多孔磷酸钙骨水泥与转染骨形态发生蛋白2基因的骨髓间充质干细胞复合修复股骨髁骨缺损.doc

www.CRTER.org肖琦科，等. 多孔磷酸钙骨水泥与转染骨形态发生蛋白2基因的骨髓间充质干细胞复合修复股骨髁骨缺损多孔磷酸钙骨水泥与转染骨形态发生蛋白2基因的骨髓间充质干细胞复合修复股骨髁骨缺损肖琦科1，魏玉珊2，赵轶男3，白 峰4 (1宝鸡市中医院骨伤一科，陕西省宝鸡市 721001；2宝鸡市高级职业技术学院，陕西省宝鸡市 721001；3解放军第四军医大学第一附属医院，陕西省西安市 710000；4解放军451医院骨科，陕西省西安市 710000)引用本文：肖琦科，魏玉珊，赵轶男，白峰. 多孔磷酸钙骨水泥与转染骨形态发生蛋白2基因的骨髓间充质干细胞复合修复股骨髁骨缺损J.中国组织工程研究，2016，20(43):6403-6408.DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.43.003 ORCID: 0000-0002-1447-697X(白峰)文章快速阅读：组织工程化骨修复兔股骨髁骨缺损左侧植入转染骨形态发生蛋白2基因的骨髓间充质干细胞复合多孔磷酸钙骨水泥组织工程化骨(实验组)肖琦科，男，1979年生，陕西省宝鸡市人，汉族，2010年解放军第四军医大学毕业，硕士，主治医师，主要从事创伤、骨缺损的修复、骨组织工程研究。通讯作者：白峰，副主任医师，解放军第451医院骨科，陕西省西安市710000中图分类号:R318文献标识码:A文章编号:2095-4344(2016)43-06403-06稿件接受：2016-07-24结果表明：采用基因转染技术将骨形态发生蛋白2转染至骨髓间充质干细胞并与磷酸钙骨水泥材料复合，可显著提高组织工程化骨修复骨缺损的效果植入后4，12周取双侧股骨髁，进行组织形态学分析制作双侧股骨髁缺损模型右侧植入未转染骨形态发生蛋白2基因的骨髓间充质干细胞复合多孔磷酸钙骨水泥组织工程化骨(对照组)文题释义：磷酸钙骨水泥：与天然骨组织成分相同，具有优良的生物相容性、可降解、易成型的优点，已被作为骨移植替代材料和骨形态发生蛋白的载体材料应用于骨缺损修复。将磷酸钙骨水泥材料制备成多孔结构，不仅可改善其在体内的降解性能，而且有利于细胞、活性因子的复合，利于骨组织的长入。骨形态发生蛋白2诱导成骨：在骨形成的过程中补充足量的骨形态发生蛋白2，在局部造成高浓度对骨形成是十分有利的。在骨缺损修复过程中，骨形态发生蛋白2可由成骨细胞分泌，或由机体其他区域分泌到达创区，但量很少不能满足修复需要。因此将外源性骨形态发生蛋白2植入骨缺损区域是目前多采用的提高骨缺损的修复效果的手段。但是由于骨形态发生蛋白2 半衰期短，单独在体内使用会很快扩散或被酶解吸收, 在骨形成的过程中难以充分发挥其骨诱导作用。摘要背景：骨形态发生蛋白能够提高组织工程化骨的成骨能力，但如何控制骨形态发生蛋白在机体局部持续缓慢释放，是构建具有骨诱导能力组织工程化骨的关键问题。目的：观察转染骨形态发生蛋白2基因的骨髓间充质干细胞，复合多孔磷酸骨水泥构建组织工程化骨对骨缺损的修复作用。方法：取新西兰兔12只，制作双侧股骨髁缺损模型，左侧植入转染骨形态发生蛋白2基因的骨髓间充质干细胞复合多孔磷酸钙骨水泥组织工程化骨(实验组)，右侧植入未转染骨形态发生蛋白2基因的骨髓间充质干细胞复合多孔磷酸钙骨水泥组织工程化骨(对照组)。植入后4，12周取双侧股骨髁，进行组织形态学分析。结果与结论：Van-Gieson染色：植入4周时，实验组可见大量新生的编织骨组织形成，主要集中在材料外周孔隙；对照组仅在材料外周观察到少量新生骨组织。植入12周时，实验组外周编织骨转变为成熟的小梁骨，人工骨内部可见大量新生骨组织形成，外周区域部分支架材料吸收被新生骨组织取代；对照组植入区亦可见较多新生骨组织从材料周边区域向中心区域生长，支架材料吸收不明显；实验组不同时间点的新生骨面积均高于对照组(P 0.001)；免疫荧光染色：植入12周时，实验组新骨形成速率明显快于对照组(P 0.05)；结果表明：采用基因转染技术将骨形态发生蛋白2转染至骨髓间充质干细胞并与磷酸钙骨水泥材料复合，可显著提高组织工程化骨修复骨缺损的效果。