(Sheeppox virus) 山羊痘病毒(Goatpox virus) 疙瘩皮肤病病毒(Lumpy skin disease virus) 4.兔痘病毒属(Leporipoxvirus) 粘液瘤病毒(Myxoma virus) 兔纤维瘤病毒(Rabbit fibroma virus) 野兔纤维瘤病毒(Hare fibroma virus) 松鼠纤维瘤病毒(Squirrel fibroma virus) 5.猪痘病毒属(Suipoxvirus) 猪痘病毒(Swinepox virus) 6.副痘病毒属(Parapoxvirus) 羊接触传染性脓疱性皮炎病毒(Orfvirus) 假牛痘病毒(Pseudo cowpox virus) 牛脓疱性口炎病毒(Bovine pustular stomatitis virus) 新西兰红鹿副痘病毒(Parapox virus of red deer in New Zealand) 7.软疣痘病毒属(Molluscipoxvirus) 人传染性软疣病毒(Malluscum contagiosum virus) 8.牙塔痘病毒属 牙巴猴肿瘤痘病毒(Yaba monkey tumor virus)塔那痘病毒(Tanapox virus)二、昆虫痘病毒亚科(Entomopoxvirinae)昆虫痘病毒A属 蛴螬(鞘翅目)昆虫痘病毒等昆虫痘病毒昆虫痘病毒B属 摩氏蛾(鳞翅目)昆虫痘病毒等昆虫痘病毒昆虫痘病毒C属 淡黄摇蚊(双翅目)昆虫痘病毒等昆虫痘病毒 痘病毒引起人与多种动物包括禽类的疾病由持续较长时间的轻症感染，至严重的致死性感染。除犬和猫不发生痘病毒感染外。几乎各种哺乳动物都有其各自的痘病毒，但某些痘病毒可以感染几种不同的动物。1.形态结构痘病毒具有独特的形态结构，电镜下为大型长方形(如正痘病毒)或卵圆形(如副痘病毒)颗粒。中央为一个两面凹陷的核心，两个侧体分别位于凹陷内。核心是由DNA和蛋白质组成的核蛋白复合体。紧帖于核心周围的是一层栅栏状的核心膜。核心和侧体一起，由脂蛋白性表面膜包围，其间充填着可溶性蛋白。正痘病毒等的表面膜显示许多小杆状或小球状单位；副痘病毒等的表面膜上则有规律性缠绕的螺旋丝(直径为1020nm)。细胞外的病毒粒子，外面还有一层来自细胞的囊膜，囊膜内含有病毒特异的蛋白质，见图7-1。图7-1痘病毒的结构模式 早期研究表明，提纯痘苗病毒粒子时用2-巯基乙醇进行处理，可使囊膜结构疏松，这可能是由于蛋白质二硫键被破坏的结果。如再加入非离子化去垢剂，则外膜破坏，核心与其相连的侧体释出。如果再用蛋白酶(如胰蛋白酶)处理，更可使侧体从核心上脱落下来。加去氧胆酸钠、二硫苏糖醇和氯化钠于痘苗病毒的核心悬液中，可以使其破裂而释放出DNA和20%的蛋白质，以及包括许多溶解状态的酶类。 其它正痘病毒，如禽痘病毒和兔痘病毒等的大小和形态结构基本相同，但羊痘病毒较小。昆虫痘病毒的形态差异较大。从Melolontha幼虫分离的昆虫痘病毒较大，直径为400250nm，其表面有直径为22nm的球形结构，核心呈偏心肾形，只有单一侧体。从Amsacta幼虫分离的痘病毒较小，具有珠状表面结构，核心致密，核心周围缠绕着层中等密度的物质，侧体不明显。2.理化学特性 病毒粒子的S20w约5 000。在庶糖中的浮密度为1.25g/cm3，在氯化铯中约1.3g/cm3，痘苗病毒DNA的分子量为122106，但鸡痘病毒的DNA分子量高达200106。这样大分子量的DNA，可以编码几百种蛋白质。有关痘病毒的理化学特性的资料数据，主要来自痘苗病毒。该病毒的高度提纯制品含有92%蛋白质、3.2%DNA、1.2%胆固醇、2.1%磷脂、1.7%中性脂肪、0.2%非核酸碳水化合物以及微量的铜、核黄素和生物素。但鸡痘病毒的含脂量高达病毒粒子干重的34%。正痘病毒属和禽痘病毒属抗乙醚，副痘病毒属、羊痘病毒属和兔痘病毒属对乙醚敏感。痘病毒的耐乙醚程度看来取决于其所含脂类是否为必需的脂质。