生物专业综合实训指导书2011.doc

生物产品生产实训指 导 书 生物技术教研室编写2011年7月目 录 第一章 生产实训实施管理规则 2第一节 实训目的与生产组织 2第二节 生产条件要求与步骤 3第二章 酵母生产技术 5第一节酵母菌种选育 6第二节 培养基制备 8第三节 菌种扩培 11第四节 酵母发酵生产 13第五节 酵母过滤分离19第六节酵母产品质量分析和生产成本核算19附录1：发酵罐操作使用规程 20附录2：酵母生产中的检验和分析 23附录3:酵母发酵力的测定 30第二章 糯米甜酒的生产技术 31 第三章 传统小曲米酒生产技术 32 第一章：生产实训实施管理规则 第一节实训目的与生产组织一、实训目的本次实训是在校内进行的一次生产性实训，学生将利用生物工艺实训室的设备为客户生产食用活性干酵母、糯米甜酒、小曲米酒和果蔬酒。在这次实际生产实训过程中学生将有机会全面应用所学的专业知识和生产管理知识，并进一步熟练专业技能。学生经过这次实训将熟练掌握以下知识和技能。1、微生物菌种选育、纯化和保藏的有关知识和技能； 2、微生物菌种扩大培养的有关知识和技能； 3、培养基制备的有关知识和技能； 4、发酵罐及其附属设备和管路等结构原理和操作技能； 5、发酵工艺制定和过程参数的控制的技能。6、分离发酵产品的知识和技能； 7、发酵产品生产过程质量控制的知识和技能； 8、原材料、中间制品和产品的检验知识和技能；9、发酵工厂生产管理的技能。二、生产组织机构与管理1、组织机构全班分若干个组，每组为一个独立生产单位，负责完成食用活性干酵母生产任务。每个生产单位设置的生产岗位有：（1）厂长：全面负责生产组织； （2）生产技术岗： 负责制定生产工艺及生产控制指标。（3）质量控制岗：负责原材料、中间制品和产品的分析与检验（4）菌种选育岗：负责酒曲、酵母的选育、纯化和保藏，为生产提供合格优良菌种；（5）菌种扩培岗：负责酒曲、酵母的扩大培养为发酵提供充足优良菌种。（6）培养基制备岗：负责制备合格的培养基；（7）发酵岗：负责发酵生产；（8）产品提取岗：负责从发酵液中分离提取产品。2、生产管理按发酵工厂的管理模式管理整过生产实训过程。实行白班制，必要时进行加班，学生上下班要考勤。每一个独立生产单位下班时要写交班记录。教师将按生产秩序、设备与仪器使用熟练程度、产品成功率、生产绩效来考核各小组与个人。 交班记录（表头）班组生产时间 年 月 日 时至 年 月 日 时生产情况存在问题及建议解决办法备注 当班班长：第二节 生产条件、要求和步骤一、生产条件与要求 1、产品名称：食用活性干酵母、糯米甜酒、小曲米酒和果蔬酒； 2、产品质量：执行国家标准；3、产量：食用活性湿酵母250g以上、糯米甜酒和小曲米酒各1KL； 4、客户提供的原料：糖蜜，麦芽，糯米和大米，其它由生产者自备。5、客户提供的主要生产设备：10L发酵罐1个，小型粉碎机1台、恒温培养箱1台，摇床1台，过滤机1台，离心分离机1台，分析检验仪器1套。二、生产进程第一阶段：准备阶段 实训动员，学生分组并接受生产任务。 认真阅读生物技术综合实验指导书，回答各章节的思考题。 查阅资料，阅读指导书，掌握食用活性干酵母、糯米甜酒、小曲米酒和果蔬酒的生产技术并制定初步的生产工艺方案，包括工艺流程及参数、具体工作进度表以及有关检验方法。 向实训室管理教师领有关实训仪器、试剂。 熟悉生产设备，熟练发酵罐的操作。第二阶段：糯米甜酒和小曲米酒的生产 酒曲的选用。 培养基制备。 发酵。 酒过滤与蒸馏。 酒陈酿。 酒质量测定。第三阶段：活性干酵母生产用酵母菌种的选育和保藏 酵母的选育用的培养基制备 钭面、平板的制备。 美兰染色液的配制。 酵母的分离和纯化。 酵母菌种质量鉴定。 酵母的保藏。第四阶段：酵母菌种扩培和发酵用培养基制备 估算种子扩培及发酵生产用培养配方，并计算其用量。 确定培养基制备工艺：糖蜜处理工艺、麦芽汁制备工艺。 进行培养物料衡算，根据制备工艺制备培养基 培养基质量检测第五阶段：酵母菌种的扩大培养 制定种子扩培流程。 确定各级培养基的配方。 估算各级培养基的用量。 配制各级培养基并灭菌。 进行扩大培养。 各级培养结束，必须进行镜检观察酵母形态，测定酵母的大小、浓度、出芽率、死亡率，并测定培养液中的残糖。第六阶段：酵母上罐发酵生产 制定上罐发酵工艺（接种量、罐压、温度、pH值、通风量和糖浓度） 配制发酵初始培养基及流加糖。 