关键词：生物材料；骨生物材料；骨形态发生蛋白；骨缺损；骨髓间充质干细胞；基因转染3 P.O.Box 1200,Shenyang 110004 Xiao Qi-ke, Master, Attending physician, Department of Orthopedic Surgery, Baoji Traditional Chinese Medical Hospital, BaoJi 721001, Shaanxi Province, ChinaCorresponding author: Bai Feng, Associate chief physician, Department of Orthopedic Surgery, the 451st Hospital of PLA, Xian 710000, Shaanxi Province, China主题词：骨形态发生蛋白质类；磷酸钙类；组织工程基金资助：国家十一五科技支撑计划(2006BAI16B02)缩略语：骨形态发生蛋白：bone morphogenetic protein，BMPConstruction of tissue-engineered bone by porous calcium phosphate cement with bone marrow mesenchymal stem cells transfected with bone morphogenetic protein 2 gene for repair of femoral condyle defectsXiao Qi-ke1, Wei Yu-shan2, Zhao Yi-nan3, Bai Feng4 (1Department of Orthopedic Surgery, Baoji Traditional Chinese Medical Hospital, Baoji 721001, Shaanxi Province, China; 2Baoji Senior Career Technical College, Baoji 721001, Shaanxi Province, China; 3Xijing Hospital, Fourth Military Medical University of PLA, Xian 710000, Shaanxi Province, China; 4Department of Orthopedic Surgery, the 451st Hospital of PLA, Xian 710000, Shaanxi Province, China)AbstractBACKGROUND: Bone morphogenetic protein (BMP) can improve the osteogenesis capacity of tissue-engineered bone. However, how to prolong BMP release is a key for constructing tissue-engineered bone.OBJECTIVE: To study the repair effect of porous calcium phosphate cement (CPC) with bone marrow mesenchymal stem cells transfected with BMP-2 gene on bone defects.METHODS: After modeling of bilateral femoral condyle bone defects, 12 model rabbits were given implantation of porous CPC with bone marrow mesenchymal stem cells transfected with BMP-2 on the left (experimental group) and given implantation of porous CPC with bone marrow mesenchymal stem cells on the right (control group). Bilateral femoral condyles were taken and analyzed histologically at 4 and 12 weeks after implantation.RESULTS AND CONCLUSION: Better osteogenesis including more newly formed bone tissues and faster scaffold absorption was