食品中常见病原微生物检验技术.ppt

第七章食品中常见病原微生物检验技术 我国卫生部颁布的食品微生物指标有菌落总数 大肠菌群和致病菌三项 致病菌 能够引起人类发病的细菌 对不同的食品和不同的场合 应该选择一定的参考菌群进行检验 一 生物学特性是一大群在血清学上相关的革兰氏阴性杆菌 无芽孢 无荚膜 周身鞭毛 能运动的需氧或兼性厌氧短杆菌 最适生长温度为35 37 最适pH为7 2 7 4 较抗寒 能耐受较高盐浓度 第一节沙门氏菌检验技术 不分解乳糖 亚利桑那菌除外 分解葡萄糖产酸产气 伤寒沙门菌产酸不产气 多数产生H2S 不产生靛基质 不液化明胶 不分解尿素 不产生乙酰甲基甲醇 多数能利用枸橼酸盐 能还原硝酸盐为亚硝酸盐 在氰化钾培养基上不生长 沙门菌生物学性状 目前至少有67种O抗原和2500个以上血清型 根据其对宿主的致病性 可分为三类 伤寒杆菌副伤寒杆菌 甲 乙 丙 人 肠热症 鼠伤寒杆菌肠炎杆菌猪霍乱杆菌 儿童伤寒 人 动物 急性胃肠炎 猪霍乱杆菌 丙型副伤寒杆菌鼠伤寒杆菌 肠炎杆菌 败血症 沙门氏菌属 Salmonella 二 检验所需器材 三 检验程序 沙门氏菌检验程序2010 SN方法 以无菌方式进行多点取样25g 225ml缓冲蛋白胨水 经37 水浴4h培养 进行非选择性增菌 确保濒于死亡的细菌进行复活 其后移取10ml转种于盛有100ml四硫磺酸盐煌绿增菌液 经42 1 培养20 2h 进行选择性的增菌 使目的菌优胜出来 将增菌液摇匀 以无菌操作 分别接种DHL和BS平板上于37 培养24 2h 进行分离培养 使目的菌分离出来 观察每个平板上的菌落 选取3 5个菌落接种于TSI或尿素酶琼脂上 于37 中培养24 2h 进行筛选试验 将符合沙门氏菌特征的TSI中的培养物 接种于营养琼脂平板上 37 中培养24 2h 进行纯化培养 选取单个菌落 接种于20E微量生化管中 进行API生化鉴定 同时取单个菌落 在洁净的玻板上 作血清学鉴定 四 操作方法 分五个步骤 1 前增菌2 选择性增菌3 选择性平板分离4 生化实验5 血清型分型鉴定 四 操作方法分五个步骤 1 前增菌 用无选择性的培养基使处于濒死状态的细菌恢复活力 BPW2 选择性增菌 使沙门氏菌优势繁殖 其它细菌受到抑制 SC TTBSC 亚硒酸盐胱氨酸增菌液 TTB 四硫磺酸钠煌绿增菌液 胱氨酸促生长四硫酸钠和煌绿抑菌氯化镁和孔雀绿抑菌适合伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌生长 37 适合其他沙门菌生长 42 18 24h 为防漏检宜SC TTB3 选择性平板分离培养 BS XLD HE 显色培基4 生化试验 1 初步生化实验 三糖铁实验 2 对疑似沙门氏菌继续作系统生化实验最低限度生化实验 靛基质 尿素 KCN 赖氨酸 鉴定分离出来的细菌是否符合沙门氏菌的生化谱 可采用API20E等成套生化试剂5 血清型分型鉴定A F多价O血清 把ABCDEF各群含有的共同O抗原的抗体混合起来作成混合血清 位相变异实验原理 在半固体培养基中加入已知相的血清 使解离出的已知相的菌体和血清发生反应 这样已知相的菌体就不能运动了 未知相的菌不能和血清发生反应 能够运动 并被解离出来 血清学鉴定 特异性诊断血清鉴定到种 一 增菌培养 前增菌称取25g mL 样品放入盛有225mLBPW的无菌均质杯中 以8000r min 10000r min均质1min 2min 或置于盛有225mLBPW的无菌均质袋中 用拍击式均质器拍打1min 2min 若样品为液态 不需要均质 振荡混匀 如需测定pH值 用1mol mL无菌NaOH或HCl调pH至6 8 0 2 无菌操作将样品转至500mL锥形瓶中 如使用均质袋 可直接进行培养 于36 1 培养8h 18h 如为冷冻产品 应在45 以下不超过15min 或2 5 不超过18h解冻 增菌 轻轻摇动培养过的样品混合物 移取1mL 转种于10mLTTB内 于42 1 培养18h 24h 同时 另取1mL 转种于10mLSC内 于36 1 培养18h 24h 分离 分别用接种环取增菌液1环 划线接种于一个BS琼脂平板和一个XLD琼脂平板 或HE琼脂平板或沙门氏菌属显色培养基平板 于36 1 分别培养18h 