水果抗氧化性.doc

罗丹明B-Mn2+-H2O2体系同步荧光分光光度法测定水果的抗氧化活性1 前 言羟自由基(OH)是活性氧中对生物体毒性最强、危害最大的一种自由基。它可以通过电子转移、加成以及脱氢等方式与生物体内的多种分子作用，造成糖类、氨基酸、蛋白质、核酸和脂类等物质的氧化性损伤，使细胞坏死或突变。羟自由基还与衰老、肿瘤、辐射损伤和细胞吞噬有关。对机体适当补充外源性抗氧化剂或给予能促使机体内源性物质恢复到一定水平的药物，可改善这些状况。由于长期使用化学合成的抗氧化剂对入体有一定的副作用，所以，寻找天然、安全、无毒的抗氧化剂就越来越受到入们的重视。对羟自由基的研究有许多，例如：荧光法研究高粱红色素清除羟自由基活性，为高粱红色素的合理开发和利用提供了一定的参考依据；罗丹明6G-Co2+-H2O2体系荧光法测定常见蔬菜的抗氧化活性，测定了14种常见的蔬菜的抗氧化活性，其中菠菜、油菜、韭菜、香菜、雪里蕻5种绿叶蔬菜的抗氧化活性较强；丁基罗丹明B-Fe2+-H2O2体系荧光法测定茶叶的抗氧化活性，对多种茶叶及枸杞的清除羟自由基作用进行了研究，充分利用了丰富的茶叶资源提高入体抗氧化性能。目前，离体检测羟自由基的方法主要有电子自旋共振（ESR）法、化学发光法、光度法及荧光法，这些方法多是用传统的Fe2+-H2O2体系产生羟自由基，或Cu+、Co2+、代替Fe2+使灵敏度提高，对水果抗氧化活性的研究已有报道。本文采用同步荧光法和普通荧光法绘制荧光谱图，进行谱图比较，根据前入做过的试验预测采用同步荧光法比普通荧光法的灵敏度高，有效减少光谱干扰，用罗丹明B作指示剂，在Mn2+-H2O2体系产生羟自由基(OH)，测定水果的抗氧化活性。从常见水果中寻找抗氧化剂，充分利用丰富的水果资源，具有实际意义。2 测定原理 传统的Fenton反应是用Fe2+-H2O2体系产生羟自由基。本文研究发现，Mn2+亦可与H2O2作用，类似Fenton反应产生羟自由基，产率比FeSO4还要高，其反应原理可类推如下:Mn2+H 2O2Mn()+OH+ OH-Mn()十H2O2Mn(IV)+OH + OH-然后，利用羟自由基迅速氧化罗丹明B，使罗丹明B的荧光强度显著降低，降低程度随羟自由基的增加而加大，从而间接测定羟自由基的产生量。而水果提取物可以部分清除溶液中的羟自由基，从而使其荧光碎灭程度减弱，据此可以测定水果抗氧化性。3 实验部分3.1 主要仪器与试剂3.1.1 主要仪器WGY-10型分子荧光分光光度计 天津港东科技发展有限公司SQ2119多功能食品加工机 上海帅佳电子科技有限公司TD4台式离心机 湖南仪器表总厂离心机长电子分析天平 梅特勒-托利多仪器上海有限公司PHSJ-3F实验室pH计 上海精密科学仪器有限公司3.1.2 主要试剂MnSO4H2O（含量不少于99%） 天津市北方天医化学试剂厂抗坏血酸（含量不少于99.7%） 天津市福晨化学试剂厂H2O2（含量不少于30%） 天津市凯通化学试剂有限公司罗丹明B 天津市津科精细化工研究所氯化铵（含量不少于99.5%） 天津市津东天正精细化学试剂厂氨水(含量不少于25%-28%) 天津市赢达希贵化学试剂厂所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水。3.2 储备液的配制干燥的小烧杯若干，1L容量瓶1只100 mL容量瓶3只，1000 mL的容量瓶，塑料瓶，500mL容量瓶两只，50mL容量瓶5只，10mL容量瓶20只。2mL移液管4只，贴上标签(罗丹明B，Mn2，H2O2，buffer。)