人类疾病动物模型

人类疾病的动物模型AnimalmodelsofHumanDiseases YanshuZhang Professoryanshuzhang Definition 人类疾病动物模型是指医学研究中建立的具有人类疾病模拟表现的实验对象和相关材料 人类各种疾病的发生 发展是十分复杂的 但以人作为实验对象来研究是有局限性的 许多实验在道义上也受到限制 不可能也不允许在人体上进行实验 但利用动物复制疾病模型加以研究 克服这些不足 Significant 避免了临床实验的局限性利于对发病率低 潜伏期或病程长的疾病的研究可增加方法学的可比性同时获得大量的实验材料取材方便 简化实验方法有助于全面认识疾病的本质 PrincipleandEvaluation 相似性大鼠自发性高血压 人类原发性高血压 小型猪自发性冠状动脉粥样硬化 人类冠心病 狗自发性类风湿性关节炎 人类类风湿性关节炎首先要在动物选择上加以注意 如 猪的皮肤与人类十分相似 皮肤烧伤 皮肤疾病模型 其次复制动物模型实验方法上不断改进 如 复制阑尾炎穿孔动物模型 结扎兔阑尾血管 与人类大不相同 若结扎兔阑尾基部而保留血供 就与人类很相似 重复性理想的人类疾病动物模型应该是标准化的 可重复再现的 应尽量选择标准化实验动物 也应在标准化动物实验设施内完成 要均一性可靠性应力求可靠地反映人类疾病 PrincipleandEvaluation 人类疾病动物模型种类很多 可按不同情况进行分类 按产生原因分类 按系统范围分类 按模型对象分类 按中医体系分类 1按产生原因分类自然获得性人类疾病动物模型是自然获得的 是利用动物自发性的遗传特性建立而成 或通过育种发现的遗传特性培育而成 动物模型的分类 1 突变性动物模型 mutantanimalmodels 指未经任何人工处理 利用动物在自然条件下发生疾病来用作模型 2 抗病性动物模型 negativeanimalmodels 是指特定的疾病不会在某种动物身上发生 从而探讨为何这种动物对该病有天然的抵抗力 3 异构性动物模型 differentconstructanimalmodels 是指利用健康动物生物学特征来提供疾病模型 4 培育性动物模型 breedinganimalmodels 是指通过遗传育种手段将基因突变异常表现保留下来用作疾病模型 动物模型的分类 自然获得性 人工复制性人类动物模型又称为诱发性动物疾病模型 derivationalanimalmodels 又称实验性动物模型是指通过物理化学生物复合及生物技术因素作用于动物复制疾病模型 动物模型的分类 1 物理因素诱发的动物模型 physicalanimalmodels 是指用常见的物理方法如机械损伤 放射线 气压 手术等复制的动物模型 例如外科手术复制的大鼠急性肝衰和肺水肿动物模型 放射线复制的放射病等 2 化学因素诱发的动物模型 chemicalanimalmodels 是指用化学的方法复制的动物模型 如化学致癌 化学中毒 强酸碱烧伤 某种有机成分的增或减导致营养性疾病等复制的动物模型 动物模型的分类 人工复制性 3 微生物因素诱发的动物模型 microorganismanimalmodels 是指用常见的生物方法 如细菌病毒寄生虫等复制的模型 例如柯萨奇B病毒复制大小鼠猪等心肌炎模型 志贺杆菌复制猴的细菌性痢疾等 4 复合因素诱发的动物模型 complexanimalmodels 是指两种以上的方法复制的模型例如 大鼠或豚鼠的慢支 细菌 寒冷香烟 寒冷细菌 SO2 大鼠肝硬化 CCl4 胆固醇 乙醇等因素来复制 大鼠肿瘤 二甲基偶氮苯胺 射线 动物模型的分类 人工复制性 5 生物技术制作的动物模型 biotechnicalanimalmodels 是指利用动物卵或胚胎移植 胚胎嵌合 细胞核移植 转基因和克隆等生物技术复制的模型 嵌合体动物模型Chimeraanimalmodels 核移植动物模型Nucleustransplantanimalmodels 转基因动物模型Transgenicanimalmodels 基因敲除动物模型Geneknockoutanimalmodels RNAi 克隆动物模型Cloninganimalmodels 动物模型的分类 人工复制性 嵌合体动物模型 细胞移植动物模型 是指对一个结构已知但功能未知的基因 从分子水平上设计实验 将该基因去除 或用其它顺序相近基因取代 然后从整体观察实验动物 推测相应基因的功能 这与早期生理学研究中常用的切除部分 观察整体 推测功能的三部曲思想相似 基因敲除除可中止某一基因的表达外 还包括引入新基因及引入定点突变 既可以是用突变基因或其它基因敲除相应的正常基因 也可以用正常基因敲除相应的突变基因 