发酵罐空消。 发酵罐实消。 流加糖及其它流加物灭菌。 发酵过程操作控制。 发酵过程检测（残糖、酵母的大小、浓度、出芽率、死亡率）。 绘制发酵过程中的酵母曲线第七阶段：酵母的分离分离酵母，并测定湿酵母的重量。第八阶段：产品质量检验和成本核算 酵母产品发酵力的测定。 核算生产成本第九阶段：实训用品的整理清洗并归还，然后组织笔试、实训后的讨论、总结。第十阶段：整理生产记录报告，并及时上交。第二章：酵母生产技术目前，人们已公认单细胞蛋白（single cell protein,简称SCP）是最具应用前景的蛋白质新资源之一，对于解决世界蛋白质资源不足问题方面将会发挥重要作用，与传统动、植物蛋白质生产比较，发酵技术生产SCP不受季节影响和耕地的制约，具有生产效率高等特点。酵母是SCP资源之一，由酵母开发出的产品多种多样，其中全酵母产品有压榨鲜酵母、活性干酵母、药用酵母、饲料酵母等，酵母提取产品有核苷酸、酶类、维生素类、辅酶类等，这些产品广泛应用于食品、饲料、医药、精细化工等众多领域。目前在广东省生产酵母所用的原料主要是甘蔗制糖生产的副产品糖蜜和麦芽汁，其生产技术请参考糖厂综合利用、啤酒发酵工艺技术和酒精生产技术等。一般的生产工艺流程是：麦芽麦芽汁制备麦芽汁糖蜜糖蜜处理清净糖蜜上罐培养配制发酵硅藻土过滤湿酵母 下班生产菌种菌种扩培上罐菌种第一节 酵母菌种选育优良的酵母菌种是酵母生产的基础和关键，要使酵母生产的产量和质量有较大的改善，首先必须选育性能优良的生产菌种。理想的酵母生产工业发酵菌种应符合以下要求。(1)遗传性状稳定；(2)生长速度快，不易被噬菌体等污染；(3)酵母的产量尽可能接近理论转化率； (4) 酵母的发酵力大，不会分泌对人体有害的物质；(5)尽可能减少产物类似物的产量，以提高目标产物的产量及利于产物分离； (6)培养基成分简单、来源广、价格低廉； (7)对温度、pH、离子强度、剪切力等环境因素不敏感； (8)对溶氧的要求低，便于培养及降低能耗。 菌种选育包括根据菌种自然变异而进行的自然选育，以及根据遗传学基础理论和方法，人为引起的菌种遗传变异或基因重组,如诱变育种、杂交育种、原生质体融合和基因工程等技术。后一类方法在微生物的菌种选育工作中占踞主导地位，其中通过分子生物学手段，定向构建基因工程菌是微生物育种的重要发展趋势。当然，菌种选育的前提条件是从自然界获得相应的原始菌种。1. 从含有酵母原始菌种的样品中获得新菌种原理通过分离纯化获得新菌种的具体过程大体可分为采样、增殖、纯化和性能测定等步骤。其原理请参阅工业微生物学有关内容。2. 材料和仪器设备 含有酵母原始菌种的样品3支； 12 oBx的麦芽汁，已处理的糖蜜，面粉、食盐，还原糖测定试剂。 三角瓶、烧杯、糖度计、灭菌锅、培养箱、发酵力测定装置。3. 分离纯化步骤： 工艺流程：菌悬液制备梯度稀释稀释液涂布平板2830 培养3648 h挑单菌落划斜面2830 培养3648 h斜面菌种性能测定生产菌种培养基：在12 oBx左右麦芽汁中，加入2%（w/w）的琼脂，加热溶解，调pH6.4左右。各阶段要求： a、菌悬液制备：称取一定量菌种来源物，放入装有100mL无菌水和玻璃珠的三角瓶内置于摇床摇晃30分钟，使样品中微生物细胞充分分散悬浮于水中，制成菌悬液； b、菌种梯度稀释：菌种梯度稀释是为了在平板能形成单菌落，通常可将上述菌悬液依次稀释为105、106、107、108浓度梯度； c、平板涂布：将上述各浓度梯度分别涂布麦芽汁琼脂平板，每个浓度分别涂3个。将涂布好的平板在培养箱中于2830 培养3648 h； d、挑单菌落：从培养好的平板上，挑选生长旺盛，菌落边缘齐整且比较大的酵母单菌落，分别接种至二支斜面，在培养箱中于2830 培养3648 h。一支用于性能测定，一支保藏在冰箱作生产备用种。 e、性能测定：通过镜检、小样摇试和发酵力测定对菌种进行筛选，确定最终生产种。 备选菌种性能测定表（表头）备选菌种编号 评价指标生产用种编号：注：1、平板制备方法：在12 oBx左右麦芽汁中，加入2%（w/w）的琼脂，加热溶解，调pH6.4左右，装入带棉塞的试管中，在高压灭菌锅中灭菌，于0.07 MPa下保温15分钟，然后冷却至50左右，倒入事先已包扎灭菌好的平皿中。