，100ml量桶（H2O2），10mL移液管3只（缓冲）3.2.1 硫酸锰储备液的配制准确称取MnSO4H2O0.3397g，在小烧杯中用少量水溶解转移100 mL容量瓶中定容，配制成20 mmol/L溶液作为储备液。实验所用的浓度是2 mmol/L，移取10mL20 mmol/L储备液于100 mL的容量瓶中定容至刻度。3.2.2 罗丹明B储备液的配制准确称取罗丹明B 0.01 g，在小烧杯中溶解，转移定容在1000 mL的容量瓶中，配成110-2 g/L的储备液。3.2.3 1%双氧水储备液的配制准确移取30% H2O23 mL于聚乙烯的塑料瓶中，再加87 mL的蒸馏水。3.2.4 氨水储备液的配制准确移取3.33 mL浓氨水，稀释至500 mL的容量瓶中，定容至刻度，配制成0.1 mol/LNH3H2O的储备液。3.2.5 氯化铵储备液的配制准确称取2.6855 g氯化铵，在小烧杯中用少量水溶解，转移定容在500 mL的容量瓶中，配制成0.1004 mol/LNH4Cl的储备液。3.2.6 根据化学手册配制成不同pH值0.1mol/LNH3H2O-0.1004mol/LNH4Cl的缓冲溶液：NH4Cl V/mL3232302515NH3H2O V/mL14152530pH8.08.589.19.59.810mL移液管，配于50mL容量瓶中，注意不要定容！3.2.7 抗坏血酸储备液的配制准确称取抗坏血酸0.3523 g，在小烧杯中用少量水溶解，转移定容在100 mL的容量瓶中，得到20 mmol/L的储备液。实验时，移取2.5 mL20 mmol/L的抗坏血酸，转移定容在100 mL的容量瓶中得到0.5 mmol/L的抗坏血酸。3.3 实验方法3.3.1 羟自由基的测定在10 mL容量瓶中，pH=9.5的缓冲溶液1.0 mL，加入110-2 g/L的罗丹明B1.6mL， 2.0 mmol/L的Mn2+ 溶液1.6mL，1%的H202溶液1.4mL，加蒸馏水至刻度，混匀。测定582nm波长处的荧光强度F，计算其与空白参比(罗丹明B与缓冲液)荧光强度F0之差F，通过测定OH形成前后罗丹明B的荧光强度变化，来反映OH的产生量。3.3.2 羟自由基清除率的测定在上述体系中加入一定量的羟自由基清除剂，同样操作侧定荧光强度Fs；罗丹明B和缓冲溶液作为空白体系，其荧光强度为F0，未加清除剂的体系，其荧光强度为F，则清除率=(Fs-F)/(F0-F)100% 4 结果与讨论4.1.荧光光谱罗丹明B本身能产生特征荧光，其激发波长和发射波长分别为560nm和582nm， 图1荧光分光光度法测得的荧光光谱1、罗丹明B +缓冲溶液2、罗丹明B +缓冲溶液+Mn2+H2O2+水果提取物3、罗丹明B +缓冲溶液+Mn2+H2O24.2 实验参数工作模式：发射扫描 扫描间隔：2 nm 激发狭缝: 6 nm 发射狭缝：6nm 负高压：130 V 扫描设置：500-660nm4.3 实验条件实验条件对羟自由基的产生有影响，也对抗氧化剂对羟自由基的清除率有影响，应综合考虑这两方面的因素，选择适宜的测定条件。4.3.1 酸度的影响探索pH值最佳条件的实验条件及结果如下表（注意溶液加入顺序）缓冲各1mL(pH=)8.08.589.19.59.8罗丹明B(110-2 g/L) /mL1.61.61.61.61.6Mn2+(2.0 mmol/L )/mL22222H2O2(1%)/mL0.80.80.80.80.812345缓冲各1mL(pH=)8.08.589.19.59.8罗丹明B(110-2 g/L) /mL1.61.61.61.61.6F16.245.352.765.866.3图2空白和羟自由基体系的F受pH值的影响如图2所示。