病理学论文：胃印戒细胞癌的细胞起源及其癌前病变的病理学.doc

病理學論文：胃印戒細胞癌的細胞起源及其癌前病變的病理學摘要目的:研究胃印戒細胞癌的發生與胃腺增殖區的關係,探討其細胞起源和癌前病變.方法:以42例早期胃印戒細胞癌為研究對象,觀測其組織形態,採用免疫組織化學雙染標記癌灶內分化標誌物MUC5AC和MUC6的表達情況,檢測癌灶不同區域Ki-67以及胃腸道幹/祖細胞標誌物musashi-1的表達差異,並與癌旁胃腺進行對比.結果:早期胃印戒細胞癌具有特徵性的分層結構.該結構分為兩層,淺表層為典型的印戒細胞,體積大,胞質豐富,基底層為原始的癌細胞,體積小,核/漿比大;在形態和解剖定位上,基底層癌細胞與癌旁胃腺增殖區細胞類似,免疫組織化學顯示其MUC5AC、MUC6表達均為陰性,或僅微弱表達MUC5AC,而Ki-67、musashi-1表達率顯著高於淺表層印戒細胞(t=31.0和22.8,P0.01);基底層癌細胞可向淺表層印戒細胞分化過渡,這與增殖區細胞向胃小凹上皮分化的過程相似;癌旁可見胃腺增殖區細胞異型增生,其表型與分層結構基底層癌細胞一致.結論:胃印戒細胞癌可能起源於增殖區MUC5AC-/lowMUC6-的胃小凹前體細胞,同時增殖區的異型增生是此類胃癌的癌前病變.關鍵字:胃腫瘤;印戒細胞癌;腫瘤發生;免疫組織化學0引言基於臨床病理特徵的不同,胃癌可分為腸型和彌漫型兩類1.近年的流行病學調查顯示,胃癌的總體發病率已明顯下降2,但彌漫型胃癌尤其是印戒細胞癌的發病率卻顯著升高3,因此這類胃癌也受到越來越多的關注.迄今,胃印戒細胞癌的早期診斷率不高,一個重要原因是對此類胃癌的病理形成機制和癌前病變尚不清楚.胃印戒細胞癌與腸型胃癌相似,起源於胃黏膜上皮.組織學上,胃黏膜的基本結構單位是胃單元(gastricunits),該結構為單克隆起源4,由胃小凹和胃腺組成,其中胃腺又依次分為峽部、腺頸和基底部.胃腺的峽部以及腺頸上部的細胞增殖活躍,被稱為增殖區.研究證實,增殖區是胃印戒細胞癌起源的部位5.然而,這一區域實際上含有多種低分化細胞,並具有不同分化方向6,7,印戒細胞癌究竟起源於增殖區的何種細胞,目前尚不清楚.為探討這一問題,本研究以早期胃印戒細胞癌為觀測模型,採用免疫組織化學雙染的方法,觀測了早期腫瘤細胞的空間分佈、分化表型和增殖特性,希望為認識此類腫瘤的細胞起源及其癌前病變提供新的病理學依據.1材料和方法1.1材料回顧我院1988-2008年以及無錫市第三人民醫院2007-2008年手術切除的胃癌根治標本約2 200例,根據最新WHO國際腫瘤病理分類對胃印戒細胞癌的病理診斷標準(印戒細胞占癌細胞總數的50%以上),以及早期胃癌的診斷標準(癌細胞浸潤深度不超過黏膜下層),共確認42例早期印戒細胞癌標本作為研究對象,患者年齡30-77歲,其中男25例,女17例,均無家族史;腫瘤分期:24例為T1a期,局限於黏膜內;18例為T1b期,累及黏膜下層.對所有標本的存檔蠟塊連續切片(厚3m),蘇木精-伊紅(HE)染色.另取10例正常胃黏膜作為對照.1.2方法1.2.1免疫組織化學染色:採用免疫組織化學雙染標記MUC5AC和MUC6陽性細胞,其中MUC5AC主要表達於胃小凹、峽部和腺頸部的黏液細胞8(抗體購自福州邁新公司,為工作液),MUC6則局限於腺頸的黏液細胞和基底部的幽門腺上皮8(濃縮抗體購自上海長島公司,稀釋度150),此二者常被用來作為胃上皮分化的標誌物.操作按產品說明書進行,並根據文獻略有改變9,步驟簡述如下:石蠟切片脫蠟至水;檸檬酸緩衝液(pH6.0)95修復10 min,保溫10 min;3%H2O2室溫孵育後血清封閉10 min;而後採用SP法先標記MUC6,顯色系統為BCIP/NBT,陽性呈藍黑色,定位於細胞質;隨後再次進行抗原修復,目的為暴露MUC5AC抗原,同時滅活前一次染色時殘留抗體的免疫活性,抗原修復方法同前.