RNA干扰技术的原理与应用.doc

RNA干扰技术的原理与应用 RNA干扰( RNAinterference , RNAi )是通过小干扰 RNA ( small interference RNA, siRNA ) 造成目的mRNA特异性降解, 从而使基因转录后沉默的一种现象。这一现象广泛存在于自然界, 是生物体进化过程中抵御外来基因侵害的一种机制, 为稳定基因组发挥了重要作用。由于 RNAi可以作为一种简单、 有效的代替基因剔除的遗传工具,正在功能基因组学领域掀起一场真正的革命, 并将加快这个领域的研究步伐。1 RNAi现象的发现及发展1995年, Guo等用反义 RNA阻断秀丽新小杆线虫的 part 1基因的实验中发现, 正义和反义 RNA都阻断了该基因的表达,这与传统上对反义 RNA技术的解释相反。1998年 2月卡耐基研究院的 F i re等将双链 RNA ( doublestranded RNA, ds RNA)转入细胞内,发现靶基因的 mRNA发生了降解,证实高度纯化的 ds RNA 可以高效特异的阻断相应的基因表达,而且效率比单链 RNA至少高 2个数量级,首次揭示了 Guo等遇到的现象,即为 RNAi。随后研究发现, RNAi现象广泛存在于各种生物中,是一种古老的重要保护机制, RNAi技术作为一种重要的研究手段大大加速了基因组学的研究进程,现已成为基因功能研究和基因治疗研究的热点。在短短几年中,对 RNAi的研究取得了突飞猛进的发展, 许多令人振奋的报道相继出现, 2001年首次报道了在哺乳动物细胞培养中成功应用 RNAi技术抑制基因表达, 开创了 RNAi技术应用于高等生物基因功能研究的先河; 2002年, K ay研究小组首次报道了应用 RNAi技术在哺乳动物整体水平进行基因表达沉默的实验研究;2004年哺乳动物全基因组范围 RNAi研究也取得了重要进展,先后报道了用酶法构建全基因组 siRNA文库新技术和应用基因组 siRNA文库,从全基因组水平对高等动物基因功能进行高通量 RNAi研究。这些研究成果愈来愈表明, 生物体基因转化的最终产物不仅仅是蛋白质,还包括相当一部分 RNA。2 RNAi的作用机制细胞中 ds RNA 的存在是 RNAi形成的先决条件。ds RNA可以通过多种途径在细胞核或细胞质中产生。通过对 RNAi所进行的遗传学和生物化学的研究,现已初步阐明了其作用机制。RNAi的作用机制可分为三个阶段:起始阶段、 效应阶段和级联放大阶段。 起始阶段:由 RNA 病毒入侵,转座子转录,基因组中反向重复序列转录等所产生的 ds RNA分子在细胞内被一双链 RNA酶!型内切酶也叫 Dicer酶或 Dicer核酸酶同源物剪成 21 23 nt siRNA, 3 端带有 2个碱基突出的黏性末端, 5 为磷酸基团,此结构对于 siRNA行使其功能非常关键。剪切位点一般在U处, 具特异性。效应阶段: RNAi特异性的核酸外切酶、 核酸内切酶、 解旋酶、 辅助识别同源序列蛋白和其他一些蛋白与 siRNA结合成 RNA诱导沉默复合体R I SC ( RNAinducing silence complex , R I SC)识别靶 mRNA,其中的反义链与靶 mRNA互补结合,正义链则被置换出来。继而, R I SC复合物中的RNase(可能是 Dicer)在靶 mRNA与 siRNA结合区域的中间将其切断。级联放大: 在 RNA 依赖性RNA聚合酶的作用下,以 mRNA为模板, siRNA为引物,扩增产生足够数量的 dsRNA 作为底物提供给Dicer酶,产生更多的 siRNA, 从而使效应阶段反复发生,一个完整的 mRNA被降解成多个 21 23 nt的小片段, 从而导致相应的基因表达沉默。在这一过程中的多个步骤都需要 ATP , 如 R I SC复合体的形成、siRNA与靶 mRNA的配对、 靶 mRNA的切割。