24h XLD琼脂平板 HE琼脂平板 沙门氏菌属显色培养基平板 或40h 48h BS琼脂平板 观察各个平板上生长的菌落 各个平板上的菌落特征见表1 检测沙门氏菌方法分5个步骤 1 前增菌 在含有营养的非选择性培养基中增菌 使受损伤的沙门氏菌细胞恢复到稳定的生理状态 沙门氏菌检测中前增菌的目的是使沙门氏菌恢复其活力 检测经过加工的食品中的沙门氏菌需要前增菌主要因为加工过程中沙门氏菌受到损伤而处于濒死状态 2 选择性增菌 在含选择性抑制剂的培养基中 样品进一步增菌 沙门沙门氏菌检测中增菌的目的是使沙门氏菌以外的细菌 主要是艾希氏菌属 受到抑制 而使沙门氏菌得到一定的增殖 提高沙门氏菌的检出率 3 选择性平板分离划线接种于 BS和XLD琼脂平板或HE琼脂平板各一个 于36 1 分别培养18 24小时 XLD HE 或40 48小时 BS 这一步采用固体选择性培养基 抑制非沙门氏菌的生长 提供肉眼可见的疑似沙门氏菌纯菌落的识别 亚硫酸铋琼脂 BS琼脂 上典型特征 木糖赖氨酸脱氧胆盐 XLD 琼脂上典型特征 HE琼脂上典型特征 三 生化试验 挑取选择性琼脂平板上的可疑菌落 接种于三糖铁琼脂培养基中 在三糖铁琼脂内 各菌属的主要反应结果如表5 3 表5 2说明在三糖铁琼脂内只有斜面产酸同时H2S阴性的菌株可排除 其他的反应结果均有沙门氏菌的可能 同时均有不是沙门氏菌的可能 都需要作进一步的生化试验 必要时作涂片染色镜检 沙门氏菌为革兰氏阴性短杆菌 4 生物化学试验筛选 挑取选择性琼脂平板上的可疑菌落 接种于三糖铁琼脂培养基中 排除大多数非沙门氏菌 也提供了沙门氏菌培养物菌属的初步鉴定 TSI 三糖铁 培养基大肠杆菌和沙门氏菌 肠杆菌科各属在三糖铁琼脂内的反应结果 沙门菌常用生化试验 尿素酶试验阴性 黄 阳性 红 靛基质 对照管阴性 阳性 三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内 沙门氏菌属的反应结果见表2 表2说明 在三糖铁琼脂内斜面产酸 底层产酸 同时赖氨酸脱羧酶试验阴性的菌株可以排除 其他的反应结果均有沙门氏菌属的可能 同时也均有不是沙门氏菌属的可能 2 接种蛋白胨水 供做靛基质试验 尿素琼脂 pH7 2 氰化钾 KCN 将已挑菌落的平板储存于2 5 或室温至少保留24h 以备必要时复查 P150 1 A1 典型反应判定为沙门氏菌属 如尿素 氰化钾和赖氨酸脱羧酶3项中有1项异常 按表可判定为沙门氏菌属 如有2项异常 为非沙门氏菌属 2 A2 补做甘露醇和山梨醇试验 沙门氏菌靛基质阳性变体两项实验结果均为阳性 但需要结合血清学鉴定结果进行判定 3 A3 补做ONPG ONPG阴性为沙门氏菌 同时赖氨酸脱羧酶阳性 甲型副伤寒沙门氏菌为赖氨酸脱羧酶阴性 4 必要时进行沙门氏菌生化群的鉴别 醇发酵试验 阳性 黄 阴性 邻硝基酚 半乳糖苷酶试验 ONPG试验 邻硝基酚 半乳糖苷酶试验 ONPG试验 1 原理 乳糖发酵过程中需要乳糖通透酶和 半乳糖苷酶才能快速分解 有些细菌只有半乳糖苷酶 因而只能迟缓发酵乳糖 所有乳糖快速发酵和迟缓发酵的细菌均可快速水解邻硝基酚 D 半乳糖苷 O nitrophenyl D galactopyranoside ONPG 而生成黄色的邻硝基酚 用于枸橼酸菌属 亚利桑那菌属与沙门菌属的鉴别 2 方法 将待试菌接种于ONPG肉汤中 35 水浴或孵箱孵育18 24h 观察结果 3 结果 呈现亮黄色为阳性 无色为阴性 4 应用 可用于迟缓发酵乳糖细菌的快速鉴定 本法对于迅速及迟缓分解乳糖的细菌均可短时间内呈现阳性 埃希菌属 枸橼酸杆菌属 克雷伯菌属 哈夫尼亚菌属 沙雷菌属和肠杆菌属等均为试验阳性 而沙门菌属 变形杆菌属和普罗威登斯菌属等为阴性 肠杆菌科各属生化反应初步鉴别表 接种三糖铁琼脂的同时 还要接种蛋白胨水 pH7 2尿素琼脂 KCN培养基和赖氨酸脱羧酶试验培养基及对照培养基各一管 于36 1 培养18 24小时 必要时可延长至48小时 按表5 3判定结果 沙门氏菌的结果应属于A1 A2和B1 其他五种反应结果均可以排除 反应序号A1 典型反应判定为沙门氏菌属 如果尿素 KCN和赖氨酸三项中有一项异常 按表5 4仍可判定为沙门氏菌 如有两项异常 则按A3判定为枸橼酸杆菌 