农田生态环境中典型抗生素的测定方法与归宿.docx

农田生态环境中典型抗生素的测定方法与归宿申请人：周楠 环境科学 07级 073500摘要抗生素被广泛应用于人类和畜禽疾病的治疗和预防，由于监管不当和盲目使用，药物以原形或降解产物形势进入农业环境，增强了生物耐药性。抗生素进入环境有两个重要途径，其一，含有抗生素的畜牧粪便粪作为有机肥施入农田，污染土壤、地表作物和地下水；其二，含有抗生素的废水进入污水处理厂，经处理后未完全消除而进入环境中。目前有关环境中抗生素的研究已经成为国内外研究的热点之一，但存在分析方法不成熟，系统环境样本分析不够的问题。本课题以上海奉贤农乡代表性畜牧场、无公害蔬菜基地和乡镇污水处理厂为研究对象，希求建立快速准确的测定方法，系统地揭示典型药物在以上环境介质中的污染现状和环境行为，为土壤抗生素污染防治和修复提供依据。 关键词： 抗生素 粪便 农田土壤 地下水研究意义近年来，抗生素用量呈现逐年递增趋势，在美国作为促生长作用的抗生素的使用量在近40年内增加80倍，同样在其他国家促生长用抗生素用量也在增加【1】。全球抗生素年均使用总量约为100 000 t200 000 t【2】。土壤是抗生素重要的归属场所。抗生素及其代谢产物在土壤环境中能维持很长时间的活性，对土壤中的微生物、植物、动物均产生不同程度的影响。抗生素大量存在于在畜禽粪便和施用粪肥的土壤中。王冉等【3】的研究结果表明，肉鸡经饲料服用金霉素后有较高比例金霉素以原形形式随排泄物排出，且不易被降解，排泄物中高含量金霉素残留存在着较大的环境风险。有研究在德国西北部液体粪肥施用后的沙壤中发现了四环素和磺胺甲嘧啶残留，在030 cm的土层中土霉素、四环素、氯四环素、磺胺甲嘧啶的含量分别达27、443、93、4.5 gkg-1。Martinez-Carballo E等【4】测定了猪粪、鸡粪以及施有粪肥的土壤样品中磺胺类药物、甲氧苄氨嘧啶、四环素、氟喹诺酮类药物等的浓度情况，检测到猪粪中金霉素浓度46 mgkg-1、土霉素29 mgkg-1、四环素23 mgkg-1；在鸡粪中检测到大量磺胺嘧啶；在土壤样品中也检测到金霉素、环丙沙星等抗生素的存在。在土壤中越来越多的检测到抗生素的存在。Campagnolo等【5】检测到土壤中抗生素类兽药浓度为10 gkg-1；在德国土壤中检测到四环素类抗生素的含量为450900 gkg-1【6】。在我国，检测到土壤中含有土霉素可高达200mgkg-1。有关菜地土壤的抗生素污染问题应引起关注。李彦文等【6】分析了广州、深圳等地菜地土壤中3 种四环素类和6 种磺胺类抗生素的污染特征。结果表明，四环素类单个化合物检出率为19.35%96.77%，平均含量为9.644.1 gkg-1，以四环素为主；磺胺类单个化合物检出率为25.81%93.50%，平均含量为4.951.4 gkg-1，以磺胺甲唑、磺胺-5-甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶为主。测定农业环境中的抗生素需要针对不同复杂的水体(如废水)和固体基质(如污泥、沉积物、土壤和生物体)进行识别并量化到超痕量水平。由于抗生素种类众多，其物化性质、生物活性等性质各不相同，在环境中的浓度低。因此，所采用的检测方法必须能够屏蔽其它大量杂质的干扰，且对低浓度要有足够的灵敏度。由于大多数药物是极性且分子量较低，这使得药物检测变得相当困难。迄今为止，对于环境中PPCPs的分析没有普遍采用的方法【7】，如只希望将分析物检测到u gL-mgL级，可用气相色谱后接氢火焰离子检测器或电子捕获检测器，或高压液相色谱后接紫外可见光检测器或荧光检测器，但如果希望得到ngL级甚至更低的检测限，就必须对样品进行高倍数的富集(10010 000倍)以及采用高度灵敏的检测方法n引【8】。 抗生素在环境中为痕量存在，在水体中通常为几十ngL【9,10,11】，土壤或底泥中含量受空间分布影响较大，在养殖场附近底泥中含量可达数百u gkg【12】，而在其它土壤中的含量可能较低。因此，抗生素的检测方法成为相关研究的制约因素。最早抗生素的检测采用的是生物学方法，该方法耗时长，灵敏度低，后来逐渐为高效液相色谱法所取代，成为抗生素类药物检测的标准方法。液相色谱一紫外联用(LCUV)和液相色谱一荧光联用(LCFD)等曾被广泛应用于生物样品中抗生素的检测【13,14,15】；而随着技术的发展，液相色谱一质谱联用(LCMS)由于其高灵敏度和定性能力，近年来在研究领域广泛应用于抗生素的分析【16,17】。而文献中报导的LC-MS测四环素类药物的方法中质谱包括使用粒子流(particlebeam，PB),快速原子轰击(fast atom bombardment，FAB)，高温喷雾(thermospray,TSP)，常压化学离子化(atrnospheric pressure chemical ionization，APCI)，电子喷雾离子化(electrospray ionization，ESI)等。APCI和ESI离子化与二级质谱结合的方法灵敏度高，重复性好，常作为首选【18,19】。