另外,在 dsRNA复制过程中,两条链的分离可能也需要一个依赖 ATP的 RNA解旋酶。dsRNA可通过细胞微管在细胞间传递, 实现dsRNA在整个个体中的散布。RNAi在植物、 线虫、果蝇等低等模式生物中,都可由 dsRNA诱导,在哺乳动物细胞中, 30 bp的 dsRNA会引起干扰素效应和非特异性基因抑制, 导致 mRNA非特异性降解,是医疗上应用 RNAi的一大障碍,随后发现合成双链的只有 19 21 nt的 siRNA却可以避免这种效应, 特异性发挥 RNAi作用, 并发现在哺乳动物细胞中转入双链 RNA ( dsRNA )后导致转录后基因沉默比用核酶或反义 RNA更彻底、 更有效。E lbash i r等通过瞬时转染体外合成的 21 nt双链 siRNA成功诱导出了哺乳动物细胞的 RNA , i且避免了 ds RNA引起的非特异性反应,这为 RNAi技术在基因治疗领域的研究铺平了道路。3 RNAi的作用特点3 . 1 高特异性 RNAi是转录后水平的基因沉默机制,有高度的序列特异性, 19 nt的 dsRNA几乎可以完全抑制基因的表达,而其中的 1 n t突变后, 它对基因的抑制作用就消失了, 这种高度的序列特异性能够使 ds RNA非常特异地诱导与之序列同源的 mRNA降解, 避免降解与目的 mRNA同家族的其他 mRNA,从而实现对目的基因的精确沉默。因此, RNAi具有重大的医学价值。3 . 2 高效性 RNAi存在级联放大效应, 由于 Dicer酶切产生的 siRNA 与同源 mRNA 的结合并降解后者,产生新的 siRNA;新产生的 siRNA可再次与 Dicer酶形成 RISC复合体,介导新一轮的同源 mRNA降解的多次利用,如此循环,使相对很少量的 dsRNA分子 (数量远远少于内源 mRNA的数量 )就能产生强烈的RNAi效应 (每个细胞仅需几分子 siRNA就可产生RNAi效应) ,并可达到缺失突变体表型的程度。相比普通的 siRNA, 具有短发卡结构的双链 RNA产生的 RNAi效应更强。3 . 3 高稳定性 ds RNA 可被细胞内的特异性核糖核酸酶家族成员 Dicer酶切割为 21 23 nt的 siRNA。切割后的 siRNA由于 3端悬垂 TT或 UU 碱基, 化学性质稳定,使其不再需要进行任何的修饰就能避免细胞内核酸酶类降解而较稳定的存在。3 . 4 浓度时间依赖性 RNAi效应存在时间、 浓度双重依赖性: 干扰效应常出现注射 ds RNA的 6 h后,在注入 ds RNA的 2 3 d后的作用最强,可持续效应72 h以上; 而其干扰强度则随着浓度的增高而增强。只有连续注入 ds RNA, 沉默效应才能持续下去, 否则将产生短暂的沉默效应, 而且这种效应的强度与初始 dsRNA的浓度有关。另外, RNAi还具有对靶 mRNA的切割位点确定性高、 对细胞调控系统无影响、 作用快速、 穿透性高及操作简便等优点。3 . 5 可传播性 Fire等观察到将 dsRNA注射入线虫体内,这些 ds RNA可以从注射处的细胞扩散到体内其他细胞, 引起其他细胞的基因沉默, 表明了RNAi作用的可扩散性。3 . 6 可遗传性 siRNA介导的 RNAi具有一定的可遗传性。Fi re等将 dsRNA注射入秀丽新线虫的性腺后,在其第 1代中也诱导出了同样的基因抑制现象, 即证明了它的遗传性。3 . 7 靶基因位点的高选择性 外源性 dsRNA的传入只对成熟 mRNA产生作用,对 mRNA前体没有或很少具有影响,以内含子或启动子构成的外源ds RNA无法引起 RNAi效应。4 RNAi的应用4 . 1 基因功能的研究 人类已经进入后基因组时代, 需要大规模高通量的研究基因的功能, RNAi技术具有高效特异阻断基因的表达等特征, 也就责无旁贷地成为研究基因功能的强大工具, 已有若干实验室运用 RNAi技术进行大规模的基因组筛选。其基本原理就是针对一基因组不同的部分设计对应的 ds RNA,构建 dsRNA文库,分别导入不同个体细胞内, 通过蛋白表达的改变来筛选基因并确定基因功能。