5 血清学分型鉴定 提供培养物菌种的鉴定 用分离出的沙门氏菌与已知A F多价O血清及H因子进行玻片凝集试验 1 抗原的准备2 O抗原的鉴定用A F多价O血清做玻片凝集试验 以生理盐水做对照 3 H抗原的鉴定4 Vi抗原的鉴定 五 菌型的判定和结果报告 综合以上生化试验和血清学分型鉴定的结果 按照常见沙门氏菌抗原表及其补充表判定菌型 并报告结果 若结果为阴性 则报告为 未发现沙门氏菌 目前 对于沙门氏菌的检验技术已有很大进展 一些快速检验方法已有应用 如荧光抗体技术检验食品中沙门氏菌已在国际二得到公认 其些国家作为商品生产的荧光抗体试剂箱 即可应用于沙门氏菌的快速检验 我国在这方面也取得一定的进展 如固相载体吸附免疫技术 免疫染色法 酶联A蛋白染色等快速检验方法均具有快速 方便 经济和准确等特点 还有许多新方法 新技术仍处在实验和研究阶段 有待于我们去研究探讨 以便更好服务于实践 指示系统指示效果及可疑菌落特点BS葡萄 H2S黑色有金属光泽 棕褐或灰色 周围培基黑或棕色 或不产硫化氢而呈灰绿色DHL乳糖 H2S乳糖 粉红色 无色半透明无色半透明 产硫化氢者中心黑色SS乳糖 H2SHE乳糖 H2S乳糖 黄色 蓝色蓝绿色或蓝色 产硫化氢者中心黑色 沙门氏菌检测 概述 原理 沙门氏菌为革兰氏阴性短杆菌 无芽孢 一般无荚膜 周生鞭毛 鸡白痢和鸡伤寒沙门氏菌除外 兼性厌氧 最适生长温度37 在普通显微镜下和在普通培养基中不能与大肠杆菌进行区分 但沙门氏菌不发酵乳糖 在肠道菌鉴别培养基上形成无色透明菌落 而易与大肠杆菌区别 沙门氏菌有着复杂的抗原构造 一般分为菌体 O 抗原 鞭毛 H 抗原和毒力 Vi 抗原三种 沙门氏菌属包括2000个以上血清型 但多数国家从人体 动物和食品中经常分离到有40 50种血清型 致病性中毒现象 沙门氏菌检测 检测方法 GB前增菌 用无选择性的培养基使处以濒死状态的沙门氏菌恢复活力选择性增菌 使沙门氏菌得以繁殖 而大多数的其他细菌受到抑制选择性平板分离沙门氏菌生化试验 鉴定到属血清学分类型鉴定 沙门氏菌检测 注意事项 结果记录现象观察 菌落特征 革兰氏染色 BS琼脂 HE琼脂 SS琼脂 三糖铁琼脂常见问题 SC 亚硒酸盐胱氨酸增菌液 TTB 四硫磺酸钠煌绿增菌液 MM亚硒酸盐抑菌胱氨酸促生长四硫酸钠和煌绿抑菌氯化镁和孔雀绿抑菌适合伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌生长 37 适合其他沙门菌生长 42 18 24h为防漏检宜SC TTB MM 沙门氏菌属各群在各种选择性琼脂平板上的菌落特征 第二节金黄色葡萄球菌检验技术 金黄色葡萄球菌 近年来 美国疾病控制中心报告 由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位 仅次于大肠杆菌 金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性卫生问题 在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒占整个细菌性食物中毒的33 加拿大则更多 占45 我国每年发生的此类中毒事件也非常多 金黄色葡萄球菌的流行病学 金黄色葡萄球葡萄球菌表皮葡萄球菌属分类 腐生葡萄球菌 金黄色葡萄球菌食物中毒系毒素型食物中毒 是由于进食含有一种或多种含葡萄球菌肠毒素的食物所引起 常见的菌为金黄色葡萄球菌 致病性 葡萄球菌性食物中毒是葡萄球菌肠毒素所引起的疾病 可引发不同程度的急性胃肠炎症状 恶心 呕吐最为突出而且普遍 腹痛 腹泻次之 当金黄色葡萄球菌污染了含淀粉及水分较多的食品 如牛奶和奶制品 肉 蛋等 在温度条件适宜时 经8 10小时即可相当数量的肠毒素 雪印牛奶中毒事件 2000年6月29日起 日本雪印公司奶粉 低脂肪牛奶 酸奶等3种牛奶制品被查出金黄色葡萄球菌毒素 造成1 5万名消费者中毒原因是在北海道的奶粉生产工厂 该厂的产品都是先制成奶粉 再在各地工厂还原成牛奶 出现了停电 使生产线上的原料停留过久 所以出现了细菌超标 2001年以后 借助其他公司支援开始分割公司事业 2002年雪印食品被解散 一 生物学特性 革兰氏阳性需氧或兼性厌氧菌 为球菌 排列成葡萄状 