毛细管电泳也用于分析牛奶、血清和尿样中的四环素残留，目前已有研究者将其应用于环境样品的检测；放射性免疫测定也有报导用于抗生素的扫描【20】，该方法是半定量方法，还需要采用LC-MS做进一步确证。抗生素的滥用所造成的环境问题，在欧美一些国家引起了更多的关注和科研的投入。近年来由于抗生素在养殖业和畜牧业中以及医疗卫生上的大量使用，导致其对环境污染的问题日趋严重，已成为当前国际上的研究热点之一。我国是个农业化大国，兽用抗生素的消耗量可能比世界其它更为严重，抗生素在畜牧业中滥用的情况十分严重，医疗卫生抗生素使用缺少监管，且抗生素废水处理工艺不尽人意，直接后果即导致环境中抗生素环境暴露问题突出，并极有可能增强其抗性基因，并在环境中进行传播和扩散，对人体健康构成潜在威胁。上海近几年经济发展迅速，畜牧水产发达，医院药厂猛增，污水处理设备设施发展较快，随之产生的抗生素增多，抗生素产身的环境污染问题逐渐暴露出来，迫切需要对上海市典型抗生素污染源特征及其环境行为进行研究，为抗生素的治理技术和监管政策提供科学依据。抗生素研究没有像其优先污染物那样被广泛研究，更不用说系统研究。该课题通过调查抗生素污染源并结合实际环境监测确定环境中典型抗生素种类，通过系统研究全面评价抗生素在环境中的暴露，进一步分析抗生素在环境中的迁移转化行为。可见该研究有一定的理论和现实意义。研究内容：1、 调查上海奉贤农乡主要抗生素污染源及其种类，并结合参考文献确定需要检测的抗生素种类，追踪抗生素的传播途径。2、建立环境介质中抗生素的测定方法(优化提取条件，优化仪器参数)。包括粪便、土壤、蔬菜、污水、地下水中的抗生素分析方法3、测定环境介质中抗生素。测定上海奉贤农乡代表畜牧厂粪便中抗生素分布特征，初步分析奉贤农乡代表性污水处理厂各个工艺阶段抗生素残留。 创新点：l，在选择畜牧粪便中典型抗生素种类时，首先了解畜牧养殖厂抗生素使用量和种类，掌握第一手资料，并跟踪调查抗生素的进入环境中的途径。2，建立畜牧粪便中抗生素含量迅速准确的测定方法。当前文献中有关测定条件的优化，忽略了过滤膜的优化，以及不同浓缩方法的定量比较，试验过程将对样品的过滤和浓缩方法进行了讨论。3，分析上海奉贤农乡不同污水处理厂工艺阶段抗生素的污染水平与归宿。研究方案一、 高效液相色谱法（HPLC）测定畜牧粪便中抗生素残留主要仪器：高效液相色谱仪紫外检测器；固相萃取装置等。主要试剂：磺胺二甲嘧啶(SDM)，磺胺二甲氧嘧啶(SDO)，霉素(OTC)，四环素(TC)，金霉素(CTC)，强力霉素(DOXY)等。 测定步骤：采集奉贤地区4个养殖场的粪便搅拌均匀，经烘焙等预处理后，运用高效液相色谱法测定典型抗生素的含量。改变以下测定条件，对比测定数据，寻求最合理的测定条件。(1) 改变固相萃取小柱种类、流速和脱洗体积。就不同小柱对各种典型抗生素的提取效率进行比较。利用不同1，3，6mlmin流速优化，选择回收率较高的流速。（2）选用不同的色谱条件，根据抗生素类型选择合适的色谱条件。（3）选用不同的微孔滤膜，选用常用的醋酸纤维微孔膜、聚四氟乙烯膜、尼龙膜和玻璃纤维膜，根据实际效果，针对不同类型抗生素选择合适滤膜（4）选用不同的提取液总类、pH，超声时间及提取次数二、 液相色谱串联质谱法法(LCMSMS)测定畜牧粪便中抗生素主要仪器：A1liance 2695 HPLC和Micromass QuattroMicroTM串联电喷雾检测器(ESI)等。主要试剂：磺胺嘧啶，磺胺二甲氧嘧啶，金霉素、氧氟沙星，环丙沙星，甲醇(色谱级)等。测定步骤：(CTC)，强力霉素(DOXY)等。测定步骤：采集奉贤地区4个养殖场的粪便搅拌均匀，经漩涡混匀、离心等预处理后，运用液相色谱串联质谱法法测定典型抗生素的含量。利用MasslynxTM NT软件进行数据采集和控制。改变以下测定条件，对比测定数据，寻求最合理的测定条件：（1）改变高效液相色谱串联质谱条件，避免液相色谱峰出现拖尾现象，形成峰性良好的色谱。（2）分别使用固相萃取(SPE)和微波辅助萃取(MAE)技术。降低基质的干扰，增加提取效率。三、 奉贤地区典型污水处理厂污水中抗生素污染水平与归趋分别选择奉贤地区东、西两个污水处理厂作为研究对象。对每个采样点采集水面以下lm处水样。每个水样采集1L，迅速冷藏运回实验室马上分析。在污水厂各个阶段连续采集(9：00-19：00)，每隔2h采集一个样品，以观察进水随时间的变化情况，然后确定最佳采样时间，最后按照确定的最佳采样时间采集每个点的样品。样品经过离心等预处理后运用HPLC法测量其典型抗生素含量。结合相关标准对污水厂的抗生素污染处理水平进行评估。要解决的问题：牲畜粪便、污水中的抗生素种类较多，不同的抗生素的理化性质又很大的差异，测量时的处理方法不尽相同。实验需要根据不同抗生素的性质和特征，选择恰当的测量条件和方法。年度计划：内容第一年度第二年度1季度2季度3季度4季度1季度2季度3季度4季度文献整理材料准备实验研究结果分析参考文献【1】 Ajit K S, Michael T Meyer, Alistair B A Boxall. 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