痘病毒的G+C含量甚低，只35%左右。 已知痘病毒含有70多种早期蛋白质和40多种晚期蛋白质，分子量由8kDa250kDa不等，一部分为糖蛋白和磷蛋白。应用非离子去垢剂和还原剂处理痘苗病毒粒子，可以使其外膜释出十几种主要多肽，如210kDa、110kDa、85kDa、42kDa、37kDa、21.5kDa、21kDa和20kDa，其中7种是糖蛋白。37kDa为主要蛋白，非糖基化。85kDa蛋白是血凝素(hemagglutinin,HA),HA-的痘苗病毒，其毒力显著降低。42kDa蛋白为穿膜蛋白。37kDa蛋白与病毒细胞间感染有关。另外还有32kDa膜蛋白，此蛋白质能增强病毒对机体和宿主细胞的感染力；14kDa膜蛋白，则促进病毒与细胞以及细胞与细胞间的融合。糖蛋白对“胰蛋白酶消化”敏感，可能紧贴于病毒粒子表面之下，在用上述去垢剂和还原剂处理后，至少还有18种多肽不被释出，可能就是核 心的结构蛋白，包括那些分子量和含量最多的多肽。在病毒粒子核心中74kDa、62kDa、25kDa和11kDa4种蛋白质，约占核心重量的70%，其中11kDa和25kDa蛋白对RNA有很高的亲和性。在病毒粒子核心中还有与核心DNA呈高度亲合性的60kDa、43kDa、28kDa、18kDa和14.5kDa 5种蛋白质。痘病毒能在室温下耐受干燥几个月。于干燥条件下，可耐100510mins，但在潮湿条件下，60mins即可破坏之。对常用消毒剂具有较强抵抗力，但50%酒精和0.01% KMnO4可在1hrs内使其灭活。于-70，可以存活多年。保存于50%甘油中的痘病毒，可于0以下温度中存活34年。3.增殖和培养 痘苗病毒粒子对细胞膜的吸附过程较快，50%以上的种入病毒可于接种后的15mins内吸附于细胞，且无方向性，可以发生横向或纵向吸附。痘病毒虽然是DNA病毒，但它的整个增殖过程，全部在胞浆内进行。并在20hrs内完成一个复制周期。 第一阶段，痘病毒粒子与细胞表面接触后，被细胞吞饮到吞饮泡内，在其中被水解酶系酶解，进行第一阶段脱壳(脱去外膜)，使病毒的核心等释放入胞浆。病毒粒子中存在有一整套用于自身增殖的酶，病毒脱去外膜后，在病毒RNA合成酶系作用下，占全病毒基因组近一半的拷贝被转录成早期mRNA。在核心内由依赖于DNA的RNA聚合酶、早期转录因子(ETF)、帽加工酶、甲基化酶、终止因子、聚(A)酶和磷酸酶等协同作用下，合成早期mRNA并很快释放入细胞质，并开始早期蛋白质的翻译，早期蛋白质的合成在病毒感染14hrs内进行。这种早期转录不受蛋白质合成抑制剂的影响。这些被翻译的70多种早期合成蛋白中的一些蛋白质作用于核心蛋白，进行第二阶段脱壳，使核蛋白和DNA相互分离。第二阶段为痘病毒DNA的复制和结构蛋白大量合成阶段。早期合成的蛋白中含有DNA聚合酶、胸苷激酶等与DNA复制相关的酶系。病毒DNA复制开始于DNA从核心蛋白分离的第二阶段脱壳期。由于DNA复制在病毒感染后25hrs开始，故在病毒感染后26hrs，在电镜下可见到胞浆内的“工厂区”。DNA的复制开始后，大部分早期蛋白质合成将停止，转入晚期mRNA的转录、大量结构蛋白的合成、少量其它病毒蛋白及少量酶的合成。早期和晚期mRNA含甲基化的末5端，3末端含有约100个腺苷酸残基。结构蛋白的合成阶段，DNA复制自然终止。但痘病毒的某些DNA复制发生于胞核，证明了细胞核在痘病毒增殖中的作用。第三阶段为病毒粒子成熟阶段。此阶段为多种合成成份组装成病毒粒子的过程。其中一部分多肽，进行糖基化、磷酸基化或断裂等修饰。超薄切片和电镜负染可以看到，成熟的病毒粒子核心为两层膜包裹了的DNA。在“工厂区”内出现月牙状脂质双层膜结构，凸面上有一层短的针状体。随后逐渐变为球形的闭合脂质双层膜，其中央腔内含有电子密度高的颗粒物质，最后出现清晰的核心和侧体，并且逐渐成熟。可见在细胞质内装配的成熟痘病毒具有重新合成的脂质双层膜，但与细胞膜无关。病毒粒子在出芽时仍可获得与感染细胞膜相关的脂质双层外膜，即囊膜。