无芽孢 鞭毛 不运动 大多数无荚膜 最适生长温度37 最适pH为7 4 对热抵抗力较强 80 30min才能被杀死 可在10 15 氯化钠和40 胆汁中生长 生物学特性 好氧生长的细胞产生接触酶 产生蛋白酶 脂肪酶 磷脂酶 脂酶和溶菌酶 大多数菌株可水解天然的动物蛋白 例如血红蛋白 纤维蛋白 卵白 酪朊和多肽类如明胶 水解脂类 吐温类和磷脂蛋白质 并释放脂肪酸 所有的毒株产生凝固酶 人和动物来源的菌株通常可凝固兔 人 马和猪的血浆 生物学特性 培养特征 大多数菌株产生类胡萝卜素 使细胞团呈现出深橙色到浅黄色 色素的产生取决于生长的条件 而且在单个菌株中可能也有变化可分解葡萄糖 麦芽糖 乳糖 蔗糖 产酸不产气 甲基红反应阳性 VP反应弱阳性 许多菌株可分解精氨酸 水解尿素 还原硝酸盐 液化明胶 具有较强的抵抗力 对磺胺类药物敏感性低 但对青霉素 红霉素等高度敏感 致病性 金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌 临床表现多种多样 可引起局部化脓感染 也可引起肺炎 胃肠炎 心包炎等 甚至败血症 脓毒症等全身感染 致病力强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶 a 溶血毒素 外毒素 分甲 乙 丙 丁 戊五种 能损伤血小板 破坏溶酶体 引起肌体局部缺血和坏死 b 杀白细胞素 可破坏人的白细胞和巨噬细胞 c 血浆凝固酶 侵入人体时 该酶使血液或血浆中的纤维蛋白沉积于菌体表面或凝固 阻碍吞噬细胞的吞噬作用 葡萄球菌形成的感染易局部化与此酶有关 d 脱氧核糖核酸酶 产生的脱氧核糖核酸酶能耐受高温 可用来作为依据鉴定金黄色葡萄球菌 e 肠毒素 产生数种引起急性胃肠炎的蛋白质性肠毒素 现已鉴定出葡萄球菌肠毒素有A B C1 C3 D E G H共9种 肠毒素A是最常见的 金黄色葡萄球菌的致病性 葡萄球菌皮肤感染 食物中毒症状及发生原因 症状 原因 二 检验所需培养基 10 氯化钠胰酪胨大豆肉汤7 5 氯化钠肉汤血琼脂平板Baird Parker琼脂平板脑心浸出液肉汤 BHI 兔血浆磷酸盐缓冲液营养琼脂小斜面革兰氏染色液无菌生理盐水 三 检验程序 GB4789 10 2010标准第一法适用于食品中金黄色葡萄球菌的定性检验 第二法适用于金黄色葡萄球菌含量较高的食品中金黄色葡萄球菌的计数 第三法适用于金黄色葡萄球菌含量较低而杂菌含量较高的食品中金黄色葡萄球菌的计数 第一法 检样 25g样品 225ml7 5 NaCl肉汤或10 氯化钠胰酪胨大豆肉汤 血平板 36 1 24hr 镜检营养肉汤 血浆凝固酶实验 报告结果 定性检测 36 1 24hr 36 1 24hr 36 1 6hr BP平板 第一法 第二法Baird Parker平板法检验程序 定量检测 平板法 适用于检测金黄色葡萄球菌数不小于10 g mL 的食品 25g样品 225ml生理盐水 选三个连续梯度 每个梯度分别取1mL接种之至表面干燥的BP平板 如0 4mL 0 3mL 0 3mL 平板计数 分别记录每种类型的菌落数 36 1 48hr 镜检营养肉汤 血浆凝固酶实验 报告结果金葡菌数 g mL 定量检测 平板法 每种类型至少选取一个菌落 36 1 24hr 36 1 6hr 适用于检测金黄色葡萄球菌数不小于10 g mL 的食品 梯度稀释 第三法金黄色葡萄球菌MPN检验程序 定量检测 MPN法 25g样品 225ml生理盐水 选三个连续梯度 每个梯度各取3mL加入3管胰酪胨大豆肉汤 36 1 45 48hr BP平板 血浆凝固酶实验 查MPN表 定量检测 MPN法 36 1 45 48h 报告结果 适用于检测可能含有少量金黄色葡萄球菌 却带有大量竞争菌的样品 梯度稀释 第三法金黄色葡萄球菌MPN检验程序 金黄色葡萄球菌的检测 测定方法 国标方法注意事项现象观察 染色镜检 形态 染色 表面光滑的菌落 菌落色素不稳定 但多数为金黄色 Baird Parker琼脂平板 BP平板 血平板 血浆凝固酶试验多数产肠毒素的菌株在血琼脂平板上能形成溶血圈 并能产生血浆凝固酶 这些是鉴定致病性金黄色葡萄球菌的重要指标 四 操作方法 1 增菌培养法 1 检样处理将25g mL 