observed in the experimental group compared with the control group at 4 and 12 weeks after implantation. The area of newly formed bone tissues at different time and rate of bone formation at 12 weeks were significantly higher in the experimental group than in the control group (P 0.001, P 0.05). These findings indicate that transfer of BMP-2 into bone marrow mesenchymal stem cells combined with porous CPC could increase repair of bone defects.Subject headings: Bone Morphogenetic Proteins; Calcium Phosphates; Tissue EngineeringFunding: the National Scientific Supporting Program during the Eleventh Five-Year Period, No. 2006BAI16B02Cite this article: Xiao QK, Wei YS, Zhao YN, Bai F. Construction of tissue-engineered bone by porous calcium phosphate cement with bone marrow mesenchymal stem cells transfected with bone morphogenetic protein 2 gene for repair of femoral condyle defects. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(43):6403-6408.6407ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH0 引言 Introduction植骨是治疗骨缺损和促进骨愈合的重要手段之一。以往临床上采取的骨缺损修复手段包括自体骨移植、异体骨移植及异种骨移植。虽然自体骨移植是骨缺损治疗的金标准，但其供给量有限，而且供区存在发生感染等并发症的风险。而同种异体骨和异种骨治疗有传播传染性疾病和排斥反应的潜在危险。近年来随着生物材料及组织工程技术的发展，组织工程化骨有可能成为骨缺损尤其是大段骨缺损较理想的修复方式。如何构建具有生命活力的组织工程化人工骨，使其快速同宿主骨结合并修复骨缺损正是骨组织工程所要解决的关键问题。组织工程化骨构建的3要素包括支架材料、种子细胞和细胞因子。其中支架材料是基础和关键。磷酸钙骨水泥因其与天然骨组织成分相同，具有优良的生物相容性、可降解、易成型的优点，已被作为骨移植替代材料和骨形态发生蛋白的载体材料应用于骨缺损修复。将磷酸钙骨水泥材料制备成多孔结构，不仅可改善其在体内的降解性能，而且有利于细胞、活性因子的复合，利于骨组织的长入。将成骨细胞和具有成骨潜能的干细胞与骨支架材料复合，是传统构建组织工程化骨的方法1-2，这种方式成骨效果有限，组织工程化骨仅仅起到骨传导作用，缺乏骨诱导活性，不能满足临床修复大段骨缺损的需要。而加入具有骨诱导活性的细胞因子如骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)，使组织工程化骨不仅具有骨传导性，同时兼具骨诱导活性，能够提高组织工程化骨的成骨能力。但是BMP与支架材料单纯的复合，移植入机体内将会很快释放，不能在成骨的整个过程中起到很好的骨诱导作用，因此如何控制BMP在机体局部持续缓慢释放，是构建具有骨诱导能力的组织工程化骨的关键问题。实验采用基因转染技术将促进骨形成的关键细胞因子BMP-2转染至兔骨髓间充质干细胞内并与多孔磷酸钙材料复合，构建组织工程化骨，植入兔股骨髁骨缺损处，观察构建的组织工程化骨的骨缺损修复能力。1 材料和方法 Materials and methods 1.1 设计 基因转染及动物实验，对比观察实验。