有研究利用离体和活体 RNAi方法来沉默根节线虫的编码一种保守的 RKN (根节线虫)分泌肽基16D10 ,并且证实这种寄生基因在根节线虫的植物寄生过程中起到关键作用。目前, 哺乳动物中非特异性 RNAi效应的克服和新型表达载体的问世,为哺乳动物基因功能的研究提供了一种高效的途径, 其与基因芯片等技术结合,可高通量分析各基因的功能。4 . 2 基因表达调控 在基因组学的研究中, 基因表达调控是研究基因功能的一个重要部分, 而基因功能缺失策略在基因表达调控中具有特殊重要地位。RNAi技术对于建立基因剔除动物模型具有相当大的应用前景。K i m等将 siRNA运用于鼠卵母细胞和植入前胚胎中, 利用针对内源性的 Oct3 /4和 cmos基因的 siRNA, 成功地清除了内源性的 O ct3 /4和Mos产物, 结果产生了与 Oct3 /4和 cmos基因剔除相类似的表型,证明了 siRNA对小鼠早期发育的分子生物学研究是一个非常有用的工具。Dubouzet等在 2005年报道了用 RNAi技术抑制黄连中异喹啉生物合成途径中金黄紫碱甲基转移酶基因,使该酶的表达水平明显降低。A llen 等用RNAi技术一次性抑制罂粟中可待因酮还原酶基因家族中所有基因的表达,结果也产生了预期的效果。RNAi转基因小鼠的出现,使得在哺乳动物整体水平研究基因的剔除成为可能。4 . 3 基因治疗 siRNA的特异性有效保证了哺乳动物细胞中 RNAi效应的特异性,结合已有的高效基因导入系统,使得 RNAi在那些由于基因表达异常增高而引起的疾病(如肿瘤、 病毒感染)中的作用优于目前以抑制基因表达为目的而采用的反义技术和核酶等方法。人们正在探索利用 siRNA 来治疗肿瘤、 病毒感染核免疫缺陷等重大疾病, 并且取得了一定成果。Z immermann等针对为猕猴的阿朴蛋白 B编码的基因施用 siRNA, 成功降低阿朴蛋白 B、 血清胆固醇和低密度脂蛋白的水平。这是首次在非人类灵长类动物中有关 RNAi的全身用药, 是 RNAi在药物治疗方法上重要进展。研究人员首次通过利用siRNA能够有选择地抑制 PI 3K路径的成分并抑制实验动物中移植的人类结肠癌细胞的扩散。RNAi可以特异性的抑制基因表达,所以可用于基因病, 病毒感染、 癌症的治疗。同一基因家族的多个基因具有一段同源性很高的保守序列, 设计针对这一区段序列的 ds RNA 分子引发 RNAi，那么只注射一种 dsRNA即可以产生多个基因同时剔除的表现, 也可以同时注射多种 ds RNA而将多个序列不相关的基因同时剔除。Turner等针对人类免疫缺陷病毒 1基因组的 LTR ( long ter m i nal repeate , LTR )、v i f和 nef设计了 siRNA,将 siRNA转染进人类免疫缺陷病毒后,这些基因的水平降低了 95 %。运用 RNAi方法对比观察了低氧诱导因子 1和低氧诱导因子 2 ,均有一定程度的调节血管生成基因的作用。4 . 4 药物筛选 RNAi还应用于鉴定药物靶位和筛选药物方面。RNAi的应用明显地缩短了从鉴定到认识药物靶基因功能的时间, 有助于药物开发过程中对已知靶基因功能的高通量分析。利用 RNAi技术使丘脑下部一种豚鼠相关肽的表达量减少了 50 %。豚鼠相关肽使代谢率提高而不减少摄食量,从而减轻肥胖,为肥胖的治疗提供了一个靶点。5 结 语虽然人们对 RNAi的研究只有短短的十几年时间,但进展却极为迅速。可以认为 RNAi是个以小分子 RNA为中心的真核细胞基因表达调控系统,它可以在多个层面调节基因表达和细胞的增殖分化,通过对 RNAi的研究将会使人们对生命现象的认识更加深入。但 siRNA技术也存在一定的缺陷, 如对靶 mRNA以外同源序列的非特异性抑制, 各种载体和 siRNA本身所诱导的免疫反应。此外, 过量导入siRNA可能干扰细胞