检样加于225mL灭菌生理盐水中的灭菌器内 制成1 10检样混悬液 2 增菌培养吸取液体检样5ml 接种于50mL7 5 氯化钠肉汤50ml进行增菌 3 分离培养将上述培养物 分别划线接种到Baird Parker平板和血平板 血平板36 1 培养18h 24h Baird Parker平板36 1 培养18h 24h或45h 48h 检测步骤 增菌 利用金黄色葡萄球菌耐盐的特性 可耐受15 的氯化钠 用含7 5 氯化钠肉汤或10 氯化钠胰酪胨大豆肉汤 4 观察菌落形态Baird Parker平板 血平板上挑取可疑菌落 金黄色葡萄球菌在Baird Parker平板上 菌落直径为2mm 3mm 颜色呈灰色到黑色 边缘为淡色 周围为一混浊带 在其外层有一透明圈 用接种针接触菌落有似奶油至树胶样的硬度 偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落 但无混浊带及透明圈 在血平板上 形成菌落较大 圆形 光滑凸起 湿润 金黄色 有时为白色 菌落周围可见完全透明溶血圈 检测步骤 分离 BP平板 胰蛋白胨 牛肉膏和酵母膏提供碳源 氮源 硫 维生素和痕量矿物元素丙酮酸钠是一种生长促进剂亚碲酸盐对除金黄色葡萄球外的其他能分解卵黄的菌株有毒性 并使菌落产生黑色卵黄提供营养和有利于观察卵磷脂环甘氨酸和氯化锂对金黄色葡萄球菌以外的其它菌株有抑制作用 Baird Parker氏培养基 成分胰蛋白胨10g牛肉膏5g酵母膏1g丙酮酸钠10g甘氨酸12g氯化锂 LiCl 6H2O 5g琼脂20g蒸馏水950mLPH7 5 Baird Parker氏培养基 增菌剂的配法30 卵黄盐水50mL与除菌过滤的1 亚蹄酸钾溶液10mL混合 保存于冰箱内 Baird Parker氏培养基 制法将各成分加到蒸馏水中 加热煮沸至完全溶解 冷至25 校正pH 分装每瓶95mL 121 高压灭菌15min 临用时加热溶化琼脂 冷至50 每95mL加入预热至50 的卵黄亚蹄酸钾增菌剂5mL 摇匀后倾注平板 培养基应是致密不透明的 使用前在冰箱储存不得超过48h 检测步骤 分离 在BP平板上其典型菌落为 圆形 光滑突起 湿润 直径2 3mm 颜色呈灰色到黑玉色 边缘常为淡色 米黄色或灰白色略带灰色或黄色的白色 周围为一混浊带 在其外缘常有一透明圈 用接种针接触菌落似有黄油树胶的粘稠感 偶然会遇到不分解脂肪菌株 除无混浊带及透明圈外 其他外观基本相同 B P平板 Baird Parker BP培养基 贝尔德帕克平板 用于凝固酶阳性葡萄球菌的分离和菌落计数用 7 90mm Baird Parker平板是一种选择性培养基 在含有氮源的基础上 补充了促进细菌生长的丙酮酸钠 又含有抑制剂 亚碲酸钾 故有较好的选择性 但对于金葡萄球菌没有抑制 其能将亚碲酸钾还原为碲在菌落中心呈黑色 易于观察 加入卵黄 由于卵磷酯酶阳性特征 其菌落周围可出现一明显的沉淀环 以资区别 根据菌落形态 作出相应的处理或报告 例如 金黄色葡萄球菌呈圆形 有光泽隆起 中部黑色 边缘灰色有微透明的浑浊带 革兰阳性杆菌呈棕黑色 无光泽有时在培养48h后也出现浑浊带 酵母菌为白色无透明环 血平板 金黄色葡萄球菌可以产生溶血素 因此在血平板上产生明显的溶血环 血平板上其典型菌落呈金黄色 有时也为白色 大而突起 圆形 不透明 表面光滑 有溶血圈 血平板 5 革兰氏染色镜检 6 血浆凝固酶试验挑取Baird Parker平板或血平板上可疑菌落1个或以上 分别接种到5mLBHI和营养琼脂斜面 36 1 培养18h 24h 取新鲜配置兔血浆0 5mL 放入小试管中 再加入BHI培养物0 2mL 0 3mL 振荡摇匀 置36 1 温箱或水浴箱内 每半小时观察一次 观察6h 如呈现凝固 即将试管倾斜或倒置时 呈现凝块 或凝固体积大于原体积的一半 被判定为阳性结果 同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为对照 也可用商品化的试剂 按说明书操作 进行血浆凝固酶试验 结果如可疑 挑取营养琼脂小斜面的菌落到5mLBHI 36 1 培养18h 48h 重复试验 检测步骤 鉴定 金黄色葡萄球菌可以产生凝固酶 因此对其鉴别的主要实验是测定其凝固酶 对于凝固不完全的菌株 