可以看出，在pH=8.5-9.8范围内，F有较大值，可以看出。在pH=9.8时，F有最大值，但是各组均有沉淀且pH=9.8的沉淀相对较多，故选pH=9.5的弱碱性介质缓冲溶液。4.3.2 罗丹明B的用量加入不同体积110-2 g/L罗丹明B溶液，按试验方法测定空白体系和OH体系的F，测试结果如下表所示。缓冲 (pH=9.5 )/mL11111罗丹明B(110-2 g/L) /mL11.21.41.61.8Mn2+(2.0 mmol/L )/mL22222H2O2(1%)/mL0.80.80.80.80.812345缓冲 (pH= 9.5 )/mL11111罗丹明B(110-2 g/L)/mL11.21.41.61.8F42.149.152.456.557.0图3如图3所示，结果表明罗丹明B用量为1.8mL时荧光强度差值最大，但是罗丹明B用量为1.6mL时的荧光强度差值和它大小差不多，而且罗丹明B用量为1.8mL时溶液中沉淀较多，故选用罗丹明B最佳用量用量为1.6mL。4.3.3 硫酸锰的用量按实验方法加入不同体积2 mmol/L的MnSO4溶液，测定荧光强度，选出最佳用量的MnSO4溶液。（“”表示没有加入这种试剂）1缓冲 (pH=9.5 )/mL111111罗丹明B(110-2 g/L) /mL1.61.61.61.61.61.6Mn2+(2.0 mmol/L )/mL0.81.01.21.62.0H2O2(1%)/mL0.80.80.80.80.8F4545.846.548.749.165.8图4如图4所示，结果表明罗丹明B用量为2.0mL时荧光强度差值最大，但是罗丹明B用量为1.6mL时的荧光强度差值和它大小差不多，而且罗丹明B用量为2.0mL时溶液中沉淀较多，故选用罗丹明B最佳用量用量为1.6mL。4.3.4 过氧化氢的用量 用不同体积1%的H2O2按试验方法测定荧光强度，如下表所示（“”表示没有加入这种试剂）。1缓冲 (pH=9.5 )/mL111111罗丹明B(110-2 g/L) /mL1.61.61.61.61.61.6Mn2+(2.0 mmol/L )/mL1.61.61.61.61.6H2O2(1%)/mL0.60.81.01.21.4F48.047.747.747.248.465.8图5如图5所示，当H2O2用量为1.4mL时荧光强度差值F最大，故选用H2O2最佳用量为1.4mL。4.5 抗氧化剂清除羟自由基作用的测定于体系中加入抗坏血酸，按试验方法测定空白体系的F0，OH体系的F，加清除剂体系的Fs。荧光强度变化如图1所示，结果表明，随抗坏血酸用量增加，清除率加大。说明本体系中抗坏血酸与OH的清除作用有明显的量效关系。4.6 水果的抗氧化作用 新鲜水果洗净，晾干，准确称取30 g，加入200 mL蒸馏水，匀浆3 min，离心5 min，取上层清液0.6mL按上述方法进行测定。测定了5种新鲜水果的水提取物对OH的清除率，结果见表2。从表中看出，具有较强的清除OH的功能。表2各种水果提取液的荧光强度值及清除率水果F0F水果提取液荧光强度值Fs清除率（%）梨88.510.911.71.03苹果13.93.87西红柿18.29.41猕猴桃22.514.9橙子29.724.24.7结论 由上表（表2）可以看出梨、苹果、西红柿、猕猴桃及橙子这几种水果均有抗氧化的作用，且抗氧化作用越来越强，橙子的抗氧化能力最强，梨的抗氧化能力最弱。这些水果中含有天然的抗氧化剂，尤以橙子中含量最高，它们具有与机体亲和力强和安全性高等优点。由此