但尚不清楚病毒粒子是如何离开“工厂区”，运动至细胞周边的。 除接触传染性脓疱性皮炎病毒以外，其它痘病毒易在其感染细胞内形成胞浆内包涵体。包涵体内含有病毒粒子，又称原生小体。现已清楚，只有一少部分病毒经出芽方式离开感染细胞，而大部分病毒粒子仍滞留在感染细胞 内。一个感染细胞可产生10 000个病毒粒子。利福平(rifampin)可阻断痘苗病毒外膜的形成和病毒粒子的聚集，而甲吲噻腙(methisazone)则阻断晚期蛋白质合成和病毒粒子的集聚。 大多数痘病毒易在鸡胚绒毛尿囊膜上生长，并产生溃烂的病灶、痘斑或结节性病灶。痘斑的形态和大小随病毒种类或毒株而不同。天花病毒和粘液瘤病毒引起小而分散的灰白色痘斑(白痘)。但痘苗病毒形成大而中心环死的痘斑，牛痘病毒和某些嗜神经性痘苗毒株产生中央出血性痘斑(红痘)。兔纤维瘤病毒在绒毛尿囊膜上引起极微小的病变，甚至难用肉眼见到。各种正痘病毒在鸡胚中生长的温度上界不同，例如猴痘病毒和鼠痘病毒为39，天花病毒为38.5，牛痘病毒为40，痘苗病毒和兔痘病毒为41。这些差别常被用于各种正痘病毒的鉴别。 痘病毒易在组织培养细胞内增殖，并常产生明显的细胞病变或蚀斑。经常用于病毒培养的细胞有牛肾、兔肾细胞、HeLa细胞和鸡胚成纤维细胞等。感染正痘病毒的细胞经常具有血细胞吸附作用。4.血凝性 正痘病毒的囊膜表面和感染细胞膜表面有血凝素蛋白，因此能够凝集火鸡红细胞和某些品种的鸡的红细胞。而禽痘病毒、羊痘病毒、兔痘病毒和副痘病毒均无血凝素蛋白。血凝素是分子量为85kDa和68kDa的糖蛋白，它具有N和O连接的糖分子，而其它病毒糖蛋白只有N连接的糖分子。85kDa蛋白产生于病毒感染早期，且分布于囊膜表面。68kDa蛋白则出现在病毒感染晚期，可能来源于85kDa蛋白。应用离心沉淀方法，可将血凝素由病毒粒子上分离下来。血凝素为直径5065nm的颗粒，可耐100煮沸加热。以乙醚酒精抽提法分开的这两种成分，可以再次重新组合成为具有活性的血凝素。借助红细胞吸附试验，也可证明痘苗和天花病毒感染的细胞胞膜上存在血凝素。已经吸附于红细胞上的血凝素不会自动由细胞上脱落下来。给动物注射血凝素，可使其产生抗血凝素抗体。疫苗接种的人和动物的血清中，也有这种抗体的存在。但已证明血凝素抗体没有中和病毒作用。二、痘病毒的基因组结构与功能痘病毒基因组的长度差异较大，副痘病毒约130Kb，而禽痘病毒约300kb。正痘病毒的基因组是一条双链DNA。采用温和的DNA提取办法可以获得完整的无缺口的病毒DNA分子。其长度的变化也较大，从兔痘病毒的120MD至牛痘病毒的145KDA，痘苗病毒本身的DNA长度也有变异，不同毒株为120130MD，即180200Kb。其DNA无感染性。正痘病毒属各成员的基因组有70%90%的同源性。正痘病毒基因组结构的特点如下：（一） DNA末端的发夹结构如图72A所示，痘病毒DNA链的末端有单链的发夹结构，即末端交叉连结。由于这一结构，原始基因组和末端的酶切片段在碱或加热变性后很快可以复性。存在这一发夹结构的证据是，如果不用单链特异性核酸酶处理，毒粒DNA对外切酶、末端转移酶、多核苷酸激酶、蛇毒磷酸二脂酶和脾磷酸二脂酶的活性有抵抗。Baroudy等（1982）对痘病毒DNA末端进行了克隆和序列分析，结果表明，每一末端有104个核苷酸并不完全配对，存在两种形式，呈倒置互补，称为“反转”发夹结构（图72B），即使在合适的构形中，还有10个核苷酸不能配对。图72 痘苗病毒DNA的末端结构A: 结构示意图； B: 两种“反转”发夹结构（引自Joklik 1985, McFadden et al 1983）至于在DNA复制过程中，这一单链复制区的命运尚不清楚。Pogo(1977)报道，在接种痘苗病毒后，这一交叉连结发夹结构在90mins内消失。母株DNA发夹结构消失的时间相当于DNA合成开始的阶段。在痘苗病毒接种后大约45hrs，DNA合成业已停止时，发夹结构才重新出现（Pogo 1977, 1979, 1980）。