1.2 时间及地点 实验于2015年5月在解放军第四军医大学第一附属医院全军骨科研究所完成。1.3 材料 多孔磷酸钙骨水泥材料，孔径300-600 m，孔隙率75%，由上海华东理工大学生物材料研究所提供。 实验动物：12只健康3月龄雄性新西兰兔，体质量2.5-3.0 kg；2周雄性幼兔，均由解放军第四军医大学动物实验中心提供，许可证号SCXK(湘)2015-00023。组织工程化骨修复兔股骨髁骨缺损实验的主要试剂：试剂来源DMEM-F12培养基、胰蛋白酶美国Sigma公司乙二胺四乙酸美国Gibco公司Percoll淋巴细胞分离液美国Pharmacia公司胎牛血清杭州四季青生物应用研究所脂质体转染剂DOTAPBoehringer Mannheim公司速眠新长春兽医药大学反转录聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒MBI公司pcDNA-hBMP-2质粒西京医院全军骨科研究所1.4 实验方法骨髓间充质干细胞的分离培养及扩增：无菌条件下抽取雄性幼兔骨髓，将抽取的骨髓加入无血清DMEM-F12培养基中，吹打制成单细胞悬液，按Pittenger密度梯度离心法3，注入5 mL Percoll分离液于离心管中，梯度离心，取有核细胞层，按照1105/cm2的密度接种于培养皿，加入含体积分数10%胎牛血清DMEM培养液，置于体积分数5%CO2、95%湿度、37 的培养箱中进行原代培养，3日后更换培养基并用倒置相差显微镜观测细胞生长过程。待80%-90%贴壁细胞继续培养后融合时，采用胰蛋白酶消化传代。通过细胞形态学观察及流式细胞仪对CD29、CD44两种表面抗原进行鉴定，证明培养的细胞为骨髓间充质干细胞。基因转染与检测：按文献所述方法构建真核表达载体质粒pIRES-BMP-24。采用脂质体转染法，细胞传代至50%-70%融合，分别取pIRES-BMP-2 1 g及DOTAP 6 L，用DMEM稀释至100 L后混匀放置30 min，加入骨髓间充质干细胞培养皿中，6 h后更换培养剂，24 h后根据GFP报告基因以流式细胞仪测定细胞转染率，分别收集转染后及对照细胞总RNA及蛋白，行RT-PCR和Western免疫印迹检测。 构建组织工程化骨：用3-5代状态良好的成功转染BMP-2基因的骨髓间充质干细胞，制成1108 L-1细胞浓度的悬液，滴至DMEM预湿的多孔磷酸钙骨水泥材料上，构建转染BMP-2的组织工程化骨，37 、体积分数5%CO2条件下培养2 d后，进行体内骨缺损的修复实验。同样方法构建含未转染BMP-2的组织工程化骨，作为对照。 动物模型制备与分组干预：取健康雄性新西兰兔12只，选择兔双侧股骨髁部缺损作为骨缺损修复模型。速眠新-肌肉注射麻醉后消毒，切开皮肤至皮下筋膜层，钝性分离股部外侧肌肉间隙，暴露股骨髁部，用外径 6 mm的环锯与股骨纵轴及矢状轴垂直方向在股骨髁最宽大处制一直径6 mm、深12 mm的圆柱腔隙性缺损，采用自体对照，左侧为实验侧，填充转染BMP-2的组织工程化骨；右侧为对照侧，填充未转染BMP-2的组织工程化骨。逐层缝合皮下筋膜和皮肤。正常喂养。术后肌注青霉素16104 U/d3 d。1.5 主要观察指标大体观察：观察实验动物的手术切口愈合情况及取材后标本的大体观察及其与周围组织的关系。组织学观察：植入后4，12周各处死兔6只，取标本，取材后用体积分数10%中性甲醛液固定7 d。梯度乙醇(体积分数70%、90%、100%)脱水，聚丙烯酸甲酯包埋，采用Lieca 1600硬组织切片机沿标本横轴方向连续切片，切片厚度150-200 m，然后研磨抛光至(5010) m， 作Van-Gieson染色后进行光学显微镜(Leica DMLA，德国)观察和图像分析新骨形成情况。荧光标记分析：采用四环素-钙黄绿素荧光双标记法分析计算植入后12周材料内新骨生成率。在取材时间点前的2周，以25 mg/kg的剂量向新西兰兔肌注四环素，连续注射2 d，随后在处死前3 d以15 mg/kg剂量肌注1次钙黄绿素。取材后，将标本固定于体积分数80%乙醇2 d，余处理方式同上。采用Leica DMLA电子荧光显微镜(Leica DMLA，德国)观察，两标记线间距离采用Image Pro Plus 6.0(UTHSCSA，USA)软件测量。组织形态计量学分析：以标本中心选取连续3张切片进行图像采集，采用Image pro plus专业图像分析软件进行新生骨组织面积百分比和骨形成速率的半定量分析，计算方法如下：新生骨组织面积百分比(%)=新生骨组织面积/感兴趣区视野总面积(包括新生组织面积和材料面积) 100%；骨形成速率(m/d)=两标记线距离(d)/两次注射间隔时间(t)。