2、评价指标由生产者参考工业微生物和发酵技术确定第二节 培养基制备本次实训生产酵母用的原料是糖蜜和麦芽，要经处理后主可被酵母菌利用，其处理工艺原理和工艺参数确定方法请参考参考糖厂综合利用、啤酒发酵工艺技术和酒精生产技术等有关资料。一、麦芽汁制备1. 工艺流程麦芽粉碎糖化过滤煮沸冷却沉淀分离麦芽汁2. 材料与与仪器 大麦芽（无霉变、虫蛀）。 水浴锅、烧杯、比色板、碘液、玻璃棒、纱布、漏斗、电炉、高压灭菌锅、粉碎机、过滤机、糖度测定仪。3. 生产操作说明 根据物料衡算结果，称取大麦芽，用粉碎机粉碎（粉碎度适中，麦皮不能过碎）。 按质量比：麦芽粉：水=1：6加水。 参考啤酒工艺的糖化工艺操作进行糖化操作。 用麦糟过滤，沉淀物，得澄清的麦芽汁。 将滤得麦芽汁煮沸15分钟，过滤、冷却至10，取上清液。 灭菌：把制得麦芽汁置于三角瓶中，瓶口加盖棉塞，在高压灭菌锅中灭菌，于0.07 MPa下保温15分钟。注：上罐发酵用的麦芽汁经煮沸40分钟，过滤后即可使用，不必冷却。 糖化工艺生产记录（表头）时间 物料量与工艺参数1、2、3、4、设定值实际值操作人备注 二、糖蜜处理的方法1. 工艺流程原糖蜜稀释酸化加热、通风中和沉淀分离过滤清糖蜜2. 材料与与仪器原糖蜜、硫酸、氧化钙、还原糖测定试剂不锈钢锅、烧杯、pH计、电炉、高压灭菌锅、过滤机、锤度计，常规玻璃仪器。3. 糖蜜处理量的计算：根据发酵工艺要求的最后发酵体积及发酵液的菌体浓度要求，结合菌体对糖蜜的得率常数，计算所需的总糖量，再乘以放大系数1.2，作为最后需要糖蜜总量。4. 糖蜜处理步骤: 稀释糖蜜稀释至3040 oBx。 调酸一般用浓硫酸调节pH值至3.5左右，硫酸的用量视糖蜜品种和产地不同而有所区别。由于酸中带有阳电荷的氢离子和带阴电荷的糖蜜胶体物质相互作用，胶体凝聚成絮状物，使之沉淀分离；加酸使部分双糖转化为单糖；加入的硫酸与后来加入的石灰乳作用生成硫酸钙沉淀，在沉淀过程中吸附胶体色素等；加酸后释放的挥发酸，可在加热和通风时被驱逐。 加热煮沸并通风加热煮沸并通风6090min，促使胶体蛋白质凝固，便于沉淀；杀死营养细胞；驱逐有害气体。 加碱中和加石灰乳调pH值至5.05.5，并适当补加水使其浓度为3040 oBx，便于杂质沉淀排除。 澄清静止澄清24小时以上，取上清液过滤备用。糖蜜处理生产记录（表头）时间 物料量与工艺参数1、2、3、4、设定值实际值操作人备注5. 糖蜜处理工艺评价处理后的糖蜜质量 外观：清澈透亮、棕色或红棕色，无沉淀和明显悬浮物。 总浓度3040 oBx，含可发酵性糖250g/L左右，pH 5.05.5。 钙的含量 0.02%；胶体含量 0.1%；灰份含量低。 发酵糖转化率计算糖蜜处理工艺评价表（表头）工艺方案 评价指标1、2、备注第三节 菌种扩培菌种扩大培养的生产目的是从少量酵母繁殖出大量质量高的酵母细胞，以供给发酵罐发酵时所需酵母种子。本次实训生产酵母的扩培工艺方案确定，请参考糖厂综合利用、啤酒发酵工艺技术和酒精生产技术等有关资料。一、扩培工艺流程分离纯化原种钭面试管培养液体试管培养一级三角瓶培养二级三角瓶培养上罐要求：1、接种量10%15%； 2、上罐时间要安排在上午7：308：00之间。 3、每级扩培转接时间不能安排在下半夜。二、扩培培养基在工业生产与实验室中常用的酵母培养基配方如下，仅供参考，实施方案由生产者查阅有关资料确定：培养基1：葡萄糖50克 磷酸二氢钾2.5克 尿素1克酵母膏0.5克 硫酸镁1克 硫酸铁0.1克孟加拉红（1%）0.23毫升 水1000毫升培养基2：马铃薯（去皮）200克 水1000毫升将马铃薯洗净去皮，称取200克，切成小块，加1000毫升煮沸1小时，用双层纱布滤成清液。加水补充因蒸发而减少的水分。培养基3：蔗糖150克 蛋白胨5克 磷酸二氢钾5克硫酸镁2克 碳酸钙5克 水1000毫升培养基4：蛋白胨3% 酵母膏0.5% 酪蛋白水解物0.5%葡萄糖4% 硫酸锌1.4% 自然PH 值培养基5：豆汁100毫升 酵母膏2克 葡萄糖3克自然PH值豆汁制备：取黄豆100克，加水1000毫升，煮沸3040分钟取汁备用。培养基6：将普通麦芽汁稀释到12Bx，调pH约6.4即成。培养基7：将普通麦芽汁稀释到12Bx，加营养盐后调pH约6.4即成扩培过程注意事项： 1、在菌种扩培过程中，必须严格采用无菌操作方法，手、接种针及三角瓶瓶口均需用75%酒精擦拭。2、菌种在扩培过程中必须镜检跟踪酵母的生长状况。