採用SP法標記MUC5AC,顯色系統為HRP/AEC,陽性部位呈紅色,定位於細胞質.另取連續切片單獨標記Ki-67(抗體購自福州邁新公司,為工作液)和musashi-1(Santa Cruz公司,濃縮液,稀釋度1100),其中musashi-1為一類RNA結合蛋白,與幹細胞的不對稱分裂有關10,是神經幹細胞和胃腸道幹/祖細胞的標誌物11-13.染色仍採用SP法,顯色系統為HRP/DAB,陽性部位呈棕黃色,定位於細胞核.陰性對照採用PBS替代一抗與切片孵育,其餘操作相同.1.2.2不同區域印戒細胞平均Ki-67、musashi-1陽性細胞比例的測定及比較:免疫組織化學染色標記Ki-67、musashi-1後,檢測不同區域陽性癌細胞的比率.每例標本測定兩個區域:癌灶靠近黏膜表面上皮的淺表部分和浸潤最深的部位.每個區域隨機選取5個視野,計數Ki-67、musashi-1表達呈陽性的癌細胞數,除以上述5個視野內癌細胞總數,即得到陽性細胞比率.採用t檢驗比較不同區域陽性細胞比率的差異.2結果2.1早期胃印戒細胞癌的組織結構H E切片顯示,印戒細胞在胃黏膜層形成典型的分層結構(layered structure),見於38例標本.該結構可分為上下兩層,淺表層為經典型印戒細胞,體積較大,靠近胃黏膜表面,而基底層位於黏膜中部,其細胞構成具有兩種形式:(1)由體積較小的印戒細胞或原始癌細胞構成,其核/漿比大,並逐漸向淺表層過渡為體積較大的印戒細胞(圖1A);(2)由異型增生的峽/頸部細胞構成,直接向黏膜淺表層移行過渡為典型的印戒細胞(圖1B).在解剖位置上,分層結構位於黏膜層的中上部,與胃單元的峽/頸部區域重疊(圖2A),同時分層結構下方的胃腺細胞可保持正常(圖1A),或僅有輕度異型增生(圖1B).2.2分層結構中癌細胞的分化特性分層結構上下層細胞在形態上顯示兩者分化程度不同:淺表層典型的印戒細胞,其體積較大,胞質內黏液豐富,細胞核受擠壓呈彎月形,偏位,總體形態上接近於胃小凹上皮;基底層的癌細胞體積較小,核/漿比大,胞質略嗜堿,形態與峽/頸部細胞相似,並可向黏膜淺表移行為經典的印戒細胞,反映其分化更為原始(圖1).免疫組織化學雙染顯示,在所有病例中,淺表層印戒細胞MUC5AC表達呈強陽性,而越接近基底層MUC5AC表達越弱,到達分層結構底部時癌細胞MUC5AC表達呈弱陽性或不表達(圖2B).MUC6在大多數病例的分層結構內不表達,只有少數病例(11/42)可在分層結構的基底層見少數MUC6陽性的癌細胞(比例10%).2.3分層結構中癌細胞的增殖特性Ki67標記顯示胃單元的增殖區,並可見分層結構尤其是基底層的癌細胞與癌旁胃單元的增殖區在空間位置上重疊.進一步觀測發現,分層結構基底層的癌細胞增殖較活躍(陽性比率為28.7%4.3%),而越靠近淺表層,印戒細胞Ki67陽性率越低(圖2C),經統計淺表層的經典型印戒細胞Ki67表達率為6.2%1.2%,顯著低於基底層低分化的癌細胞(t=31.0,P0.01).2.4分層結構中癌細胞m u s a s h i-1的表達musashi-1染色標記胃單元峽/頸部區域,與Ki67標記的連續切片對比可發現這一區域涵蓋了增殖區.分層結構上下兩層細胞musashi-1的表達不同,其中基底層低分化癌細胞的陽性率為35.3%4.4%,向淺表層移行的過程中musashi-1表達下降,分層結構淺表層經典型印戒細胞的表達陽性率為13.8%3.8%,顯著低於基底層低分化的癌細胞(t=22.8,P0.01,圖2D).2.5癌旁黏膜增殖區的改變對癌旁胃黏膜的觀察顯示,其形態與正常胃黏膜存在差異,這種差異主要位於增殖區(31/42)及胃小凹(39/42).