3 人类X染色质(巴氏小体)的制备与观察.doc

人类X染色质（巴氏小体）的制备与观察摘要巴氏小体是由雌性哺乳动物体细胞中失活的X染色体在间期细胞核中形成的呈异固缩状态，贴近于核膜边缘的染色小体，在遗传学、细胞观察方面有重要意义。实验中作者取人口腔颊部上皮细胞与发根毛囊细胞进行硫瑾染色操作，通过显微观察对巴氏小体进行识别与计数，描述巴氏小体的形态，并统计其在不同性别人体细胞中的出现率。引言在哺乳动物体细胞间期细胞核中，除一条X染色体外，其余的X染色体失活并呈异固缩状态，此即为巴氏小体。又称X小体、性染色质，直径约1m，通常位于间期核膜边缘。1949年，加拿大学者Barr在雌性猫的神经元细胞核中发现一种染色很深的小体，而在雄性猫中则极少出现1。通常人类男性细胞核中很少或没有巴氏小体，而女性有1个，性染色体异常的患者如XXY、 XXYY、XXX、XXXY等，巴氏小体的数量X染色体数量1。综合巴氏小体与哺乳动物性染色体的剂量补偿效应，Lyon MF 于1961年提出Lyon假说，主要内容有：(1) 正常的雌性哺乳动物两条X染色体只有一条在遗传上有活性，另外一条失活；(2) X染色体失活是随机的。因此表达是随机的，结果在杂合子中会出现嵌合现象（mosaic）。例外：有袋类失活的X染色体全部是父方的。(3) 失活发生在胚胎发育的早期，如人在受精后的16天（5000-6000个细胞时）。一个细胞的一条染色体一旦失活，这个细胞的后代细胞中该染色体均失活。Lyon假说虽然可以解释一些问题但不是全部，如人类中的44AXO型个体表现为Turner综合症、44AXXY表现为Klinefelter综合症。随着生物学和医学的发展人们已经认识到单条X染色体失活现象是普遍存在的，但失活的染色体上存在失活区和非失活的。如人类中位于X染色体上的基因，G6PD（葡萄糖-6磷酸脱氢酶）、AHF（抗溶血第因子）等是非失活的，而Xg血型基因是失活的。巴氏小体的生物学观察，对于优生学中鉴别性别和预防性连锁疾病的发生，以及作为癌细胞核异常主要形态学特征之一鉴定癌细胞，有重要价值1。本次实验将通过实验掌握鉴定人类X染色质的方法，在显微镜下正确识别巴氏小体的形态特征及所在部位，并了解巴氏小体失活的有关假说以及为失活X染色体上的基因所控制的遗传性状地特点。1. 实验材料1.1. 生物材料：人体口腔颊部上皮细胞，人体发根毛囊细胞。1.2. 器材：显微镜，解剖针，牙签，眼科镊，载玻片，盖玻片，滤纸条。1.3. 试剂：硫瑾，1mol/L HCl，蒸馏水，45%醋酸。2. 实验步骤2.1. 观察人口腔颊部上皮细胞巴氏小体2.1.1. 取材用灭菌的牙签轻刮口腔颊部上皮，涂片，晾干。2.1.2. 加1mol/L 的盐酸水解10-15分钟。轻轻水洗，晾干。2.1.3. 硫瑾染色10-20分钟，洗净，晾干。2.1.4. 显微镜观察。巴氏小体应靠近核膜边缘，染色较深。2.2. 观察发根毛囊细胞巴氏小体2.2.1. 拔取带毛囊头发一段，45%冰醋酸解离5分钟。2.2.2. 剥取毛囊，硫瑾染色10分钟，洗净。2.2.3. 压片（压片前可先用解剖针敲片，使细胞分散），镜检。毛囊细胞密度比口腔上皮细胞标本较低，但较为集中。3. 实验结果3.1. 结果图示图1 人口腔上皮颊部上皮细胞（男性标本，未显示巴氏小体，1010）图2 人体人口腔上皮颊部上皮细胞（女性细胞，圆圈中示巴氏小体，1040）3.2. 结果分析巴氏小体为女性细胞中所特有的染色体结构，是l条X染色体呈异固缩状态所形成。其直径为lm左右，其形状有微凸形、三角形、卵形、短棒形和双球形等。巴氏小体一般位于核膜附近，颜色比周围的核物质深。一般正常女性口腔粘膜细胞中，X染色质约15%左右，平均16.4%，不超过3035%，仅含1个X染色质。男性的细胞中发现X小体有小于2%的出现率，但小体结构不规范、典型。本次试验中对男性口腔颊部上皮细胞标本与女性口腔上皮标本都进行了硫瑾染色法观察，其操作过程引入杂质较多，导致显微镜视野中不够整洁。男性口腔颊部上皮细胞标本中出现大量深染色的颗粒状结构（如图1），对X染色质的观察与判断造成一定影响。经过仔细辨别，没有在标本中发现X染色质，男性X染色质检出率为0。女性口腔颊部上皮细胞标本共发现含X染色质细胞核5个，细胞核计数结果4550个，X染色质出现频率为10%11%，较标准数值偏低。可能原因：挑取标本过程有一块口腔上皮完整剥下，造成后来制片时出现大量细胞粘连在一起，对辨认X染色质、计数及显微观察都造成一定影响。4. 注意事项本次实验的难点在于标本杂质的控制，视野中细胞清晰，杂质少的装片标本视为质量较好。1. 载玻片要非常干净，洗净酒精浸泡后晾干或烤干，以免制片后杂质过多。2. 实验前先用水将口漱净，第一遍刮取的样本弃去，尽可能除去口中杂物。注意不要刮破上皮，涂片后要等材料晾干后在染色或解离，否则丢失材料。3. 使样品中混入其