菌体形态正常，圆形或椭圆形，没有杂菌；菌体内较少空泡；出芽率2030%；美蓝染色，酵母菌的死亡率在1.0%以下。酵母培养液应具有酵母香味或少许酒味，不能有其他杂味。三、扩培操作说明1、 斜面试管培养：首先用12 oBx麦芽汁加入2%琼脂，制成试管斜面培养基，灭菌后备用。在无菌条件下，将原种一环，转接到上述培养基中，在2830 下培养2 3d，待斜面上长了白色菌苔，即培养成熟。 2、液体试管培养：用12 oBx麦芽汁制成试液体试管培养基，灭菌后备用。在无菌条件下，将斜面种一环，转接到上述培养基中，在2830 下培养24h。 3、三角瓶培养：按制定配制三角瓶培养基，灭菌后备用。将上述液体试管种全部倒入三角瓶，然后进行摇床培养，150 rpm，2830 ，812 h，镜检酵母形态、测定浓度、出芽率、死亡率。培养成熟后，将培养液接入下一级。四、 成熟培养醪（种子液）的质量要求 生产者要参考糖厂综合利用、啤酒发酵工艺技术和酒精生产技术等确定成熟培养醪（种子液）的质量要求。一般的质量要求如下： 酵母细胞形态整齐，健壮，不携带有任何其它杂菌； 酵母细胞数108/ml； 出芽率25%； 死亡率1%； 耗糖率为50%左右； 酸度不增加。菌种扩培生产记录（表头）种子编号时间 物料量与工艺参数1、2、3、4、设定值实际值操作人备注第四节 酵母发酵生产在进入酵母生产之前，首先必须熟悉相关的发酵设备的操作规程和注意事项，相关内容见附录1。一、酵母发酵工艺原理当成熟种子液接种到发酵培养基中，其繁殖生长是随时间而变化的。通常人们把酵母繁殖生长分为五个时期，即停滞期、对数生长期、减速生长期、静止期和衰老期。了解各个时期的情况对扩大培养酵母是有帮助的。停滞期：酵母在此期间细胞代谢旺盛，降解培养基成分酶含量提高；同样合成细胞组织的酶水平也提高。这阶段由于细胞新陈代谢需要能量。细胞贮藏物质降解，细胞干物质稍降低，此时间的长短与接种细胞的老幼及培养基成分有关，老细胞停滞期长，幼细胞则短，培养基营养好停滞期短，反之则长。对数生长期：这是酵母生长最旺盛的时期，酵母在恒定的时间间隔中，每个细胞以出芽繁殖，一个变成两个，所得的两个细胞在一定时间内变成四个，依此类推繁殖下去。对数生长期的长短依培养基的组成、通氧等情况而定，至营养成分枯竭，代谢产物增多，酵母繁殖速度才受到阻碍。扩大培养酵母最适当的移种时间是在对数生长期，此时虽然酵母总细胞数没有达到最高点，但出芽率最高，可达60%以上，死亡率最小，可在1%以内。此时移种有最短的停滞期，并且以最大速度迅速增长。减速生长期：在此期间，酵母生长迅速降低，每次繁殖时间变化，酵母出现明显的死亡，但总的细胞数仍在增长，只不过增加速度已较对数生长期为迟缓。静止期：此期间新细胞的产生和老细胞的死亡几乎维持恒定，细胞总数恒定或稍有增加。对酵母来说每毫升发酵液细胞数可达1亿个，但细胞出芽率较低，死细胞及老细胞数多。如果在此时移种，一定时间内强壮酵母反而比对数生长期少。衰老期：此时期酵母死亡数已超过新细胞的产生。这是由于培养基中营养耗尽，pH下降、代谢产物的积累所致，一部分细胞自溶为另一部分细胞吸收，活细胞减少。根据发酵产品性质的要求，发酵结束的时间可以选择在对数生长期或减速生长期或静止期。例如，若是生产酵母蛋白饲料，发酵结束的时间可以选择在静止期。当然，酵母发酵生产最好的结果肯定是在单位时间内、在单位容积的发酵罐中获得最多且活力最高的酵母。酵母发酵生产受培养基组成、温度、pH值、通氧量等因素影响，为了获得尽可能多且活力高的酵母，应注意控制以上各个因素，满足酵母的繁殖生长，可延长酵母的对数生长期，不但酵母活力高，而且随着对数生长期的延长，酵母细胞数量也不断增加。 温度：培养酵母之最适温度为2630； pH值：发酵液的pH之所以维持4.24.5，主要在防止细菌侵入，因为细菌生长的pH范围在6.08.0。如pH低于4.0，则酵母易被着色，故pH不能过低，若pH过低，应及时用碱液调整。 通气：通气的目的在于防止酒精生成，并促进酵母繁殖。因此发酵液中，必须供给充分的可溶性氧。从理论上而言，氧化一公斤糖约需1.006kg(0.726m3)氧气，但实际上溶氧受发酵罐的许多条件下影响，故所需空气量并不一定。根据White的研究，氧化0.454 kg糖蜜大约需要3.09 m3空气。 糖液流加量：酵母的收率能否达到最高，要视糖被利用的情况来决定。换言之，即完全不生成酒精的条件下，分次供给糖分最佳，此为流加法。