可以通过一些其他实验来进一步确认 例如 厌氧葡萄糖发酵 溶葡萄球菌酶敏感性实验 耐热核酸酶实验等 所有这些实验不能作为鉴别其产毒与否的依据 血浆凝固酶试验 吸取1 4新鲜兔血浆0 5mL 放入小试管中 再加入培养24h的金黄色葡萄球菌肉浸液肉汤培养物0 5mL 振荡摇匀 置36 1 温箱或水浴内 每半小时观察一次 观察6h 如呈现凝块 即将试管倒置或倾斜时 呈现凝块者 被认为阳性结果 同时以已知阳性和阴性葡萄球菌株及肉汤作为对照 血浆凝固酶试验血浆凝固试验也可采用玻片法 把兔血浆滴加于载玻片的一端 然后用白金耳挑取菌落与血浆充分混匀 在载玻片另一端以生理盐水代替血浆做阴性对照 混合后立即观察 若出现凝块即为阳性 病原性葡萄球菌多数产生血浆凝固酶 非病原性的一般不产生 因此 该法是判定葡萄球菌有无致病性的重要指标 血浆凝固酶试验的原理 病原性葡萄球菌能产生血浆凝固酶 使血浆中纤维蛋白原变为不溶性纤维蛋白 附于细菌表面 生成凝块 因而具有抗吞噬的作用 凝固酶试验对于判定该菌株是否具有致病力 很有帮助 葡萄球菌凝固酶试验被广泛地用于常规鉴定金黄色葡萄球菌与其他葡萄球菌 葡萄球菌所产生的凝固酶有两种 结合凝固酶和游离凝固酶 结合凝固酶 即凝聚因子 是一种结合于菌体细胞壁的酶 它直接作用于血浆中纤维蛋白原 使之变成纤维蛋白 而使葡萄球菌凝集成块 玻片法阳性结果是由此酶 凝聚因子 所致 游离凝固酶 是凝血酶原样物质 不直接作用于血浆纤维蛋白原上 而被血浆中的致活剂 即凝固酶致活因子 激活后 变成耐热的凝血酶样物质 此物质可使血浆中的液态纤维蛋白原变为固态纤维蛋白 从而使血浆凝固 试管法的阳性结果为此酶所致 方法 1 玻片法 2 试管法 结果判断 1 玻片法 5 10s内出现凝集者为阳性 2 试管法 如有凝块或整管凝集出现为阳性 4h后无上述现象出现 则放置过夜后再观察 应用 本试验仅用于致病性葡萄球菌的鉴定 方法 1 玻片法 在1张洁净玻片中央加1滴9g L氯化钠 生理盐水 溶液 用接种环取待检培养物与其混合 设阳性和阴性对照 制成菌悬液 若经10 20s内无自凝现象发生 则加入兔新鲜血浆1环 与菌悬液混合 观察结果 2 试管法 用生理盐水将新鲜兔血浆4倍稀释 取0 5ml于试管再加0 5ml待测菌浓菌悬液 需做阳性对照及阴性对照 混匀后置37 水浴中 每30min观察1次结果 若3小时内试验管和阳性对照管出现凝固 阴性对照管 即浓菌液管 不凝固 为阳性 若阴性 继续观察到24小时 不凝固者为阴性 结果判断 1 玻片法 5 10s内出现凝集者为阳性 2 试管法 如有凝块或整管凝集出现为阳性 4h后无上述现象出现 则放置过夜后再观察 应用 本试验仅用于致病性葡萄球菌的鉴定 注意事项 1 玻片法 10秒内观察结果 如超过10秒可出现假阳性 因此必须用试管法验证凝聚因子试验 2 可选择的玻片凝集试验法还包括检测凝集因子和蛋白A的胶乳凝集试验 但胶乳凝集试验和玻片凝固酶试验的结果并不完全一致 鉴定金黄色葡萄球菌的特异性和灵敏性均高于传统的玻片凝固酶试验 3 试管法 须制备浓厚的均匀菌悬液 以便观察结果 a 试管法葡萄球菌凝固酶试验阳性者 应见到明显的纤维蛋白凝胶块 出现羊毛状或纤维状沉淀物并非真正凝固 应判为阴性 b 如果培养时间超过4H 应考虑以下几点 延长培养时间后 有些菌株产生的葡萄球菌激酶 溶纤维蛋白酶 可以裂解凝块 产生假阴性结果 如果使用的血浆不是无菌的 或部分不是无菌的 假阳性和假阴性结果均有可能发生 所用待测菌不纯 延长培养时间后 污染菌可能导致假阳性结果 所用血浆缺乏纤维蛋白原 脱纤维血浆 4 最好用EDTA抗凝的兔血浆 不主张用人的抗凝血 兔血浆凝块结实 凝固速度快 优于人血浆 5 试验不可在高盐培养基上的取菌落 因为可能出现自凝或假阳性 6 若被检菌为陈旧的肉汤培养物 超过18 24H 或生长不良 凝固酶活性低的菌株可能检测不出来 7 当怀疑待测菌是金黄色葡萄球菌时 对玻片凝固酶阴性的结果应做试管法凝固酶试验确证 玻片法和试管法凝固酶试验的血浆标准是 必须含有足够浓度的凝固酶反应因子和纤维蛋白原 必须无溶纤维蛋白活性和无抑制剂 一 动物学试验主要用幼猫和猴 二 血清学试验肠毒素作为抗原 可以和特异性抗体发生结合性反应 产生可见沉淀用血清学反应检验金黄色葡萄球菌肠毒素方法主要有 