荧 光 蛋 白 (赵宝晶).docx

绿色荧光蛋白在生物技术中的应用 赵宝晶2011201154摘 要：2008年10月8日，诺贝尔化学奖揭晓。日本科学家下村修、美国科学家马丁沙尔菲及美籍华人钱永健，三人因发现和改造绿色荧光蛋白而获奖也是因诺贝尔奖和钱永健，荧光蛋白再次成为我们关注的热点。本文简要地概述了绿色荧光蛋白的发展历史、应用特点及其在生物技术中的应用，比如分子标记、细胞筛选、融合抗体基因表达检测、活细胞体内的光学感受器等。关键词：绿色荧光蛋白、生物技术中的应用Abstrac: October 8, 2008, the Nobel Prize in Chemistry announced. Japanese scientists Shimomura, American scientists Martin Shaer Fei and Chinese-American Tsien, for the discovery and transformation of three green fluorescent protein and also because of the Nobel Prize winners and Tsien, fluorescent protein once again become the focus of attention. This paper briefly outlines the history of the development of green fluorescent protein, characteristics and applications in biotechnology applications, such as molecular markers, cell-based screening, antibody fusion gene expression, the bodys living cells such as optical receptors. Keywords: green fluorescent protein, the application of biotechnology 1绿色荧光蛋白(Green fluorescent Protein，GFP)1.1 GFP的发展历史上世纪60年代，日本科学家下村修从美国西岸打捞了大量发光水母并带回实验室。他发现这些水母在受到外界的惊扰时会发出绿色的荧光。此后，他进行了大量的实验，终于搞清楚了这种水母的特殊发光原理。原来，在这种水母的体内有一种叫水母素的物质，在与钙离子结合时会发出蓝光，而这道蓝光未经人所见就已被一种蛋白质吸收，改发绿色的荧光。这种捕获蓝光并发出绿光的蛋白质，就是绿色荧光蛋白。然而，研究者们并没有意识到GFP的应用前景，慢慢就将其遗忘了。直到1992年，普瑞舍克隆并测序了野生型的GFP。但具有讽刺意味的是，基金评审委员会认为普瑞舍的工作没有意义，不愿提供经费。普瑞舍一气之下离开了科学界，将GFP的cDNA送给了几个实验室。后来很多人尝试用该cDNA来表达蛋白，但都失败了。马丁查尔非就考虑只用它的编码区域来表达达载体中，紫外光或者或蓝光激发，大肠杆菌和线虫细胞内均产生了很美妙的绿色荧光。1994年他在美国科学杂志上发表作为基因标识的绿色荧光蛋白一文，尽管正文只有一页，却标志绿色荧光蛋白投入实验室应用。野生型GFP虽然能发出很绚丽的荧光，其也存在一些缺点，比如：它有两个激发峰，因此光稳定性不好；此外，在37摄氏度不能正确折叠也是个很大的问题。为此，研究人员花费了大量实验对其晶体结构进行了探索，以便更好地了解发光基团的组成以及与周围残基的相互作用，对其进行改造。