另外，培养酵母时要注意酵母对糖的得率。酵母的生长与代谢不仅取决于是否有氧，而且与糖的浓度有关。由于酵母具有Crabtree效应，当培养基中糖含量高时，即使在有氧条件下，酵母在生长的同时，也会产生大量的乙醇，从而使酵母对糖的得率下降。为了得到较高的酵母得率，就必须控制培养液中的糖浓度。不同的酵母菌种，其Crabtree效应的强弱有所不同。一般来说，酿酒酵母具有较强的Crabtree效应，而假丝酵母等的Crabtree效应相对较弱。如果采用一次性投料的方法生产酵母，若培养基糖浓度低，虽然可获得较高的酵母得率，但培养浓度太低，造成设备利用率太低；若培养基糖浓度高，虽然可获得较高的酵母浓度，但酵母得率较低。因此，酵母的高密度培养采用一次性投料的分批培养是不行的，而采用流加培养的方法可望获得满意的结果。在流加培养过程中，培养基中的糖浓度可按工艺要求控制在较低的水平，在培养过程中根据酵母的耗糖情况流加浓糖溶液，酵母利用多少就补加多少，理想状态是流加速率等于酵母的耗糖速率，使培养基中糖浓度保持在较低的含量。这样，酵母处于低糖条件下生长，因而酵母得率高，随着流加培养过程的进行，酵母的浓度也就越来越高。根据White的理论，酵母的生长率及由糖生成的酵母量，均能用公式算出来。然后根据计算值，来决定糖液的供应量。通常酵母细胞在充分通气及充足营养条件下，酵母之生长率可由下式计算出：P 接种的酵母量A 培养t小时后的菌体量一般工厂培养酵母时，可得=1.151.25( M =0.13980.2231 )的生长率，又每100公斤糖可制得56.7公斤的干酵母，故由此关系可求每小时的耗糖量。 氮源的供给：以糖蜜为原料的流加发酵法生产酵母时，氮源非常缺乏，因此必须另添加氨水、硫铵、尿素等。至于添加量，每10000公斤应添加硫酸铵50公斤。 磷酸的供给：糖蜜中非常缺乏磷酸盐，故必须另添加磷酸盐或磷酸。使用量为酵母重量的3%，亦即为糖蜜的6%。根据我们目前的具体情况（设备和检测等），保持在很低的残糖浓度状态下连续流加浓糖液的工艺较难实现。因此，我们只能选择残糖浓度在5%左右进行间歇流加浓糖液的工艺，即把一定量的酵母种子培养醪接种到发酵培养基中进行生长繁殖，发酵过程控制温度为2830，通风比为1:1.03.0，pH值为4.25.5，当培养基的营养成分消耗至较低浓度（4%左右）时必须及时流加富含营养成分的浓糖液，经过812小时发酵，最后成熟发酵醪送去分离收集酵母。二、发酵培养基的配制及灭菌1. 干燥酵母化学组成每100克干燥酵母化学组成式为: 根据100公斤糖可制得56.7公斤的干酵母以及每100克干燥酵母化学组成式可以计算出C/N、C/P、C/Mg等，即只要知道培养基中的碳源用量，就可以计算培养基中其它元素的配比。2. 初始定容的发酵培养基12 oBx糖液 4.04.5L 85%的磷酸 0.30%（w/v）硫酸胺 3.0%（w/v）硫酸镁 0.20% （w/v）3. 流加的营养液第一次流加：30 oBx浓糖液：400mL（用一个1000mL三角瓶装）无机盐溶液：85%的磷酸 2.0g（即对浓糖液的0.50%）；硫酸胺 26.0g（即浓糖液的6.5%）；硫酸镁 1.6g（即浓糖液的0.40%）；水 150mL；消泡剂 0.51mL （用一个500mL三角瓶装）第二次流加：30 oBx浓糖液：600mL（用两个1000mL三角瓶装）无机盐溶液：85%的磷酸 3.0g（即对浓糖液的0.50%）；硫酸胺 39.0g（即浓糖液的6.5%）；硫酸镁 2.4g（即浓糖液的0.40%）；水 200mL；消泡剂 0.51mL （用一个500mL三角瓶装）第三次流加：30 oBx浓糖液：300mL（用一个1000mL三角瓶装）无机盐溶液：85%的磷酸 1.5g（即对浓糖液的0.50%）；硫酸胺 19.5g（即浓糖液的6.5%）；硫酸镁 1.2g（即浓糖液的0.40%）；水 150mL；消泡剂 0.51mL （用一个500mL三角瓶装）4. 流加碱液 碱液:10%的300mL（装在一个500mL三角瓶中） 5. 消泡剂消泡剂与水的混合液（消泡剂：水=1：1）50mL（装在一个100mL三角瓶中）6. 灭菌 初始定容的发酵培养基在发酵罐内升温灭菌，121保温10min。 流加的营养液装在三角瓶中，置于灭菌锅内灭菌，121保温20min。 