免疫琼脂扩散法反向间接血凝试验免疫荧光法酶联免疫吸附法 金黄色葡萄球菌肠毒素的检测 对分型进行简单的了解 血清学分型 金黄色葡萄球菌水解 获得两种抗原成分 蛋白抗原和多糖抗原 蛋白抗原主要为葡萄球菌A蛋白 SPA 是一种表面抗原 90 以上金黄色葡萄球菌有此抗原 无特异性 多糖抗原为半抗原 有型特异性 噬菌体分型 根据肠毒素分型 根据血浆凝固酶分型 金黄色葡萄球菌的抗原构造和分型 血清学反应可用于检测食物 培养物或滤液等标本中的细菌或肠毒素 血清学反应不仅简便快捷 而且能对毒素做出最后定型 菌体荧光抗体染色法涂片 食品样品接种于葡萄糖肉汤培养基 37 培养24 48小时 用接种环取上述增菌液 涂布于载玻片上 干燥 每一个培养物涂布3 4个点 37度培养箱内干燥 固定 将干燥好的玻片放在克氏固定液中固定3 5分钟 再将固定的玻片标本放入95 酒精中浸泡1分钟 加抗血清 然后充分干燥 用接种环取1环荧光抗血清轻轻加于菌膜上 反应 然后37度培养箱内作用30分钟 冲洗浸泡 取出作好的玻片用0 01mol LPH7 4PBS液冲洗玻片上荧光血清 最后将标本放于95 酒精液中浸泡1分钟左右取出 用荧光显微镜镜检 有特异性明亮荧光的为阳性或者菌量在一个视野中有数个或十几个细菌以上者为阳性 毒素的检出金黄色葡萄球菌毒素的检出有免疫琼脂扩散法 反向间接血凝法 放射免疫测定法 免疫荧光法 酶联免疫吸附测定法 A蛋白血凝试验 核酸探针检测 乳胶凝集试验等 3 肠毒素的测定动物试验可用检样稀释液直接作动物试验或按以下方法将分离菌株培养制备肠毒素 肠毒素的制备 肠毒素的制备有固体培养法和液体培养法 肠毒素测定 注射前应先喂给幼猫少量的食物 以便观察反应 取上清液按幼猫体重每100g1mL的剂量腹腔注射或加大2 3倍量口服 然后仔细观察 一般攻毒后0 5 2小时内幼猫发生呕吐 腹泻 体温上升 畏寒等症状 经4 5小时后逐渐恢复 同时实验时用未接种菌的培养基做同样处理的阴性对照 第三节志贺氏菌检验技术 志贺氏菌属 shigella 是人类细菌性痢疾最为常见的病原菌 通称痢疾杆菌 通常志贺氏杆菌 Bacillus shigae 仅指I型痢疾志贺氏菌 志贺氏杆菌是日本志贺诘在1898年首次分离得到的 因此而得名 本属细菌对理化因素的抵抗力较其他肠道杆菌为弱 对酸敏感 在外界环境中的抵抗力能以宋内氏菌最强 福氏菌次之 志贺氏菌最弱 一般56 60 经10分钟即被杀死 在37 水中存活20天 在冰块中存活96天 蝇肠内可存活9 10天 对化学消毒剂敏感 1 石碳酸15 30分钟死亡 志贺氏菌属有四个血清组 即A B C D 1 A群 又称痢疾志贺氏菌 不发酵甘露醇 有12个血清型 其中8型又分为三个亚型 2 B群 又称福氏志贺氏菌 发酵甘露醇 有15个血清型 含亚型及变种 抗原构造复杂 有群抗原和型抗原 根据型抗原的不同 分为6型 3 C群 又称鲍氏志贺氏菌 发酵甘露醇 有18个血清型 各型间无叉反应 4 D群 又称宋内氏志贺氏菌 发酵甘露醇 并迟缓发酵乳糖 一般需要3 4天 只有一个血清型 引起食物中毒的主要是福氏志贺氏菌和宋内氏志贺菌 一 生物学特性 1 形态特性本属细菌为两侧平行 末端钝圆的革兰氏阴性杆菌短杆菌 无芽胞 无荚膜 无鞭毛 多数有菌毛 与肠杆菌科各属细菌的主要区别为不运动 分解葡萄糖 产酸不产气 大多数不发酵乳糖 vp试验阴性 不分解尿素 不形成硫化氢 不能利用枸橼酸盐作为碳源 2 培养特性 1 需氧或兼性厌氧 但厌氧时生长不很旺盛 2 对营养要求不高 在普通琼脂培养基上易于生长 3 在10 40 范围内可生长 最适温度为37 左右 最适pH值为7 2 4 在固体培养基上 培养18 24小时后 形成圆形 隆起 透明 直径2 3mm 表面光滑 湿润 边缘整齐的菌落 3 生化特性 注 阳性 阴性 多数阴性 少数阳性 迟缓阳性 d有不同生化型 福氏志贺氏6型生化特性与A群和C群相似 4 血清学特性 利用O抗原的复杂性可将志贺氏菌分成A B C D四群 每一群又可利用O抗原进行分型 志贺氏菌四个亚群各具有不同的抗原构造 都是由菌体抗原 O 及表面抗原 K 所组成 二 检验所需器材 检样25g 或25mL 样品 志贺氏菌增菌肉汤225mL41 5 16h 