发夹结构的消失是由于在末端发夹单链区产生缺口还是在DNA的主体部分发生缺口，也尚未阐明。Esteban等（1977）在电镜下研究痘苗病毒DNA复制中间体，发现逐渐增大的末端双链复制的泡状结构，提示在DNA复制的早期，末端发夹结构并未解开。Forte等（1979）也观察到，在酵母DNA末端类似的复制结构，有完整的末端发夹。目前，关于带有末端发夹结构的线状DNA的复制机理有3种模式（图73）。(1) 根据Cavalier-Smith末端回文模式（Cavalier-Smith 1974）提出的Bateman模式（Bateman 1975）；DNA的合成以53方向前进，向右通过末端发夹，在靠近末端处引入两个位点特异性缺口（在B/C连接处），产生的子分子具有开放的单链末端。这种缺口的引入使之有可能进行自我退火和连接，从而形成具有完整发夹末端的子分子。(2) Esteban模式（Esteban et al 1977）：DNA的合成经RNA来起动，开始于发夹处或发夹附近，这样在末端就产生单链的裂口（a/a）。同时，病毒诱导的单链特异性内切酶在单链裂口处造成缺口，末端的游离单链尾由于存在回文序列而能自我退火，最后经修复和连接，子分子的末端形成共价关闭的结构。图73 具有末端发夹结构的线状DNA复制模式示意图A.Bateman模式； B.Esteban模式； C.McFadden和Morgan模式（引自McFadden et al 1983）(3) McFadden和Morgan模式（McFadden et al 1983）：DNA的合成开始与Bateman模式一样，从5 3端方向前进并通过发夹。利用在发夹处经复制形成的回文序列，产生一种暂时性的十字形结构，这种十字形的构形相当于Hol-liday交叉中间物，从后者可以分离出具有完整发夹的子分子。根据这一模式，有关的重组酶类必须参与。(二) DNA末端的倒置重复序列正痘病毒基因组具有较长的末端倒置重复序列（ITRs）。不同成员的ITRs的长度也不一样，痘苗病毒、牛痘病毒和猴痘病毒的ITRs约有10kb长，而兔痘和鼠痘病毒则仅为其一半，天花病毒则十分短，小于小于2kb。这种结构与腺病毒、疱疹病毒的ITRs相似，但后者短得多。病毒的ITRs结构可能与其繁殖方式有关。在ITRs的远侧端尚有串联的重复序列区，如图74所示。紧接着“反转”发夹结构有一86核苷酸的区段NR1，依次跟随着：第1套串联重复序列（Set1），它由串联的重复序列单位所组成，在痘苗病毒则为AB两个单位，长约70bp，有13次重复；NR2独特区，牛痘与痘苗病毒有77%的同源，其中有DdeI和AluI切点；第二套串联重复序列（Set2），AB两个单位重复18次；NR3独特区，在痘苗病毒Set2后1800bp处有SalI切点；在牛痘病毒Set2后269bp处有SalI切点。牛痘病毒与痘苗病毒的重复单位十分相近，但其排列不同（Joklik 1985）。此外，痘苗病毒Lister株和兔痘病毒DNA的末端串联重复区也相似或相同（Witlek et al 1980）。倒置末端重复区内的串联重复区的生理作用，可能是加速单链DNA的自我退火而形成环状结构。另外，在倒置末端重复区内还编码早期蛋白（详见下节）。图74 痘苗病毒WR株与牛痘病毒BR株的末端串联重复序列区段（引自Joklik 1985）不转录的、周期性的、或长或短的高度重复序列是真核基因的共同特征（Donehower et al 1979）。这种重复序列可能无特异性功能，有人建议称为“自私DNA”（Selfish DNA）。其所以能保持其恒定结构，可能是由于不等重组的结果。痘苗病毒DNA的末端的这种1318串联重复序列也属于这一类。这种转座子样的排列可以促进重组的发生，导致DNA末端序列的不均一性，这可以解释DNA末端的酶切片段在凝胶电泳中为什么呈散状。