基因敲除 geneknockoutorKnockin 技术路线 1 构建重组基因载体 2 用电穿孔 显微注射等方法把重组DNA转入受体细胞核内 3 用选择培养基筛选已击中的细胞 4 将击中细胞转入胚胎使其生长成为转基因动物 对转基因动物进行形态观察及分子生物学检测 基因敲除的靶细胞目前最常用的是小鼠ES细胞 基因敲除 geneknockoutorKnockin 基因敲除的应用领域主要有 1 建立人类疾病的转基因动物模型 为医学研究提供材料基因敲除小鼠是研究疾病的发生机理 分子基础及诊断治疗的重要实验材料 如1989年囊性纤维化病 CF 的致病基因 CFTR 被成功地克隆 1992年成功建立了CFTR基因的基因敲除的CF小鼠模型 为CF基因治疗提供了很好的动物模型 得以顺利通过了通过了基因治疗的动物试验 于1993年开始临床试验并获得成功 2 改造动物基因型 鉴定新基因和 或其新功能 研究发育生物学3 治疗遗传病 即基因治疗 这包括去除多余基因或修饰改造原有异常基因以达到治疗的目的 4 改造生物 培育新的生物品种相关资源MouseKnockout MutationDatabase 基因敲除 geneknockoutorKnockin RNAInterference RNAi Outline RNAi historyanddiscoveryHowdoesRNAiwork TheprocessofusingRNAiasaresearchtoolTheexample Ctr1gene RNAi Definition Amechanismthatinhibitsgeneexpressionatthestageoftranslationorbyhinderingthetranscriptionofspecificgenes Itplaysaroleinregulatingthedevelopmentandmaintenanceofagenome ControlArchitecture Genome Transcriptome Proteome RegulationbyRNA methylation RNAi Ribozymes TypesofRNA RNAi DiscoveryandHistory Experimentexpectation In1990 RichardJorgensen slaboratorywastryingtocreatepetuniaswithadeeperpurplehue Dr RichardA JorgensenProfessor EditorinChiefofThePlantCellForbesBuilding Room303Phone 520 626 9216Email raj ag arizona edu CHS TheActualOutcome Howcouldaddingcopiesofageneforenhancingpigmentresultinlesspigment RNAi DiscoveryandHistory 1990plantcell1995science RNAi DiscoveryandHistory AndrewZ FireStanfordUniversitySchoolofMedicineStanford CA USA CraigC MelloUniversityofMassachusettsMedicalSchoolWorcester MA USA TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine2006 fortheirdiscoveryofRNAinterference genesilencingbydouble strandedRNA HowDoesRNAiWork RISC RNAinducedsilencecomplexesRITSRNA inducedinitiationoftranscriptionalgenesilencing SmallinterferingRNA siRNA siRNA sometimesknownasshortinterferingRNAorsilencingRNA isaclassof20 25nucleotide longdouble strandedRNAmoleculesthatplayavarietyofrolesinbiology microRNAs miRNA miRNAaresingle strandedRNAmoleculesabout21 23nucleotidesinlength whichregulategeneexpression