增殖區的改變表現為該區域延長,細胞增殖活躍,並具有異型性,其細胞核增大、深染,分裂象易見,而胞質減少,明顯嗜鹼性(圖3A,B),免疫組織化學染色顯示增生的細胞MUC6呈陰性,而MUC5AC呈弱陽性,並表達musashi-1(圖3C,D).胃小凹表現為長度增加,並且分枝,黏液細胞體積明顯增大,可呈氣球狀(球樣增生),胞質黏液豐富(圖3A);而在部分病例(23/42),可見胃小凹的黏液細胞增生,排列密集,細胞質減少,且細胞核增大,並可出現異型性. 3討論本研究以早期胃印戒細胞癌為觀測模型,探討了印戒細胞癌形成初期時的組織學特點及分化表型.與以往研究結果相似5,14-16,本研究在早期胃印戒細胞癌內亦發現特徵性的分層結構,證實印戒細胞癌發生於胃腺增殖區,依據為:(1)分層結構位於黏膜層中上部,與胃腺的頸/峽部對應,空間範圍上涵蓋了增殖區;(2)頸/峽部細胞(包括增殖區細胞)可發生異型增生,並向黏膜表淺層延伸,移行過渡為經典的印戒細胞;(3)分層結構基底部的癌細胞增殖活躍並表達musashi-1,表型與胃腺增殖區相似;(4)癌旁胃黏膜內增殖區擴展,細胞具有異型性.在以上研究基礎上,我們進一步發現:(1)印戒細胞具有胃小凹上皮的分化表型,表達MUC5AC,這與以往研究一致17;(2)分層結構模擬了增殖區細胞向胃小凹細胞的分化過程:基底層癌細胞向黏膜淺表層移行為經典印戒細胞的過程中,細胞分化漸趨成熟,表現為幹/祖細胞標誌物musashi-1表達減少,而MUC5AC表達增強,在形態上也逐漸接近胃小凹上皮;(3)基底層癌細胞移行為印戒細胞的過程中,增殖活性不斷減弱,這與正常增殖區細胞向胃小凹上皮分化的過程相似;(4)癌旁胃腺的增殖區擴展,細胞增殖活躍,其表型與低分化癌細胞類似,MUC5AC呈弱陽性或陰性,MUC6不表達;(5)癌旁黏膜可見胃小凹上皮球樣增生或具有異型性,說明癌旁的胃小凹細胞雖未癌變,但在分化上出現紊亂.故綜合以上結果,我們認為胃印戒細胞癌可能起源於增殖區內MUC5AC弱陽性或陰性、MUC6陰性(MUC5AC-/lowMUC6-)的細胞.這些細胞在分化為胃小凹上皮的過程中發生惡性轉化,導致了印戒細胞癌的形成.近年來,隨著腫瘤幹細胞學說的興起,有學者提出了胃癌幹細胞的概念18,並認為胃癌幹細胞是驅動胃癌發生發展的根源,這在針對胃癌細胞系的研究中已獲得了初步的證據19.而在胃印戒細胞癌,Humar等20發現同一癌灶內的印戒細胞其CDH1基因甲基化的位點相同,說明病灶具有單克隆性,起源於同一始祖細胞,因此也提示胃印戒細胞癌內很可能存在胃癌幹細胞.本研究發現分層結構基底部MUC5AC-/lowMUC6-的低分化癌細胞表達musashi-1,說明部分癌細胞具有幹細胞特性,與上述觀點吻合.理論上,腫瘤幹細胞很可能由正常幹細胞轉化而來,而並非源自分化的細胞.因為幹細胞存活壽命較長,有足夠長的時間積累癌變所需的基因事件,同時,其自我更新相關的信號通路已啟動,只需更少的基因事件就可能完成惡性轉化21.研究發現,與結直腸腺瘤形成有重要關係的抑癌基因APC在小鼠的結腸幹細胞失活後可誘發腺瘤形成,並可演進為腺癌,證實了上述觀點22,23.故據此推測胃幹細胞是印戒細胞癌的起源細胞似乎具有一定的合理性.但實際上,具有一定分化程度的前體細胞(祖細胞)也可癌變成為腫瘤幹細胞,這在白血病的研究中已得到證實24.而且新近對小鼠胃腺的研究有力地證實,胃幹細胞實際上位於胃腺的基底部25,26,而非增殖區.