在痘苗病毒的传代过程中，其DNA分子有两种形式，一种称为稳定形式，即每一端有一套1318的70bp的串联重复序列，13次与18次之间有435bp的间隔；另一种称为不稳定形式，即有多套重复序列和间隔。在连续传代的母系病毒中，有20是不稳定型。这一现象，即使将病毒反复纯化也不能避免，单一病毒颗粒就可以形成这一结果。但是，每一次空斑纯化可使大约20%的不稳定型DNA回复成稳定型DNA。DNA稳定型和不稳定型的感染性没有差别。稳定型DNA与不稳定型DNA的转变可以用下列重组模式来解释：第一步在DNA分子的第一套串联重复序列与另一个分子的第二套之间发生重组，这样，可以形成缺乏一套重复序列和间隔序列的分子，以及具有三套重复序列的分子。由于重复序列在倒置末端重复区内，因此，重组可以发生在同一分子或不同分子的对立端，这样就可以形成许多具有不同数量重复序列的分子，包括稳定型DNA分子（图75）。图75 稳定型与不稳定型痘苗病毒DNA不等重组模式图I 图中的数字表示每套重组序列；示酶切位点（引自Moss et al 1981）（三）痘病毒基因组的保守区与变异区除浣熊和Tatera痘病毒外，其它痘病毒科成员基因组的酶谱是十分相似的。Mackett等（1979）采用酶切分析法比较了5种正痘病毒，包括15个毒株的DNA结构，即痘苗病毒DIE株、HI（Hall Institute）株、LS（Lister）株、WR（Western Reserve）株；猴痘病毒MPC（Congo）株、MPD（Denmark）株、MPE（Espaina）株；天花病毒BUT（Butler）株、HAR（Harvey）株；牛痘病毒AR株（Red Strain Austria）、BR（Brighton）株、RR（Ruthin）株、DR（Daisy）株；鼠痘病毒EH（Hampstead）株、EM（Moscow）株。如图76所示，从Hind切点的分布来看，中央区大约有120kb区段是保守的，但其中也有一些型特异性的差异存在，特别是鼠痘病毒毒株；在近末端区的变异则较大，包括长度和序列。在兔痘、牛痘和痘苗病毒DNA倒置末端重复区间有同源序列。Schuemperli等（1980）采用详细的酶谱分析证明，Utrecht株和Elstree株DNA的差异完全发生在末端，包括末端的重复序列和附近序列。McCarron等（1978）报道，WR株和CV-1之间的差异在于HindC片段的大小。Wittek等（1978）发现痘苗病毒在传代过程中DNA末端的长度常不一致。Archard等（1979）报道，红牛痘病毒的白痘变异株在一个近末端有大约12%的基因组缺失。同样兔痘病毒的白痘变异株也在一个近末端有大片段的缺失。这种缺失还可影响宿主范围（Moyer et al 1980）。Panicali等（1981）报道，在痘苗病毒WR株的传代过程中分离出两种变异株，称为S和L变异株。两种变异株经Hind、Ava、Xho、Sst和Sma分析说明，在S变异株中有一段6.3MD的缺失，它位于离末端6.8MD之外，也就是刚好在倒置末端重复区之外。这段缺失的片段在体内体外均有转录物，但对该毒株在HeLa细胞上生长周期并无影响。作者认为多出的6.3MD片段，可能在病毒进化过程的早期来源于宿主细胞，而为病毒复制所必需，在随后的演变过程中为其它机制所取代。另外，Panicali等还证明，WR株的AvaIM片段（DNA最末端）的大小常有变化，变化范围大约有50300bp，这与McFadden(1979)报道的痘苗病毒IDHW株的末端重复序列中缺失的大小相一致。 图76 正痘病毒属基因组的结构a. 正痘病毒DNA Hind和Sma酶切图b. 中央保守区与侧翼区示意图（CPVBR）黑色区为倒置末端重复序列 （引自Mackett et al 1979）由此可见，一般来说，正痘病毒基因组中央区约120kb为保持区，两侧的侧翼区（图76）长40kb(R1和R2)。一般认为中央保守区编码与病毒繁殖有关的重要酶类，而两侧的侧翼区则与型特异性、宿主范围等性质有关。