流加的碱液装在三角瓶中，置于灭菌锅内灭菌，121保温20min。 流加的消泡剂与水的混合液装在三角瓶中，置于灭菌锅内灭菌，121保温20min。三、发酵过程控制1. 发酵过程控制的模式（仅供参考）发酵工艺的种类很多，下表仅是一种模拟的发酵过程控制，请学生根据自己设计的工艺以及上罐发酵时的具体数据进行灵活控制。2. 发酵过程中，若pH值低于控制要求，须流加碱液调节。3. 发酵过程中，若泡沫过多，出现逃液现象，须流加消泡剂消泡。发酵过程控制的参数值发酵时间残糖%温度PH值通风比流加营养液0728304.25.01:1128304.25.01:1.5228304.25.01:1.53428304.25.01:2.0第一次428304.25.01:2.05428304.25.01:2.5第二次6428304.25.01:2.5第三次728304.25.01:3.08228304.25.01:3.0928304.25.01:3.01028304.25.01:2.5发酵生产记录（表头）时间 物料量与工艺参数1、2、3、4、设定值实际值操作人备注注：必须确保发酵初始和结束时的工艺参数准确无误。第五节 酵母分离发酵结束后，应在很短时间内把酵母从发酵醪中分离出来，用12倍的自来水洗涤分离浓缩的酵母乳23次，以除去酵母分泌的代谢产物、杂菌（细菌）和酵母细胞表面吸附的色素等物，从而使分离浓缩的酵母乳成为1216%浓度的乳白色至乳白黄色。本次实训酵母分离采用硅藻土过滤机进行分离。详细操作方法参考硅藻土过滤机说明书。酵母过滤分离生产记录（表头）时间 物料量与工艺参数1、2、3、4、设定值实际值操作人备注第六节 酵母产品质量分析和生产成本核算一、食用活酵母质量标准 执行国家标准。一、 酵母产品质量分析 产品质量分析记录（表头）时间 物料量与工艺参数1、2、3、4、标准值实际值操作人备注注：各项分析方法参考附录和国家标准二、 生产成本核算 生产报表（表头）序号项目单位数量备注统计人： 审核人： 日期：附录1：发酵罐操作使用规程一、发酵系统组成1、组成发酵设备由电热锅炉、空气压缩机、发酵罐、控制柜、管道组成。一个典型的发酵控制系统由罐体、空气除菌过滤系统、蒸汽灭菌系统、温度测量系统、pH测量系统、溶解氧测量系统等部分组成 空气除菌过滤系统：空气压缩机储气罐冷干机一级预过滤金属膜过滤器（两个串联）发酵罐排气，由压力表和空气流量计控制进气和排气量的大小。蒸汽灭菌系统：电热锅炉产生蒸汽减压阀（0.13Mpa）管道发酵罐冷凝水（进入夹套时）或在发酵液中（直接通入发酵液时）。2、主要技术参数1、发酵罐：10L 灭菌压力0.15Mpa 工作压力0.05-0.07Mpa 灭菌温度：121-125 转速：无级调速 罐温；仪表显示2、空气压力：0.2Mpa二、使用说明1、 上岗前的技术培训SFM-10L发酵罐是机电一体化的设备，因此，操作人员上岗前须熟悉设备的性能，整个系统的工作原理、管路、阀门的操作程序，进行必要的培训，能正确使用设备。未经培训的人员，不得单独上岗操作。2、开机前的准备工作（1）旋开SFM-10L发酵罐的接种口盖，打开视镜灯电源，观察罐内是否有杂物，通风、取样管是否在正常位置，搅拌叶轮是否脱落，有异常需调整好。（2）检查电源是否正常，搅拌电机、空压机能否正常工作。（3）拧紧发酵罐接种口盖。（4）检查系统上的阀门是否在正确位置，接种口及紧固螺钉是否拧紧。（5）开动空压机，用0.15 Mpa压力，检查发酵罐、过滤器、管路、阀门的密封性能是否良好。（6）检查温度仪、变频调速器是否正常。3、空消投料前，无菌空气管路、发酵罐内壁及其附属管路阀门必须用蒸汽进行灭菌，消除所有死角的杂菌，保证系统处于无菌状态。（一）空气管路的空消 ： 关紧空气预过滤器和总过滤器之间的阀门，切勿忘掉，因为预过滤器不能受高温。 调整好蒸汽压力，使其在 0.13 0.15 Mpa之间。 缓慢打开蒸汽过滤器前的蒸汽阀门。 按照蒸汽进入的次序依次打开过滤器下面的排气阀门。 排除管道中冷凝水后，关小各过滤器的排气阀门，使蒸汽通过各分过滤器，对其进行灭菌。灭菌时间持续40分钟左右。 空气管路灭菌完成后，依次关闭各分过滤器的排气阀门，最后关闭进入空气管路的蒸汽总阀。（二）、发酵罐及其附属管道的空消 检查夹套内的冷却水是否排尽。 取出PH和溶氧电极（它们不能经受高温，而控温仪不需要），并用封盖封好插口。 