因此,如果人的胃幹細胞確實位於胃腺基底部,現有的病理形態學觀察結果不支持胃印戒細胞癌起源於胃幹細胞的觀點,因為部分病例內可見胃腺頸/峽部異型增生並過渡為印戒細胞,而此時胃腺基底部細胞保持正常或僅有輕度異型增生.考慮到分層結構模擬了增殖區向胃小凹上皮分化的過程,同時上述分層結構基底層的低分化癌細胞仍可微弱表達MUC5AC,我們認為胃小凹前體細胞是最可能的來源.此外,有關胃印戒細胞癌是否存在癌前病變目前仍有不同的觀點.Humar等27認為增殖區細胞由於CDH1基因失活導致細胞失去黏附性和分化極性,直接從腺體基板上脫離侵入間質,形成了印戒細胞癌.這一發生模式並不包括異型增生的階段.但Carneiro等28及Rogers等29觀察印戒細胞癌標本發現,癌旁黏膜記憶體在原位印戒細胞癌病灶和上皮異型增生,說明胃印戒細胞癌的發生同其他類型的腫瘤一樣,是一個多步驟多階段的過程,而上皮異型增生可能為此類腫瘤的癌前病變.本研究發現癌旁胃黏膜的增殖區擴展,並且細胞具有異型性,其免疫表型也與基底層癌細胞一致,提示增殖區細胞的異型增生是胃印戒細胞癌的癌前病變.在以往的研究中,我們也曾提出:具有胃型分化(主要表達M U C5AC)的上皮異型增生病變是胃印戒細胞癌的癌前病變30,因為在早期胃印戒細胞癌的癌旁黏膜內常觀察到表達MUC5AC的異型性腺體.根據本研究結果,我們認為上述異型性腺體實質上可能源於增殖區細胞的異型增生.本研究觀察到癌旁胃小凹延長、分支以及小凹上皮的異型增生,與以往研究結果類似,均可能為增殖區細胞向胃小凹上皮分化的過程中發生紊亂所導致.總之,本研究認為胃印戒細胞癌起源於胃腺增殖區MUC5AC-/lowMUC6-的胃小凹前體細胞,同時,該區域細胞的異型增生可能是此類胃癌的癌前病變.上述結論對我們深入瞭解胃印戒細胞癌的發生機制,儘早實施醫學干預降低其名詞解釋分層結構:是早期胃印戒細胞癌的特徵性組織結構,可分為兩層:淺層為分化成熟的印戒細胞,體積較大;底層為低分化的癌細胞,體積小.有時分層結構除以上兩層外,在底層下方還有一層分化程度較高的癌細胞,具有胃腺基底部細胞的分化表型. 死亡率可能具有一定意義.4參考文獻1 Lauren P.The two histological main types of gastriccarcinoma:diffuse and so-called intestinal-typecarcinoma.An attempt at a histo-clinical classification.Acta Pathol Microbiol Scand 1965;64:31-492 Jemal A,Siegel R,Ward E,Hao Y,Xu J,Murray T,Thun MJ.Cancer statistics,2008.CA Cancer J Clin 2008;58:71-963 Henson DE,Dittus C,Younes M,Nguyen H,Albores-Saavedra J.Differential trends in theintestinal and diffuse types of gastric carcinoma inthe United States,1973-2000:increase in the signetring cell type.Arch Pathol Lab Med 2004;128:765-7704 McDonald SA,Greaves LC,Gutierrez-Gonzalez 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