20h厌氧培养XLDMAC或志贺氏菌显色培养基36 20h 48h挑取可疑菌落TSI 半固体 营养琼脂斜面血清学分型生化鉴定志贺氏菌属分群及分型结果报告 三 检验程序 GB4789 5 2012 志贺氏菌检验程序 四 操作方法 1 增菌2 分离3 初步生化试验4 生化试验及附加生化试验5 血清学鉴定 1 增菌 以无菌操作取检样25g mL 加入装有灭菌225mL志贺氏菌增菌肉汤的均质杯 用旋转刀片式均质器以8000r min 10000r min均质 均质袋用拍击式均质器连续均质1min 2min 液体样品振荡混匀即可 于41 5 厌氧培养16h 20h 2 分离 取增菌后的志贺氏增菌液分别划线接种于XLD琼脂平板和MAC琼脂平板或志贺氏菌显色培养基平板上 于36 1 培养20h 24h 观察各个平板上生长的菌落形态 宋内氏志贺氏菌的单个菌落直径大于其他志贺氏菌 若出现的菌落不典型或菌落较小不易观察 则继续培养至48h再进行观察 志贺氏菌在不同选择性琼脂平板上的菌落特征 选择性琼脂平板志贺氏菌的菌落特征MAC琼脂无色至浅粉红色 半透明 光滑 湿润 圆形 边缘整齐或不齐XLD琼脂粉红色至无色 半透明 光滑 湿润 圆形 边缘整齐或不齐 3 初步生化试验 挑取平板上的可疑菌落 接种三糖铁和营养琼脂斜面和半固体培养基各1管 志贺氏菌在三糖铁培养基中表现为底层产酸 不产气 斜面产碱 不产H2S 无动力 固体管内沿穿刺线生长 4 生化试验 半乳糖苷酶 尿素 赖氨酸脱羧酶 鸟氨酸脱羧酶以及水杨苷和七叶苷的分解试验 必要时还需加做靛基质 甘露醇 棉子糖 甘油试验 也可做革兰氏染色检查和氧化酶试验 生化反应不符合的菌株 即使能与某种志贺氏菌分型血清发生凝集 仍不得判定为志贺氏菌属 表2志贺氏菌属四个群 4 生化试验 半乳糖苷酶 尿素 赖氨酸脱羧酶 鸟氨酸脱羧酶以及水杨苷和七叶苷的分解试验 除宋内氏志贺氏菌 鲍氏志贺氏菌13型的鸟氨酸阳性 宋内氏菌和痢疾志贺氏菌1型 鲍氏志贺氏菌13型的 半乳糖苷酶为阳性以外 其余生化试验志贺氏菌属的培养物均为阴性结果 另外由于福氏志贺氏菌6型的生化特性和痢疾志贺氏菌或鲍氏志贺氏菌相似 必要时还需加做靛基质 甘露醇 棉子糖 甘油试验 也可做革兰氏染色检查和氧化酶试验 应为氧化酶阴性的革兰氏阴性杆菌 生化反应不符合的菌株 即使能与某种志贺氏菌分型血清发生凝集 仍不得判定为志贺氏菌属 表2志贺氏菌属四个群 5 血清学试验 挑取三糖铁琼脂上的培养物 做玻片凝集试验 先用四种志贺氏菌多价血清检查 P166表6 8福氏志贺氏菌各型和亚型抗原和群抗原表6 9志贺氏菌属四个群的生化特征 5 快速诊断法1 荧光菌球法 适于检查急性菌痢的粪便标本 将标本接种于含有荧光素标记的志贺氏菌免疫血清液体培养基中 37 培养4 8小时 如标本中有相应型别的痢疾杆菌 繁殖后与荧光素抗体凝集成小菌球 在低倍或高倍荧光显微镜下易于检出 方法简便 快速 有一定的特异性 2 协同凝集试验 用志贺氏菌的lgG抗体与富含A蛋白的葡萄球菌结合 以此为试剂 测定患者粪便滤液中志贺氏菌的可溶性抗原 第四节肉毒梭状芽孢杆菌检验技术 一 生物学特性 1 肉毒梭菌肉毒梭菌属于厌氧性梭状芽孢杆菌 形成芽孢 比菌体宽 呈梭状 为革兰氏阳性粗大杆菌 两端钝圆 无荚膜 周身有4 8根鞭毛 能运动 28 37 生长良好 最适pH6 8 当pH值低于4 5或大于9 0时 或当环境温度低于15 或高于55 时 肉毒梭菌芽孢不能繁殖 也不产生毒素 肉毒梭菌加热80 30min或100 10min即可杀死 但其芽孢抵抗力强 煮沸后要6h 105 2h 110 36min 120 4 5min才能将其杀死 肉毒梭菌生命力很强 并广泛存在于自然界 特别是土壤中 易污染食品 于适宜条件下可在食品中产生剧烈的肉神经毒素 又称肉毒毒素 能引起以神经麻痹为主要症状且死亡率极高的食物中毒 肉毒素是目前所知的最强烈的细菌外毒素 故肉毒梭菌的检验目标主要是其毒素 均以毒素的检测及定型试验为判定的主要依据 引起中毒的食品有腊肠 火腿 鱼及鱼制品和罐头食品等 在美国以罐头发生中毒较多 日本以鱼制品较多 中国主要以发酵食品最多 如臭豆腐 豆瓣酱 面酱等 中毒时症状及来源 症状 最初为头晕 无力 随即出现眼肌痉挛 继之张口 伸舌困难 最后出