最值得赞叹的就是钱永健在1995年完成的Thr取代第65位的Ser的单点突变，使GFP的激发峰单一化，从而显著提高了GFP的荧光强度和光稳定性。此外，他完成的Leu取代第64位的Phe的单点突变则改善了GFP在37摄氏度的折叠能力。综上就产生了我们常见的增强型GFP,其荧光强度为野生型GFP的35倍。2007年莫斯科的研究人员Chudakov培育出一种深红色的荧光蛋白质，这种蛋白质发出的光穿透性极强，即使蛋白质位于小动物体内深处，其发出的光也可以穿透生物体被外界看到，这使生物学家能够更方便地监视活生物体的发病和康复过程，而不用侵入式地进行研究。斯坦福大学分子影象中心的科学家Zhen Cheng对这项发现评价道：“红色光对生物体组织的穿透性远胜于其他颜色，正因为此，目前有很多科研人员都在努力培育具有高稳定性的红色荧光蛋白质，但截至目前尚没有哪一个比Chudakov培育出的荧光蛋白质更稳定、更明亮，Chudakov培育出的这种深红色荧光蛋白质将大大提高生物体活体成像的质量，并在实时追踪活生物体内深层组织的分子活动上得到广泛的应用”。 Cheng还预测道，深红色荧光蛋白质可能最终会用于临床治疗。尽管深红色荧光蛋白质的光不足以对整个人体进行成像，但可能应用于对人体皮下相对浅层肿瘤的成像，如黑色素瘤和乳腺癌。1.2 GFP的结构GFP编码238个氨基酸的多肽单体，只有完整的GFP分子才会产生生物荧光，被切断的GFP即使是C、N末端的少数几个氨基酸亦能导致GFP失去发光能力。GFP的分子量为26.9 kDa。来源于水母的野生型GFP在395 nm和475 nm分别有主要和次要的激发峰，它的发射峰在509 nm，处于可见光谱的绿色区域。GFP是典型的桶形结构，包含折叠和螺旋，将荧光基团包含在其中。严密的桶形结构保护着荧光基团，防止它被周围环境淬灭，内部面向桶形的侧链诱导Ser65Tyr66Gly67三肽环化，导致荧光基团形成。与荧光的产生直接有关的是GFP分子中一小段被称为荧光生色团在GFP的初级氨基酸序列上，第6567个氨基酸形成环状三肽，以共价形式与GFP蛋白肽键骨架相连。生色团的形成不受种属的限制，其通过细胞内广泛存在的成分的作用或通过自催化作用都能产生。荧光生色团非常稳定，不易变性，用酸、碱处理或者加入盐酸胍都不会使它失去荧光。但是当pH值恢复到中性或者移去变性物时。它的荧光又会恢复到变性前的水平。GFP的生色团之间是通过共价键结合。1.3 GFP的发光原理GFP荧光的产生主要是在氧气存在下，分子内第67位的甘氨酸的酰胺对第65位丝氨酸的羧基的亲核攻击形成第5位碳原子咪唑基，第66位酪氨酸的-2键脱氢反应之后，导致芳香团与咪唑基结合，这样GFP分子中就形成对羧基苯甲酸唑环酮生色团发出荧光。2 GFP的应用特点2.1易于检测GFP不需外加任何反应底物和辅助因子。只需紫外光或蓝光激发，即可发出绿色荧光，用荧光显微镜或肉眼就可以观察到，且灵敏度高，对于单细胞水平的表达也可识别，同时还可利用其进行定量检测。由于GFP对生活细胞基本无毒害，因此无须特殊处理就可以很方便地进行活体观察。2.2 荧光稳定GFP无光漂白现象， 在很大的pH 范围内（pH712)都可以正常发出荧光，受温度的影响也很小。只有在超过65时才会变性，荧光消失。对于长时间光照，GFP也有很好的耐受性，根据Sheen等的研究。GFP在受体内表达时可以持续得到不低于10分钟的荧光。2.3 广谱性首先表现在它的表达几乎不受种属范围的限制，在微生物、植物、动物中都获得了成功的表达；其次就是没有细胞种类和位置的限制，在各个部位都可以表达，发出荧光。2.4 易于载体构建由于GFP较小，只含有238个氨基酸。编码GFP的基因序列也较短，约26kb，所以它可以很方便地同其它序列一起构建多种质粒，而不至于使质粒过大影响转化频率。