拆开排气阀与空气流量计之间的软管。 打开罐两边的蒸汽，以及下面的进阀门，使蒸汽直接进入罐内。微开接种口，打开排气阀使蒸汽通过这些阀门排出。 当罐温超过100时可以关小排气阀，直到罐压达到0.13 0.15 Mpa，关小蒸汽进汽阀，保持罐压为0.13 0.15 Mpa（温度120125）维持时间3040分钟。 空消结束后，打开排气阀，使罐压力与大气压相同，防止突然冷却罐内产生负压，损坏设备。 逐个关上所有的蒸汽阀门，打开空气阀门，吹干空气分过滤器和发酵罐2030分钟，然后将排气阀门和进气阀关闭，使空气系统保持正压备用。4、实消实消是当罐内加入培养基后，用蒸汽对培养基进行灭菌的过程。培养基的量一般以罐体全容积的70%左右为宜。泡沫多的培养基需加入少量消泡剂。考虑到冷凝水和接种量因素，加水一般为罐体全容积的60%左右。从接种口加入起始培养基，开启机械搅拌装置，使罐内物料均匀混合，转速50100rpm。先开启夹套蒸汽阀门对罐内培养基预热，当罐温升到80时，关夹套蒸汽阀门，打开罐内所有蒸汽进汽阀，加热时应打开排汽阀，将罐顶冷空气排掉，排汽阀排汽量不应过大，以免浪费蒸汽。当罐压升至0.12Mpa，温度升到121123时，控制进汽阀门开度，保持罐压不变，20分钟后从罐底排污阀排掉一点培养基（防止罐底死角）并关上。关死蒸汽阀门和排汽阀门。当发酵罐压小于进气气压时，打开空气进气阀门，同时微开排汽阀门以维持罐内正压。利用夹套通水冷却发酵液，即打开夹套的进水阀门和排水阀门。调节空气进气阀和罐顶排气阀，保持罐压为0.05 Mpa，直到罐温降至接种温度。5、发酵罐接种和营养液的流加本设备采用火焰口接种、流加，应事先准备好酒精、棉花、钳子和接种环。菌种、培养基分别装入三角瓶内，并保持无菌状态。接种量、流加量根据工艺要求确定。将酒精棉花围在接种口周围点燃，用钳子或铁棒拧开接种口，此时罐内压力应排至0 Mpa，并向罐内通气，使接种口空气排出，保证无菌状态，防止空气倒流。将三角瓶的菌种、流加培养基在火环中间无菌区内倒入罐内。动作要协调，无菌操作要规范。接种、流加完毕，将接种口盖在火焰上灭菌后拧紧，熄灭火环。接种后即可通气培养，罐压保持在0.05 Mpa， 另外还有工艺要求的通气量和温度控制。接上流量计与排气口上的软管，调整好通风量。调整好培养温度，并按规定做好原始记录。6、取样发酵中间过程取样时，开蒸汽阀对取样管灭菌5分钟，关闭蒸汽阀，保持罐压0.1 Mpa，打开取样阀，发酵液流入小烧杯（开始流出部分弃取）。7、放罐发酵结束，用蒸汽对出料管灭菌，关闭蒸汽阀，打开排料阀，排出发酵液。排料结束应立即清洗发酵罐，防止发酵物料沉积在管路、阀门及罐壁上。清洗完毕，开空气阀将管路、阀门及发酵罐吹干。附录2：酵母生产中的检验和分析 在发酵过程中，酵母和发酵基质都在发生变化：酵母数量增加，大小形态也随环境基质的改变而改变；发酵基质在支持酵母生长的同时，其中的营养成分也逐渐消耗。然而，要确切地评价原料利用率的高低，酵母质量的好坏，发酵工艺的水平以及发酵的经济效益，就需要用数据来说明，而不是依靠模糊的叙述。获得数据的办法，就是在发酵生产中进行一系列分析化验工作。通过分析检验，第一，可以把好原料质量验收关；第二，可以实行生产过程的监控和管理，降低产品的不合格率；第三，加强产品质量管理，保证产品符合国家行业标准；第四，为生产工艺优化提供数据。发酵生产中依据分析对象不同可分为两大类：酵母的检测和发酵基质的分析。其中酵母的检测内容有：发酵过程中酵母的形态变化；发酵液中酵母量的测定（包括以个数表示，个/ml，和重量表示，g/ml）；发酵过程中酵母的活性分析；酵母产品质量评定等。而发酵基质的分析内容有原料和发酵液中的糖分测定；发酵液的PH和酸度测定；发酵基质中氨氮、氨基氮测定；发酵液中其他重要营养成分的测定。由于分析化验的种类和技术并不是一蹴而就，短时期内就固定下来的，而是在不断地扩大和完善的，上述的分析项目也处于变化中，分析人员可以根据厂里的状况对分析项目进行选择和增减。第一部分：酵母的检测主要介绍酵母的定性的观察和定量测定方法。内容包括：酵母形态的观察；酵母细胞数和出芽率的测定；发酵液中酵母的湿含量；酵母死亡率的测定；酵母细胞大小的测定；一、 酵母形态的观察1、酵母菌的菌落特征：酵母在固体培养基上生长，往往聚集在一起，形成一定形状的细胞群体，称酵母菌落。