Theywerefirstdescribedin1993byLeeandcolleaguesintheVictorAmbroslab yetthetermmicroRNAwasonlyintroducedin2001inasetofthreearticlesinscience suchaslin 4miR 1 miR 6 miRNAsareencodedbygenesthataretranscribedfromDNAbutnottranslatedintoprotein non codingRNA Pri miRNA Pre miRNA 70nt MaturemiRNAmoleculesarecomplementarytooneormoremRNAmoleculesFunctionistodownregulategeneexpression miRNAFormation RNAimaybeuniversal RNAihasbeenshowntooccurinmanyanimalsincludingmiceandeveninhumancellsUndernormalconditions RNAicanprotectagenomefromsomevirusesormobilegenescalled jumpinggenes RNAiisimportantforregulatinggeneexpression Inparticular itguidesembryodevelopmentbyshuttingdownsomegenesatacriticaltime ForresearchersRNAiisanexcitingnewtooltoexplorehowgenesworkandpotentiallyfortreatingdiseases RNAimaybeuniversal Cont Application biologicalresearchdefininggenefunction geneknockdown definingbiochemicalpathwaystherapeutictreatmentcancerviralinfectionparasiticinfectionAnimalmodelofhumandisease GettingsiRNATransferintothecellsCheckingRNAiefficiency TheProcessofusingRNAiasaresearchtool GettingsiRNA RNAitargetselectionrules TargetedregionsonthemRNAsequenceofatargetedgeneshouldbelocated50 100ntdownstreamofthestartcodon ATG Avoidsequenceswith 50 G Ccontent Avoidstretchesof4ormorenucleotiderepeats Avoid5UTRand3UTR althoughsiRNAstargetingUTRshavesuccessfullyinducedgeneinhibition Avoidsequencesthatshareacertaindegreeofhomologywithotherrelatedorunrelatedgenes GettingsiRNA Designsoftware siRNAdesignsoftware SDS isaweb basedsoftwarewiththefollowingfeatures Itprovidesaunifiedplatformforusingexistingsoftware ItenhancestheexistingsoftwarebyfilteringineffectivesiRNAsbasedonsecondarystructure GettingsiRNA DesignsoftwareContd GettingsiRNA Oneofdesigntool OneofsiRNAdesigntool siRNAdesignprocess Ctr1 Example LookingformRNAsequence Example siRNAdesignprocess Ctr1 Example siRNAdesign Ctr1 GettingsiRNA Homologysearch TheRNAitargetedregiononthemRNAsequenceofageneshouldnotsharesignificanthomologywithothergenesorsequencesinthegenome