尽管野生型的GFP在某些植物和动物中表达很弱，但可通过更换GFP生色团氨基酸、改变碱基组分、除去内含子、更换强启动子等方法加强表达。Connack等筛选出了三种含Ser65突变的突变体，在大肠杆菌中表达时，荧光强度比野生型高约100倍。3 GFP在生物技术中的应用3.1 分子标记GFP的分子量很小。而且其发色基因性质稳定，在与其他蛋白质连接后仍能发射荧光，同时不影响它所连接的蛋白质的结构和功能。利用这一性质我们可以将GFP与细胞中某些特定的蛋白质结合，然后激发这些GFP，通过检测GFP的荧光来测定这些蛋白质的位置。利用这一技术，可以测定某些细胞的分布和生长状况，尤其是一些透明的动物和植物组织内特定细胞、化合物的生长、分布情况。也有人用此项技术进行病毒在植物体内的生长、扩散情况的研究，取得了不错的效果。如果我们有一系列具有不同吸收光谱和发射光谱的荧光蛋白，那么多种不同细胞和分子间的距离、相互作用情况将会形象生动地展现在我们面前。在活的哺乳动物和被感染的组织中，可以观测到细菌产生的GFP，它的荧光可以利用流式细胞术来检测。这样就可以衡量哺乳动物细胞被细菌侵染的程度。有助于了解宿主一病原体相互作用的机理，从而达到消灭病原体的作用，有研究发现，用gfp基因编码绿色荧光蛋白GFP，可以监测基因表达和在活细胞里定位蛋白质，实现在消化道内实时监测GFP菌株的代谢情况。利用GFP研究了鼠伤寒沙门氏菌，结果证明，GFP的表达并不影响该菌侵入宿主的过程或在宿主中的繁殖。3.2 细胞筛选基于GFP能够吸收/发射光。并且荧光稳定以及检测方法快速、方便的特性，GFP在细胞筛选上应用广泛。比如应用流式细胞计数仪来筛选蛋白产量增强的细胞。Yuk等使用GFP作为标记能快速筛选出在生长抑制环境下，仍能保持重组蛋白大量表达的CHO细胞。另外。研究发现通过GFP荧光的减少，可以测量出鼠和人细胞的凋亡。利用GFP融合蛋白作为细胞表面活体荧光标记。通过筛选已经获得GFP表达的Ecoli、人体肾细胞和猿猴COS-1细胞等特殊类型。Sheen J等在GFP转染玉米原生质体中出现两类细胞丛，第一类与对照相似，呈现红色荧光，约占细胞总数663；第二类细胞丛呈现绿色荧光，荧光强度是对照的74倍。因此，用流式细胞计数仪或荧光活化细胞计数仪(FACS)很容易将两类细胞分离开来。3.3 基因表达调控Clontech公司构建了一种叫启动子报告载体(Promoter reporter vector)即是一个没有启动子的GFP质粒，专门用来测试各种启动子对GFP表达的效率，以及某些增强子对GFP表达的调控效果。发现用玉米C4PPDK基因5端的非翻译片段(5VTR)与花椰菜花叶病毒的35S启动子连接，GFP在玉米原生质体中的表达效率比对照质粒(只有35S启动子)提高近15倍，因为5VTR片段中含转录增强子。用拟南芥菜热休克(Heatshock1基因启动子构建GFP表达载体，用以转化玉米原生质体。发现42热激处理中50原生质体表达GFP荧光37处理的荧光较弱，而常温下培养，则完全观察不到原生质体中的GFP荧光。在高等植物遗传转化的基因表达调控研究中。已有很多报告蛋白被应用，包括LacZ（半乳糖苷酶)，CATChloramphenicol acethytransferase3,Luc(荧光虫Luciferase)和Gus(-glucuronidase)等。但这些报告蛋白都是酶。其表达产物的检测都需要进行细胞固定、组织切片或蛋白提取等破坏性处理。很难用于活体观察和检测。GFP作为一种活体报告蛋白，用于研究基因表达的调控。明显具有其它报告蛋白不可替代的优点。3.4 信号转导新近研究发现 ，可以通过调节某些 突变GFP 来改变 FRET 。