（四）我国痘苗病毒天坛株DNA结构的基本特征我国痘苗病毒天坛株是曾在我国大量人群中进行预防接种的疫苗株。但其来源尚不清楚。据云，该株是我国学者早在20年代从天花患者分离的病毒，经猴、兔、牛多次传代后获得的，但始终无法进行科学的验证。侯云德等（1985a,b,c）、杨新科等（1984）和宇文镐等（1989）进行了该病毒株DNA的酶切分析与分子克隆，结果说明我国毒株的DNA结构与国外毒株有所不同，用Hind消化可以获得16个片段（图77a,b）（表32），它与Panicali等（1981）报道的痘苗病毒WRL株，Mackett等（1979）报道的痘苗病毒DIE、HI和WR株的HindA0片段，大小较为相似。但是，天坛株有HindP片段。而WR、HI、DIE和Copenhagen株均无P片段。另一方面，Mackett等（1979）报道的LS株有HindP、Q片段，但其C片段较小，相当于WR的D片段（15.6kb），另外还多出1个12.2kb片段，与天坛株相差较远。从痘苗病毒天坛株DNA XhoI酶切分析也证明，我国毒株与国外毒株不一样。由表33可见，天坛株与WR和LS株相比较多出15.0kb片段，B片段也多一条；与DIE株比较，缺少8.6kb片段，多1个B片段。此外，从HindDF片段的主要酶切片段分析，发现HindD克隆片段中明显地存在两个亚型：Da和Db。两者差异的本质是，Da片段中有EcoRI 4.0kb片段，而在Db片段中代之以3.1和0.9kb两个片段（表34）。同样，在HindF片段中也存在两个亚型Fa和Fb。差异的本质是，Fa片段中有EcoRI 6.2kb片段，而在Fb片段中代之以3.4和2.8kb两个EcoRI片段（表34）。HindE片段中尚未发现主要酶切点的变异，在其它克隆片段的BamHI、EcoRI、PstI和XhoI酶切分析中，也未发现明显变异。 天花病毒引起传播迅速的烈性传染病天花。天花曾是人类历史上的重大灾祸之一。由于使用痘苗病毒疫苗预防天花，1977年天花在全世界流行终止，1980年世界卫生组织(WHO)宣布，天花已经被消灭，不再用痘苗病毒疫苗预防天花。1.形态和理化学特性 痘苗病毒粒子的浮密度在稀释的缓冲液中为116g/cm3，在53%的蔗糖溶液中为125g/cm3，在酒石酸钾溶液中为12/cm3。 重量为4510-15g。痘苗病毒和天花病毒在生理pH值时带有负电荷，痘苗病毒的等电点为pH40，而天花病毒则为pH34。痘苗病毒和天花病毒的外形和大小十分相似，大小为270218nm左右。抗原性上也极相似，但二者毒力不同。7.痘苗病毒的起源 关于痘苗病毒的起源，学者们的意见不一致。有谓痘苗病毒是天花病毒连续通过兔体和犊牛后形成的变异株，也有人认为痘苗病毒起源于牛痘病毒。有人甚至认为，Jenner的原始牛痘毒株已被天花病毒污染，因此，痘苗病毒实际上是这两种病毒的重组型。8.痘苗病毒的应用 1982年，Paoletti和Moss研究组将外源基因插入痘苗病毒的TK基因中，首次成功地构建了在哺乳动物细胞中表达外源基因的重组痘苗病毒。10多年来，应用重组痘苗病毒成功地表达了来源于植物、动物乃至人类的数十种基因。重组痘苗病毒具有如下特点：重组痘苗病毒仍然保留野生型痘苗病毒的特性，感染几乎所有源于哺乳动物的培养细胞，并表达外源蛋白；被表达的外源蛋白，在感染细胞中，能忠实地进行修饰；与其它病毒表达载体相比，具有较高的表达效率；通过对动物接种重组痘苗病毒的方法，能了解外源蛋白对个体的作用以及机体的免疫应答；表达抗原基因的重组痘苗病毒。可作为基因重组疫苗。正因为有上述特点，痘苗病毒载体广泛用于分子生物学、细胞生物学、免疫学领域以及新型疫苗的开发。 (1)基因组结构与复制 痘苗病毒基因组为两端交叉闭锁的线型双链DNA分子，根据毒株的不同，其长度变化在180kb200kb之间，编码约200种蛋白质。