therefore homologysearchisessentialtominimizeoff targeteffects HerearesomeBLASTtoolsforhomologysearch NCBIBlasttool nucleotideandnucleotideBLAST blastin orsearchforshortnearlyexactmatches BlattoolonUCSCGenomeWebsitehttp genomeucsc edu cgi bin hgBlatEnsemblBlasthttp www ensembl org Multi blastview Getting siRNA homologysearch GettingsiRNA homologysearch GettingsiRNA homologysearch ChemicalSynthesisofsiRNAsiRNAexpressionvector GettingsiRNA SynthesisroughsiRNARemovingtheDNATemplateandAnnealingsiRNAPurifyingsiRNA GettingsiRNATransferringtothecellsCheckingRNAiefficiency TheProcessofusingRNAiasaresearchtool Transfectionmethods ElectroporationAdvantage GoodfortransfectinglargenumbersofcellsatonceDisadvantage Mayaltercellphenotype VirusVectorAdvantage CauseslittlecelldamageDeliverawidevarietyofRNADisadvantage Mayaltercellphenotype TransfectionmethodsContd MicroinjectionAdvantage AccurateDisadvantage Expensiveinstrument fineskillLipofectionAdvantage Highefficiency TransfectalltypesofnucleicacidsinawiderangeofcelltypesDisadvantage MorelimitedintheDNAitcandeliver Transfectionmethods Lipofection Traversa sRNAiDeliveryTechnology PTD DRBD DramaticallysmallerthanaliposomeNon cytotoxicDeliverstotheentirecellpopulationandallcell types FutureTransfectionmethod Transfectionefficiencydependon Celldensity50 confluencyCellproliferationTimeTransientTransfection24h 48 96hStableTransfection GettingsiRNATransferringtothecellsCheckingRNAiefficiency TheProcessofusingRNAiasaresearchtool CheckingRNAiworkefficiency RNAlevel RealtimeRT PCRProteinlevel Westernblotting Immunostaining Ctr1siRNAEfficiency ConSiRNA1siRNA2 50 70 Ctr1 B actin siRNA1 1ullipofectamine 40uMsiRNAsiRNA21 5ullipofectamine 60uMsiRNA Ctr1siRNAEfficiency Immunocytochemistry ConfocalImaging 40Xwaterobjective 488nmexcitation laserpower6 6mWbeforethemicroscope channel1 PMTvoltage500V filter 520 40nm Channel3 transimission PMTvoltage150V 5Cellswererandomlyselectedfromeachimageand3imagesforeachgroupweretaken