1.6 统计学分析 数据均采用s表示，用SPSS 18.0统计软件对数据进行方差分析，而两两之间的比较采用SNK-q检验，P 0.05为两组间比较差异有显著性意义。2 结果 Results 2.1 骨髓间充质干细胞的体外培养结果 原代培养骨髓间充质干细胞呈圆形，与周围的血细胞相混杂。一两天后，贴壁骨髓间充质干细胞的形态逐渐延伸成梭形，即成纤维样细胞。接种1周后，可见呈放射状扩展的骨髓间充质干细胞集落形成，并逐渐与邻近集落相融合。传代培养时，骨髓间充质干细胞呈均一长梭形，旋涡状紧密排列。2.2 基因转染与检测结果 脂质体DOTAP介导BMP-2基因转染骨髓间充质干细胞，行RT-PCR，可检测出目的基因表达，pIRES-BMP-2在阳离子脂质体的作用下，成功地进入骨髓间充质干细胞，转录出相应mRNA；而作为对照的未传染细胞未见BMP-2基因表达。流式细胞仪分析转染效率为21.43%。Western Blot转染细胞的蛋白表达检测显示，转染细胞有与目的基因分子量相符的BMP-2抗体结合蛋白印迹条带，而未转染细胞没有印迹着色。2.3 动物实验大体观察结果 1只兔术后出现感染致死，予以重新补充。其余实验兔术后植入区切口愈合良好，无渗出及感染。植入4周取材后发现，实验组兔股骨髁部缺损处有大量新生骨形成，材料与宿主骨初步融合。对照组兔股骨髁部缺损缺损边缘有少量骨形成，尚未完全修复。植入12周时，实验组骨缺损基本修复完全，新生骨与周围骨组织自然连续，植入材料部分吸收；对照组缺损区缩小，但缺损表层仍可见残留材料。 2.4 动物实验组织学观察结果 植入4周时，实验组材料可见大量红染新生的编织骨组织形成，主要集中在人工骨材料外周孔隙，中心部位孔隙内有少量新骨形成，见图1A；对照组仅在人工骨材料外周观察到少量新生骨组织，但材料中心区域无骨组织形成，见图1B。植入后12周，实验组外周编织骨转变为成熟的小梁骨，人工骨内部更多的孔隙内可见新生骨组织形成，外周区域部分支架材料吸收被新生骨组织取代，见图1C；对照组在植入区内亦可见较多新生骨组织从材料周边区域向中心区域生长，支架材料吸收不明显，见图1D。2.5 动物实验组织形态计量学分析结果 图2显示两种组织工程化骨在不同植入时间的新生骨面积百分比。总体上，新生骨面积随植入时间延长而增加。在所有时间点，实验组材料的新生骨面积百分比始终高于对照组(P 0.001)。植入4周时，实验组人工骨材料内新生骨面积占总缺损区的36.7%，对照组为18.9%。植入12周时，实验组材料内新生骨面积增加至70.1%，对照组仅为39.8%。2.6 动物实验荧光双标分析结果 植入12周时，实验组材料内的荧光条带较为清晰且较宽，见图3A；对照组材料内的荧光条带较窄，见图3B。此时，实验组组织工程化骨、对照组组织工程化骨的成骨速率分别为(5.67 1.72) m/d和(3.150.79) m/d，两者间比较差异与显著性意义(P 0.05)。3 讨论 Discussion提供具有生命活力的组织工程化人工骨并植入大段骨缺损部位，使其更快同宿主骨结合并修复骨缺损是骨组织工程所要解决的主要问题。组织工程骨的构建已不是简单地使用具有成骨潜能的干细胞或成骨细胞与材料复合，因为这种方法从形成新生骨组织的数量和质量上来讲已不能满足临床修复大段骨缺损的需要。骨形成的过程与多种细胞因子相关，其中BMP发挥着重要作用。BMP是惟一能够单独诱导骨组织形成的局部生长因子5。在BMP家族中，BMP-2 是目前研究中最为广泛、诱导成骨活性最强的BMPs5。BMP-2诱导成骨的机制是促进骨髓间充质干细胞分化为成骨样细胞，并促进成骨细胞增殖，从而诱导成骨。因此，在骨形成的过程中补充足量的BMP-2，在局部造成高浓度对骨形成是十分有利的。在骨缺损修复过程中，BMP-2可由成骨细胞分CBAD图1 实验组与对照组植入不同时间点材料内骨组织形成情况(50)Figure 1 Bone formation in the experimental and control groups at different time after implantation (50)图注：图中A、C为实验组植入4，12周，B、D为对照组植入4，12周。植入后12周，实验组外周编织骨转变为成熟的小梁骨，人工骨内部更多的孔隙内可见新生骨组织形成，外周区域部分支架材料吸收被新生骨组织取代；对照组在植入区内亦可见较多新生骨组织从材料周边区域向中心区域生长，支架材料吸收不明显。