狗粮中蛋白质含量的测定.doc

狗粮中营养物质的测定一、 实验目的测定得出狗粮中四种营养物质（水、蛋白质、维生素C、粗脂肪）的含量来判断某品牌狗粮是否合格。二、 实验原理1.水分受热蒸发2.白质的提取： 水溶液提取法 稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋白质的溶解。提取的温度要视有效成份性质而定。一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。但另一方面，温度升高会使蛋白质变性失活，因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温（5度以下）操作。为了避免蛋白质提以过程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制剂（如二异丙基氟磷酸，碘乙酸等）。蛋白质含量的测定： 考马斯亮蓝法（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250 在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm 波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250 结合在2min 左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h 内保持稳定。该法是1976年Bradford 建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry 法还高4 倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为01000gmL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。 3. 抗坏血酸（维生素C）的测定原理维生素C又称抗坏血酸（ascorbic acid）。在1928年，从牛的肾上腺皮质中提取出的结晶物质，证明对治疗和预防坏血病有特殊功效，因此称为抗坏血酸。还原型抗坏血酸能还原染料2，6-二氯酚靛酚钠盐，本身则氧化成脱氢抗坏血酸。在酸性溶液中，2，6-二氯酚靛酚呈红色，被还原后变为无色。因此，可用2，6-二氯酚靛酚滴定样品中的还原型抗坏血酸。当抗坏血酸全部被氧化后，稍多加一些染料，使滴定液呈淡红色，即为终点。如无其他杂质干扰，样品提取液所还原的标准染料量与样品中所含的还原型抗坏血酸量成正比。4. 利用脂肪能溶于有机溶剂的性质，在索氏提取器中将样品用无水乙醚或石油醚等溶剂反复萃取，提取样品中的脂肪后，蒸去溶剂,所得的物质即为脂肪或称粗脂肪。三、 试剂和材料1. 烘干机、天平2. 标准蛋白质溶液（从狗粮（5g）中提取出的蛋白质溶液） 考马斯亮蓝752型紫外分光光计 微量注射器 试管及试管架 刻度吸管3. 5g该品牌狗粮的VC提取液。1. 2%草酸溶液：草酸2 g溶于100 ml蒸馏水中。2. 1%草酸溶液：溶1 g草酸于100 ml蒸馏水中。3.标准抗坏血酸溶液（0.1 mg/ml）：准确称取50.0 mg纯抗坏血酸，溶于1%草酸溶液，并稀释至500 ml。贮于棕色瓶中，冷藏，最好临用时配置。1%HCl溶液。0.1%2，6-二氯酚靛酚溶液：溶500 g 2，6-二氯酚靛酚于300ml含有104mg NaHCO3热水中，冷却后加水稀释至500ml，滤去不溶物，贮棕色瓶内，冷藏（4约可保存一星期）。每次临用时，以标准抗坏血酸液标定。4. （索氏提取器 如图3-3所示 电热恒温鼓风干燥箱 恒温水浴箱 无水乙醚（不含过氧化物）或石油醚（沸程30-60C） 滤纸筒四、 实验步骤(一) 水含量的测定（1） 取该品牌狗粮，称重，记录数据M1（2） 放入烘干机至水分全部蒸发（3） 称重，记录数据M2（4） 计算：M1除以M2，得出该狗粮水分的含量 （二）蛋白质含量的测定 取8只试管按下表编号进行加试剂充分摇匀用不同浓度的标准蛋白质溶液做标准曲线，以蛋白质浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。试剂试管编号0 1234567标准蛋白质溶液/ml0.0 0.20.40.60.810.20.2相当于蛋白质含量/ug0.0 20406080100？蒸馏水/ml0.1 0.80.60.40.200.80.8蛋白质试剂/ml5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 A595由回归曲线方程计算出待测液中的蛋白质含量以及待测材料中的蛋白质含量。计算出蛋白质的质量，除以5g，可得出狗粮中蛋白质的含量。（合格的狗粮蛋白质含量一般在20%以上，根据不同种类的狗需选择不同蛋白质含量的狗粮，而幼狗则需选择蛋白质含量为30%40%的狗粮）（三）维生素C含量的测定1.滴定. 标准液滴定准确吸取标准抗坏血酸溶液1.0 ml（含0.1mg抗坏血酸）置100 ml锥形瓶中，加9ml1%草酸，微量滴定管以0.1%2，6-二氯酚靛酚滴定至淡红色，并保持15s钟即为终点（样品中某些杂质亦能还原二氯酚靛酚，但速度较抗坏血酸慢，故终点以淡红色存在15s内为准。）。由所用染料的体积计算出1ml染料相当于多少mg抗坏血酸。. 样液滴定准确吸取滤液两份，每份10.0ml分别放入两个100ml锥形瓶内，滴定方法同前（注意：滴定过程宜迅速，一般不超过2 min。滴定所用的染料不应少于1ml或多于4ml，如果样品含抗坏血酸太高或太低时，可酌量增减样液。）。2.计算m=VT/m0100式中m：100 g样品中含抗坏血酸的质量（mg）；V：滴定时所用去染料体积（ml）；T：每毫升染料能氧化抗坏血酸质量数（mg/ml）；m0：10ml样液相当于含样品之质量数（g）。 (四)粗脂肪含量的测定 1样品处理(1) 固体样品: 准确称取该狗粮5g（精确至0.01mg），装入滤纸筒内。2. 索氏提取器的清洗 将索氏提取器各部位充分洗涤并用蒸馏水清洗后烘干。脂肪烧瓶在103C2C的烘箱内干燥至恒重（前后两次称量差不超过2mg）。 3.样品测定 (1) 将滤纸筒放入索氏提取器的抽提筒内，连接已干燥至恒重的脂肪烧瓶，由抽提器冷凝管上端加入乙醚或石油醚至瓶内容积的2/3处，通入冷凝水，将底瓶浸没在水浴中加热，用一小团脱脂棉轻轻塞入冷凝管上口。(2) 抽提温度的控制：水浴温度应控制在使提取液在每6-8min回流一次为宜。(3) 抽提时间的控制: 抽提时间视试样中粗脂肪含量而定，一般样品提取6-12h，坚果样品提取约16h。提取结束时，用毛玻璃板接取一滴提取液，如无油斑则表明提取完毕。(4) 提取完毕。取下脂肪烧瓶，回收乙醚或石油醚。待烧瓶内乙醚仅剩下12mL时，在水浴上赶尽残留的溶剂，于95105C下干燥2h后，置于干燥器中冷却至室温，称量。继续干燥30min后冷却称量，反复干燥至恒重（前后两次称量差不超