菌落表面一般是光滑、湿润及粘稠的，也有粗糙带粉粒的，或有皱褶的。边缘整齐，或带丝状。菌落较大、较厚、大多数不透明，呈油脂状或蜡脂状。当菌落呈白色、奶油色或生长时间较长时，其外形逐渐生皱及变干，颜色也往往变暗。酵母菌的菌落特征是鉴定酵母菌的依据之一。2、 镜检操作程序： 斜面培养酵母的制片：取干净的载玻片，在中央滴加一小滴蒸馏水或无菌水,用无菌操作的程序,使用接种环从斜面试管中取出一环酵母菌与水混合均匀,取一盖玻片,使盖玻片的一边与菌液接触,然后慢慢放下,要注意避免在盖玻片和载玻片之间产生气泡。盖玻片边缘多余的水液可用吸水纸吸干，制片完成。 液体培养酵母的制片：取干净的载玻片，用无菌操作的方法，使用接种环从液体酵母中取一环置于载玻片中央，再盖上盖玻片即可。 观察：把制好的载玻片置于显微镜载物上，先用低倍镜观察（倍物镜），待找到焦点后，再用高倍镜观察（倍物镜）。3、结果分析： 酵母细胞形态的检查在生产上是很重要的，在分类学上也有一定的意义。菌种选育时，也将其作为一个指标。酵母细胞的形态往往受环境影响而变化，因此有一定的对比性，各种条件应该统一。一般成熟的细胞大于幼龄细胞，液体培养的酵母大于固体培养的酵母。 酵母的形态有球形、椭圆形、圆柱形、腊肠形、端尖状、一端拱形、三角形等。本次实验使用的酵母，在显微镜下应呈圆形或椭园形，大小均匀，如果出现拉长是不正常现象。 年幼的细胞因细胞膜薄，细胞内部充满细胞质，显得厚而均匀，老熟酵母细胞内出现空泡，内溶物成颗粒状。 在酵母生产的过程中，酵母菌从试管的斜面种扩大成液体三角瓶种，到发酵罐发酵，在这层层扩大的过程中必须经过多次的抽样镜检观察来确定酵母生产质量。二、酵母细胞的计数和发芽率的测定1、测定材料及仪器：显微镜、血球计数板、载玻片、盖玻片、接种环、酒精灯。2、酵母细胞的计数测试方法：血球计数板是一块比普通玻璃较厚的特制载玻片（见图），板的两边的两个突出部分，突起部分为计数区，计数区中央的计数室有个小方格。血球计数板分为两种，一种计数板的刻度是将每个小格组成个中格，共计有个中格，个中格为一个大格，此种计数板为（中格）（小格）的规格。另一种计数板的刻度是将每个小格组成一个中格，共计有个中格，个中格为一个大格，此种计数板为（中格）（小格）的规格。计数板中中格以双线分格，小格以单线分格，当把盖玻片盖于计数室上时，空间的长宽各为mm，高为mm，所以计数室的体积为立方毫米的空间。 样品的稀释：为了方便计数，对取出的样品可有蒸馏水或无菌水进行稀释，稀释程度以计数板每小格内含有个酵母为宜，稀释时可采有十倍系列连续稀释的方法。 酵母菌细胞数的测定： 先将计数板置于显微镜下用低倍镜观察，找到格子后，判断是还是的规格。 再将稀释后的发酵液用滴管吸取一滴样品滴加在计数板的计数区中，用一盖玻片轻轻盖上，避免产气泡，用吸水纸吸去多余水液。 数分钟后，全部酵母细胞沉降到玻片表面，将计数板置显微镜下计数。 计数时，如果使用的计数板，要按对角线方位取左上、左下、右上、右下四个中格进行计数，即计数个小格中的酵母数。如果使用的计数，则除了计数上述四个中格外，还要计数中央的一个中格，即计数个小格的酵母数。观察注意事项：a、计数时，对位于线上酵母菌，可采用只计数两条边的办法。如：只计数位于格子上方和右方两条线上的酵母细胞；b、酵母芽体达到母细胞大小的一半时，即可计作两个细胞，小于一半为一个细胞；c、 为了计数准确,应适当使用细调螺旋调节焦距，将处于不同深度的酵母细胞都能计算在内。3. 每个样品重复计数次，按公式计算每毫升菌液所含酵母细胞数，填写下表。的计数板：100个小格内酵母细胞数酵母细胞数ml= 40010000稀释倍数 100的计数板： 80个小格内酵母细胞数酵母细胞数ml 40010000稀释倍数 80次数 1 2 3平均值中格序号123451234512345细胞数细胞数/ml4. 发芽率的测定方法：可在测定酵母细胞总数时同时测定出芽的芽体数，一般如芽体大于或等于母细胞一半时应将芽体视作单个细胞，不算为芽体，将小于母细胞一半的芽体才计为出芽数。在单位体积内测定得酵母细胞的芽体数占总数的百分率，即为该酵母的出芽率。芽体数出芽率 细胞总数填写下表： 次数 平均值中格序号123451234512345细胞数芽体数细胞数ml芽体数ml出芽率三、发酵液中酵母量的测定取称重后的离心管（W1），量取发酵液100毫升于此离心管内，在粗天平上