FluorescencewasquantifiedusingLaserScanningCytometry Controlsamples Bar 20mm SiRNAsample Bar 20mm IntensitycomparisonofCtr1proteinexpression FunctionaltestofCtr1Knockdown Seedingcells MnorPb MnorPb Cu64 FunctionaltestofCtr1Knockdown Seedingcells MnorPb MnorPb Cu64 Barsrepresentmeans S D n 4 6pergroup RNAivendors 1 疾病的基本过程动物模型 animalmodelsoffundamentalpathologicprocesses 是指各种疾病共性的一些病理变化过程模型 例如 发热 缺氧 水肿 休克 DIC 电解质紊乱 酸碱平衡失调等 2 各系统疾病动物模型 animalmodelsofdifferentsystemdisease 是指与人类各系统疾病相应的人类疾病动物模型 例如 消化 呼吸 心血管 泌尿 神经 血液 内分泌 骨骼等 也可按学科分类 内 外 妇 儿 皮肤 五官 眼等 动物模型的分类 按系统分类 3按模型对象分类疾病模型的对象包括整体动物 离体器官和组织 细胞株 4按中医药体系分类按中医可分为阴虚 阳虚 气虚 血虚 脾虚 肾虚动物模型等 按中药可分解表 清热 泻下 驱风湿 利水渗湿 止咳 化痰 活血化瘀 补益 理气药等 动物模型的分类 一 免疫缺陷动物疾病模型1B淋巴细胞缺陷疾病模型CBA A小鼠 起源于CBA H品系 特点是B淋巴细胞功能减退 为X 链隐性突变系 基因符号是Xid 临床表现为免疫球蛋白缺失 细胞免疫正常 常用人类疾病动物模型 自发性 2T淋巴细胞缺陷疾病模型裸小鼠 主要特征为无毛 裸体 无胸腺和细胞免疫功能丧失 由于第十一对染色体上等位基因突变引起 该鼠免疫力低 易感染 生长不良 繁殖力低 这种动物能接受同种或异种组织移植 包括人癌异种移植 可作为肿瘤免疫研究 国内常用裸小鼠品系为BALB Cnu nu Swissnu nu和NCnu nu等 维持费较高 现也有裸大鼠 裸豚鼠等 常用人类疾病动物模型 自发性 3T B淋巴细胞联合免疫缺陷疾病模型Scid Severecombinedimmunedeficiency 小鼠 为严重联合免疫缺陷动物 表现T B细胞大大减少 低 球蛋白血症 低淋巴细胞血症 由于B细胞缺乏在淋巴结内生发中心消失和T细胞缺乏 在脾动脉周围淋巴细胞鞘和淋巴结副皮质区缩小 淋巴细胞减少 细胞和体液免疫功能均缺损 但巨噬细胞和NK细胞功能未受影响 现已广泛应用于免疫细胞分化和功能的研究 异种免疫功能重建 人单抗生产 人类自身免疫性疾病及免疫缺陷性疾病 病毒学及肿瘤学等方面的研究 是理想的动物模型 常用人类疾病动物模型 自发性 二 遗传性高血压大鼠疾病模型自发性高血压大鼠 spontaneoushypertensiverat SHR 高血压 病理生理及组织学变化与人相似 并可产生脑血栓 肾硬化 心梗等变化 目前有八个品系 遗传性高血压品系 GH 自发性高血压品系 SHRSR 中风型高血压品系 SHRSP Milan高血压品系 MNS 盐敏感品系 DS Lyon高血压品系 LH Munster品系 SHM 和Sabra高血压品系 SBH 常用人类疾病动物模型 三 自发肿瘤疾病动物模型几乎所有人类肿瘤都可在动物中找到 小鼠乳腺肿瘤在C3H A He DBA 2发病率高 在C3H雌性动物月龄超过9个月后 发病率达100 肺肿瘤多在A He A JAX 皮肤肿瘤在C57L He BR cd 肝脏肿瘤在C3H C3Hf C3He C57 淋巴网状瘤在C58 AKRC57L 血管内皮瘤在HK BALB C 白血病在AKR等发病率较高 常用人类疾病动物模型 四 自发性糖尿病动物模型KK糖尿病小鼠属先天遗传缺陷性小鼠 该鼠对胰岛素不敏感 对葡萄糖耐性小 糖尿病发病率高 老年鼠偶见肥胖 BBWistar大鼠是一种典型自发遗传 型 胰岛素依赖性 糖尿病 发病率50 70 临床表现为多饮 多食 高血压 酮症 胰岛内 细胞大量破坏等 NIH肥胖大鼠 SHR N cp 是新培育的一种用于肥胖和糖尿病研究的动物模型 表现出与人非胰岛素依赖性糖尿病相似的代谢改变 五 癫痫动物模型普通长爪沙鼠20 出现癫痫 而纯系发病率100 可通过光照 噪声等诱发 动物发作后身体不受伤害 动物很快恢复常态 常用人类疾病动物模型 一 心血管疾病动物模型1动脉粥样硬化动物模型常选用兔 