基因组的两端向内，并有10kb的倒置重复序列，即序列完全一致，方向相反，呈现倒置互补，其中含70bp125bp的重复区。此70bp为痘苗病毒的复制所必需，其中20bp(ATTTAGTGTCTAGAAAAAAT)尤为重要。此末端倒置重复序列变异较大，即使同一毒株其结构亦不尽相同。这种两端变异较大的序列，大多编码非必需蛋白质，但与病毒毒力及宿主范围有关。在痘苗病毒基因组中央区域约有120kb的保守区，核苷酸变异较小，变异率在10%左右。晚期基因大多集中于此区，主要编码结构蛋白。痘苗病毒基因组含约198个主要ORF和65个与其它基因重叠的小ORF，总共约含可编码263种左右蛋白质的潜在基因。痘苗病毒的阅读码框架间相距仅几个至几十个碱基，有的阅读框架相互重叠。基因组中无内含子，无基因编接机制。痘苗病毒增殖均在哺乳动物细胞浆中进行，并在20hrs内完成一个病毒复制周期。过去有人曾分离过无胸苷激酶活性(TK-)和无血凝作用(HA-)的痘苗病毒变异株。因此，目前为止人们常在TK基因或HA基因中插入外源基因进行表达。痘苗病毒基因组左侧2030kb不稳定，在单纯的反复传代过程中亦会发生某些基因的丢失。因此，也有人认为此区域为非必需基因群。 (2)重组痘苗病毒的制备 Paoletti等首次利用标记拯救技术，制备了插入有外源基因的重组痘苗病毒。制备重组病毒时，首先准备含有痘苗病毒非必需区基因的质粒，在此非必需区中部插入痘苗病毒自身的启动子(成为痘苗病毒表达载体)，启动子下游连接欲表达的外源基因。接着对已感染痘苗病毒12hrs的细胞，转化上述重组质粒，使重组质粒中所含的痘苗病毒非必需区序列与痘苗病毒非必需区序列发生同源重组。外源基因在这一过程中重组到痘苗病毒基因组中，形成重组痘苗病毒粒子。应用磷酸钙法进行体内重组，得到的重组病毒只占全部子代病毒的01%左右，脂质体法可使重组率提高到03%05%，而电激法又可提高重组率10倍以上。为了提高重组率，将重组质粒DNA与纯化的痘苗病毒DNA混合，共同转化已感染痘苗病毒的细胞，可得到1/3的重组病毒。如果将重组质粒NotI酶切片段与痘苗病毒DNA的NotI酶切片段进行连接，进行体内重组，则可得到1/4的重组病毒。最常用胸苷激酶(TK)基因区作为外源基因插入痘苗病毒的非必需区，只需5溴脱氧尿苷(BUdR)加压即可得到TK重组病毒。也常用血凝素基因(HA)作为插入外源基因的非必需区，此时用鸡红细胞筛选HA重组病毒，但由于痘苗病毒的自然突变，存在着TK-和HA-变异株，因此表达外源基因时应再增加筛选标志。例如利用半乳糖苷酶基因、新霉素抗性基因(Neo)、鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因(gpt)等，可在培养液中加入Xgal、G418、霉酚酸等试剂，以便筛选出重组病毒。 (3)疫苗制备 痘苗病毒载体已广泛用于外源基因的表达调控研究，逐步成为常规表达外源蛋白的工具。利用痘苗病毒载体进行疫苗开发研究主要有如下两个大的方面。 首先，利用痘苗病毒表达外源基因生产多肽或亚单位疫苗。由于疫苗病毒表达的外源蛋白，比细菌、酵母及多角体病毒表达系统更接近天然结构，病毒稳定性好，增殖滴度高，宿主范围广，便于操作，且价廉容易生产。因此，如何构建和利用高效表达痘苗病毒载体系统成为表达外源基因的关键一步。其次，利用痘苗病毒载体进行重组活疫苗的研究。由于重组痘苗病毒不仅诱导机体产生体液免疫，而且诱导坚强的细胞免疫。痘苗病毒作为基因重组活疫苗载体，不需佐剂即可免疫动物，病毒在体内增殖过程中产生的外源蛋白可剌激机体产生免疫反应。表达的外源蛋白在细胞内被修饰后，与自身的组织相容性复合体(MHC)结合，剌激CD+8T淋巴细胞(细胞毒性T淋巴细胞)。 重组痘苗病毒已用于人类疾病的临床研究，有些重组痘苗病毒活疫苗已处于免疫观察阶段。在北欧，从1989年起野外投放狂犬痘苗重组病毒3次，到了1990年后半叶投放区野生狐狸及其周围家畜，已无狂犬病发生。猴免疫缺陷病毒(SIV)痘苗重组病毒接种猴体后可抵抗强毒的攻击。