把一个释放蓝色荧光的 GFP 融合到一个绿色荧光 GFP 突变体上 , 并在它们之间介入一个蛋白酶敏感的间隔子 , 这两个 GFP 恰好可以发生 FRET , 当加入蛋白酶时 , 间隔子被切除 , 两个 GFP 之间的距离发生弥散性改变 , FRET 被完全阻断 。该实验提示我们 , 可以通过偶联 GFP 到适当的转录因子、跨膜受体、细胞间信号转导指示分子 , 来动态观测活细胞的生理功能。最近 , 有学者用 GFP 依赖的生物传感器测量活细胞内生化动力学 , 通过利用带有 GFP 标记的蛋白激酶 A 转染细胞 , 观测有关 cAMP 的动态荧光变化 。通过融合蓝色荧光 GFP 到调节亚单位或融合绿色荧光 GFP 到 PKA 的催化亚单位 , 设计出了 cAMP 传感器。当 cAMP 浓度很低时 , 两个荧光分子距离很近 , 并出现 FRET , 如果增加 cAMP 浓度 , 发生 FRET 的可能性急剧下降。利用该方法 , 可以检测出 cAMP 的动态变化 , 并开创了在整体条件下 , 研究 cAMP 调节信号转导途径的新方法。3.5 光伏发电瑞典研究人员不再盯着植物作为样板，转而将目光投向拥有高超光伏转化能力的水母，开发出提升收获太阳能的技术。利用水母身上提取的GFP，该小组制作的装置可用这些“黏黏绿”将紫外光转化为自由电子。该小组制造的电池由在二氧化硅基底上被一个小缝隔开的两个简单的铝电极组成，GFP置于两电极中间并起连接作用。当把紫外光放进来的时候，GFP不断将光子抓走，并产生电子进入电路产生电流。同时，GFP非常廉价，不需要昂贵的添加剂或昂贵的加工，此外，它还能被封装成独立的不需要外光源的燃料电池。科学家相信，此能源装置缩小后可用来驱动微小的纳米设备。4 GFP存在的问题及前景展望虽然GFP在分子生物学的众多研究领域有着广泛的应用，但目前看来仍有其不足。(1)检测灵敏度还有待提高，而且其荧光信号强度方面的非线性性质使得定量非常困难。(2)新生GFP折叠和加工成为具有荧光活性形式的过程十分缓慢，使得某些快速过程如转录的激活过程还难以用该方法进行研究。(3)紫外激发对某些GFP有光漂白和光破坏作用，导致荧光信号快速丧失。(4)多数生物具有微弱的自发荧光现象，并有着类似的激发和发射波长，这些荧光背景会影响某些GFP的检测。（5）实验中发现很难建成 GFP 稳定细胞株, 可能与 GFP 参与细胞凋亡过程有关。考虑到目前现状和所存在的问题，预期今后将研究发现更多的突变改进型GFP，它们或具有更高的荧光活性，或者分别具有不同的吸收或发射光谱特性。另外，寻找具有较快折叠和成熟速度的突变GFP并保持其优良的荧光特性，也是今后的重要目标。最后,结合非破坏性的三维图像重建技术无疑可提供有关细胞和有机体正常生命活动的更为真实和生动的图景。现代成像系统的完善为荧光标记研究提供有力工具，不同的光敏感相机和滤片理想地适配各种颜色蛋白，图像分析软件也在不断开发。绿色荧光蛋白作为报告基因将在研究蛋白相互作用、分子动力学模型等方面表现出巨大优势，并将被应用于更多的动物医学研究领域中。总之,GFP已成为对活体细胞进行分子生物学研究的有力工具。随着此领域研究的不断深入，活细胞分子生物学的研究必将大放异彩。参考文献：1Shimomura O，Hohason F H，Saiga YExtraction，purification and properties of aequorin，a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan，AequoreaJJ Cell Comp Physiol，1962(59)：2232392Li X，Zhang G，Ngo N，et a1Deletions of the Aequorea victoria green fluorescent protein de