猪 大鼠 鸡 鸽 猴和狗等 常用的方法有高胆固醇 高脂肪饲料法 免疫学法 儿茶酚胺药物注射法等 兔 优点为敏感性高 容易造成模型 时间短 缺点为它的脂质代谢与人类不同 兔表现为血源性泡沫细胞增多 解剖分布以胸动脉为主 小动脉常有病变 猪 与人类相似 结合胸X 线照射 可引起冠状动脉痉挛 狗 还需抑制甲状腺功能 才能复制模型 大鼠对动脉粥样硬化有自然抵抗力 高脂可发生凝血因子水平增高 小鼠 各品系不同对动脉粥样硬化易感性也不同 常用人类疾病动物模型 诱发性人类疾病动物模型 2高血压疾病动物模型可采用肾包扎法及肾动脉缩窄法复制继发性高血压 用噪声刺激复制神经性高血压模型 3心肌缺血和心肌梗死电刺激法 雄兔麻醉后 用弱 强电交替刺激 0 8 1 6mA及4 6mA 右侧下丘脑背侧核 即可形成心肌缺血模型 药物法 给大鼠或兔注射异丙肾上腺素 狗静脉注射麦角新碱复制冠状动脉痉挛 冠状动脉阻断法 用大鼠或狗麻醉 在冠状动脉套上压迫环 复制心肌缺血和心梗模型 常用人类疾病动物模型 诱发性人类疾病动物模型 二 神经系统动物模型1大鼠卒中模型结扎大鼠中动脉可形成卒中模型 该模型优点是能产生非致命性孤立性病灶损害 可提供长期的行为学和生物化学的研究 2兔脑积水模型选用雌性幼兔 饲以限制维生素A饲料 可诱发兔脑积水 该模型易复制 可同时获得较多胎兔和新生兔的样本 通过血清维生素A的监测 可控制血清中维生素A的浓度 有利进行生化和形态学的研究 3诱发性大鼠纹状体损害将红藻氨酸溶于人工脑脊液中注入大鼠纹状体内 可选择性诱发亚急性或慢性纹状体损害 该模型用于研究纹状体神经元变性引起的病变 4大鼠囊状脑动脉瘤结扎大鼠颈总动脉 同时佐以去氧皮质酮和高渗盐水处理 饲喂含有 氨基丙睛的饲料 即形成大鼠囊状动脉瘤模型 此模型用于研究人类脑动脉瘤与血液动力学的关系 病变的发展及发病机理 常用人类疾病动物模型 诱发性人类疾病动物模型 二 神经系统动物模型5老年痴呆老年大鼠外出海马伞切断半乳糖注射小鼠6帕金森病模型6 羟基多巴胺注射MPTP 常用人类疾病动物模型 诱发性人类疾病动物模型 三 消化系统疾病动物模型l小牛轮状病毒性肠炎模型轮状病毒能引起人类与许多动物患感染 如小鼠 兔 羊 猪等 人类与动物还可交叉感染 小牛轮状病毒性肠炎模型有利于生产大量血清与抗原 是传染病学 生理学研究用较好模型 2豚鼠溃疡性结肠炎模型豚鼠口服变质角叉菜 从红海藻中提取 溶液产生溃疡性结肠炎 临床表现与人类溃疡性结肠类相似 是研究溃疡性结肠炎的发病机理 综合征对全身影响和治疗方法的模型 常用人类疾病动物模型 诱发性人类疾病动物模型 3病毒性肝炎动物模型人类病毒性肝炎病毒对宿主有强的选择性 绒猴接种甲肝病人血浆后会产生肝损伤的生化改变和肝病变 发病绒猴的血清再接种绒猴 甚至传5代以后 仍能引起肝病变 非甲非乙型肝炎病人血清接种黑猩猩 肝活检有急性肝炎变化 现已发现鸭肝炎病毒与人肝炎病毒特征十分相似 不少学者用鸭病毒性肝炎动物模型进行研究 免疫性肝炎疾病模型可用肝细胞膜蛋白加佐剂分次注射而产生动物免疫性肝炎模型 常用人类疾病动物模型 诱发性人类疾病动物模型 4上消化性溃疡疾病动物模型十二指肠溃疡是一种常见而病因不明的疾病 选用大鼠能诱发出急慢性十二指肠溃疡 注射丙晴或羟基乙胺后迅速可引起进行性十二指肠溃疡 其病理形态改变与人类患者相似 溃疡见于球部前壁2mm 4mm 常引起穿孔或穿透到肝脏 小的溃疡常位于球部后壁 且必穿透至胰腺 这个动物模型应用于研究十二指肠溃疡的发病机理 实验治疗 5胰腺炎疾病模型选用年轻雌性小鼠 用乙硫氨酸诱发出血性胰腺炎 常用人类疾病动物模型 诱发性人类疾病动物模型 四 呼吸系统疾病动物模型l慢性支气管炎和肺炎可用SO2 烟雾 甲醛蒸气等刺激性气体刺激猴 兔 大鼠 小鼠等动物形成慢性支气管炎的动物模型 2过敏性肺炎的动物模型过敏性肺炎是由于动物吸入了小颗粒生物原性抗原所引起的肺泡炎 如霉菌孢子 灰尘 花粉等所致 呈急性发作 如用鸟粪便 可诱发牛出现过敏性肺炎 这是由于粪便中的蛋白成分引起的 牛吸入后 表现为咳嗽 缺氧 呼吸困难 而慢性期则以咳嗽 过度呼吸为主要病症 病理变化为间质性肺炎 肺泡壁增厚 淋巴细胞 浆细胞和炎性细胞浸润 肺泡间隔内集积淋巴细胞而没有淋巴生发中心 常用人类疾病动物模型 诱发性人类疾病动物模型 3肺气肿动物模型把木瓜蛋白酶 菠萝蛋白酶 胰蛋白酶 蛋白溶解酶分别注入兔 大鼠 地鼠气管内诱发肺气肿动物模型 1978年Kartinsky和Snider曾总结自发性和诱发的肺气肿动物模型 在马 兔 大鼠 小鼠中发现肺气肿 发现花斑小鼠 Blotchymouse 的自发性进行性全小叶肺气肿的模型有遗传性弹力纤维合成障碍 把肺