7550250实验组对照组新骨形成(%)4周 12周图3 实验组与对照组植入12周的四环素-钙黄绿素荧光标记(100)Figure 3 Tetracycline-calcein fluorescence labeling in the experimental and control groups at 12 weeks after implantation (100)图注：图中A为实验组，材料内的荧光条带较为清晰且较宽；B为对照组，材料内的荧光条带较窄。BA图2 实验组与对照组植入不同时间点的材料内新骨形成百分比Figure 2 Percentage of new bone formed in the experimental and control groups at different time after implantation图注：在所有时间点，实验组材料的新生骨面积百分比始终高于对照组(P 0.001)。泌，或由机体其他区域分泌到达创区，但量很少不能满足修复需要。因此将外源性BMP-2植入骨缺损区域是目前多采用的提高骨缺损的修复效果的手段6-10。但是由于BMP-2 半衰期短，单独在体内使用会很快扩散或被酶解吸收, 在骨形成的过程中难以充分发挥其骨诱导作用11 。因此，研究缓释系统是BMP-2应用的重要环节之一。尽管将BMP-2和骨支架材料复合使用能够保留支架材料原有的骨传导作用又增加了材料的骨诱导性12-13, 但是该构建方法存在BMP-2作用时间过短的缺点。也有部分学者将胶原、壳聚糖等作为BMP-2缓释载体14-15，利用壳聚糖及胶原的降解而缓慢释放BMP-2并诱导骨形成。此方法可以保证BMP-2在较长一段时间内对骨形成有促进作用，但BMP-2应加入的剂量及释放速度及很难控制，不能随骨形成需要多少而变化16-18。实验利用基因转染技术，将外源性BMP-2基因转染到兔骨髓间充质干细胞内，使BMP-2以旁分泌和自分泌的形式在局部形成高浓度，为新骨形成创造良好的微环境。此种方式可以达到在整个骨形成过程中均有BMP-2产生，以促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化增殖，并且该作用不会受支架材料降解及外界环境的影响而变化。组织工程化骨的构建另一重要因素是种子细胞地选择。骨髓间充质干细胞是构建组织工程化骨最常用的种子细胞。骨髓间充质干细胞取材方便，在局部一定条件的诱导下既可以分化为成骨细胞，转染效率较高，因此是携带BMP-2基因的良好载体。实验表明骨髓间充质干细胞转染率可达到21.43%，可稳定表达BMP-2。支架材料同样是体外构建组织工程化骨的关键和基础。磷酸钙骨水泥化学组成与天然骨磷灰石类似，因其良好的生物相容性，目前在临床上已被广泛投入使用。将磷酸钙骨水泥材料制备成与松质骨类似的多孔结构，也成为构建组织工程化骨的良好支架材料。课题成功将外源性BMP-2转染至骨髓间充质干细胞，在体外扩增后与多孔磷酸钙骨水泥材料复合，成功构建了具有骨诱导活性的组织工程化骨，并植入到兔股骨髁骨缺损模型，与未转染BMP-2的材料对比，分析两种人工骨的骨缺损的修复能力。结果发现，12周时，转染组BMP-2骨缺损基本修复，而对照组的骨缺损仅部分修复，实验组织工程化骨的骨缺损修复效果明显好于对照组。组织形态计量学分析显示，实验组新生骨组织面积百分比和骨形成速率明显高于对照组。这些与转染骨髓间充质干细胞分泌BMP-2，刺激新骨形成有关。实验初步证实了采用基因转染技术结合组织工程技术有助于提高骨缺损尤其是大段骨缺损的修复效果。致谢：感谢解放军第四军医大学第一附属医院全军骨科研究所给予的大力支持。作者贡献：肖琦科和白峰进行实验设计，实验实施为魏玉珊、赵轶男，实验评估为白峰，资料收集为肖琦科，肖琦可成文，白峰审校。利益冲突：所有作者共同认可文章无相关利益冲突。文章查重：文章出版前已经过CNKI反剽窃文献检测系统进行3次查重。文章外审：文章经国内小同行外审专家双盲外审，符合本刊发稿宗旨。作者声明：第一作者对研究和撰写的论文中出现的不端行为承担责任。论文中涉及的原始图片、数据(包括计算机数据库)记录及样本已按照有关规定保存、分享和销毁，可接受核查。文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。4 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