HIV1痘苗重组病毒接种人体，亦已进入临床试验阶段。痘苗病毒在基因重组活疫苗研究中的优点之一，是可进行多价基因重组疫苗的制备。由于痘苗病毒的基因组容量大，可插入25Kb的外源基因而不影响自身复制。因此，可将不同的外源基因，特别是各种病毒保护性抗原基因一同插入痘苗病毒基因进行表达。这种尝试已有成功的报道。总之，痘苗病毒无致癌性，稳定性好，宿主范围广，基因组容量大，非必需区多，能诱发机体产生坚强的体液免疫和细胞免疫等都是其突出的优点。虽然存在百万分之一的种痘后脑炎和全身性发痘，但随着对其基因组结构、功能的深入研究和改造，必将成为分子生物学、基因工程生物活性物质生产、基因重组疫苗及多价疫苗研究的有效工具。 图37 克隆的痘苗病毒天坛株DNA Hind 片段凝胶电泳图（a）及放射自显影图（b） 表32 痘苗病毒天坛株Hind片段大小（kb数）与其它痘苗毒株的比较Mackett等（1979） Panicali等（1981） 侯云德（1985） DIE HI LS WR WR-L WR-S 天坛株761A 45.5 45.5 45.5 45.5 51.2 51.2 50.0B 28.9 30.3 26.5 28.8 30.0 30.0 35.0C 23.5 25.0 15.6 20.5 21.0 30.0D 15.6 15.6 15.1 15.6 15.5 15.5 15.4E 15.0 15.0 15.0 15.0 14.5 14.5 15.1F 13.5 13.5 13.5 13.5 13.0 13.02 13.1G 9.0 9.0 12.2 9.0 8.6 8.6 8.7H 8.5 8.5 9.0 8.5 8.3 8.3 8.4I 6.5 6.5 8.5 6.5 6.2 6.2 6.3J 4.9 4.9 6.5 4.9 4.7 4.7 4.9K 4.4 4.4 4.9 4.4 4.2 4.2 4.3L 3.9 3.9 4.4 3.9 3.9 3.9 3.9M 2.2 2.2 3.9 2.2 2.4 2.4 2.3N 1.6 1.6 2.2 1.6 1.7 1.6O 1.5 1.5 1.6 1.5 1.4 1.4 1.4P 1.5 0.8Q 0.6表33 痘苗病毒天坛株XhoI片段大小（kb数）与其它痘苗毒株的比较 Mackett等（1979） Panicali等（1981） 侯云德（1985）DIE HI LS WR WR-L WR-S 天坛株761A 40.9 27.3 40.9 40.9 42.4 40.9 40.0B 26.4 25.0 33.3 36.4 35.6 35.6 25.0X2C 22.02 22.02 22.02 22.02 21.82 21.82 20.02D 13.9 14.8 10.9 10.9 10.9 10.9 15.0E 10.9 10.9 9.5 9.5 9.4 9.4 10.5F 9.52 9.52 8.62 7.3 6.8 9.4G 8.6 7.3 6.42 6.42 6.42 6.42 7.22H 7.3 6.6 6.6 6.0 5.2 5.2I 5.3 5.3 5.3 5.0 5.0 5.0 4.02J 4.3 4.92 4.8 4.32 3.92 3.92 3.4K 3.9 4.3 4.3 3.9 3.8 3.8 L 3.8 3.9 3.9 3.3 3.3 3.3 M 3.3 3.8 3.3 0.6 0.6 N 3.3 表34 痘苗病毒天坛株HindD.E.F酶切片段中的主要酶切片段 Hind酶切片段克隆号 Da Db E Fa Fb 17 528 57 5 915 5 559 441 778 166 688 135 254 940 710 639 755 963限制酶 440 840 396 758 721 775 854 1527 473 890 575 1329 659 937 842 8.1* 8.1 7.5