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生物化学实验指导书西安工程大学生物工程系二一一年十一月二十五日目 录实验1 蛋白质的沉淀,变性反应3实验2 蛋白质含量的测定7实验3 氨基酸的分离鉴定薄层层析法9实验4 液化淀粉酶活力测定11实验5 3,5-二硝基水杨酸比色定糖法14实验6 核酸浓度测定紫外线（UV）吸收法16实验7 血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳18实验8 植物中抗坏血酸含量的测定20实验1 蛋白质的沉淀,变性反应目的要求：了解蛋白质的沉淀反应,变性作用和凝固作用的原理及它们的相互关系。原 理：在水溶液中，蛋白质分子的表面，由于形成水化层和双电层而形成稳定的胶体颗粒，所以蛋白质溶液和其他亲水胶体溶液相类似。但是，蛋白质胶体颗粒的稳定性是有条件的，相对的。在一定物理化学因素影响下，蛋白质颗粒失去电荷，脱水，甚至变性，则以固态形式从溶液中析出，这个过程称为蛋白质的沉淀反应，这种反应可以分为以下两种类型。一、可逆沉淀反应在发生沉淀反应时，蛋白质虽已沉淀析出，但它的分子结构并未发生显著的变化，基本上保持原有的性质，沉淀因素除去以后，能再溶于原来的溶剂中。这种作用称为可逆沉淀反应，又叫做不变性沉淀反应，属于这一类的反应有盐析作用；在低温下，乙醇，丙酮对蛋白质的短时间作用以及利用等电点的沉淀等。二、不可逆沉淀反应在发生沉淀反应时，蛋白质分子结构，空间构象遭到破坏，失去原来的天然性质，这时蛋白质已发生变性。这种变性蛋白质的沉淀不能再溶于原来溶剂中的作用叫做不可逆沉淀反应。重金属盐，植物碱试剂，过酸，加热，震荡，超声波，有机溶剂等都能够使蛋白质发生不可逆沉淀反应。实验操作一、试剂1 蛋白质溶液取5mL鸡或鸭蛋清，用蒸馏水稀释至100mL，搅拌均匀后用48层纱布过滤，新鲜配制。2 蛋白质氯化钠溶液取20mL蛋清，加蒸馏水200mL和饱和氯化钠溶液100mL，充分混匀后，以纱布过滤不溶物（加入氯化钠的目的是溶解球蛋白）。饱和硫酸铵溶液，3%硝酸银，0.5%乙酸铅，浓盐酸，浓硫酸，浓硝酸，5%磺基水杨酸，0.1%硫酸铜，饱和硫酸铜溶液，0.1%乙酸，10%乙酸，饱和氯化钠溶液，10%氢氧化钠溶液。二、器材试管，试管架，滤纸，滴管。三、操作1、蛋白质的可逆沉淀反应蛋白质的盐析作用用大量中性盐使蛋白质从溶液中沉淀析出的过程称为蛋白质的盐析作用。蛋白质是亲水胶体，在高浓度的中性盐影响下，蛋白质分子被盐脱去水化层，同时蛋白质分子所带的电荷被中和，结果蛋白质的胶体稳定性遭到破坏而沉淀析出。析出的蛋白质仍然保持其天然蛋白质的性质，减低盐浓度时，还能溶解。沉淀不同的蛋白质所需中性盐的浓度不同，而盐类不同也有差异。例如：向含有清蛋白和球蛋白的鸡蛋清溶液中加入硫酸镁或氯化钠至饱和，则球蛋白沉淀析出。加硫酸铵至饱和，则清蛋白析出。另外，在等电点时，清蛋白可被饱和硫酸镁或氯化钠或半饱和的硫酸铵溶液沉淀析出。所以在不同条件下，用不同浓度的盐类可将各种蛋白质从混合溶液中分别沉淀析出，该法称为蛋白质的分级盐析。目前在酶的生产和制备，科研工作和临床化验等工作中广泛应用。取一支试管加入3mL蛋白质氯化钠溶液和3mL饱和硫酸铵溶液，混匀，静置约10min，球蛋白则沉淀析出。2、蛋白质的不可逆沉淀反应（1）金属沉淀反应重金属盐类易与蛋白质结合成稳定的沉淀而析出。蛋白质在水溶液中是酸碱两性电解质，在碱性溶液中（对蛋白质的等电点而言），蛋白质分子带负电荷，能与带正电荷的金属离子结合成蛋白质盐。在有机体内，蛋白质常以其可溶性的钠盐或钾盐的形式存在，当加入汞，铅，铜，银等重金属盐时，则蛋白质形成不溶性的盐类而沉淀。经过这种处理后的蛋白质沉淀不再溶解于水中，说明它已经发生变性。重金属盐类沉淀蛋白质的反应通常很完全，特别是在碱金属盐类存在时。因此，生化分析中，常用重金属盐除去体液中的蛋白质；临床上的蛋白质解除重金属盐的食物性中毒。但应注意，使用乙酸铅或硫酸铜沉淀蛋白质时，试剂不可加过量，否则可以使沉淀出的蛋白质重新溶解。取3支试管，各加入约1mL蛋白质溶液，分别加入3%硝酸银34滴，0.5%乙酸铅13滴和0.1%硫酸铜34滴，观察沉淀的生成。向第二，三支试管再分别加入过量的乙酸铅和饱和硫酸铜溶液，观察沉淀的再溶解。a有机酸沉淀蛋白质有机酸能使蛋白质沉淀。磺基水杨酸最有效，能将血清等生物体液中的蛋白质完全除去，因此得到广泛应用。B 无机酸沉淀蛋白质浓无机酸（除磷酸外）都能使蛋白质发生不可逆的沉淀反应。这种沉淀作用可能是蛋白质颗粒脱水的结果。过量的无机酸（硝酸除外）可使沉淀出的蛋白质重新溶解。临床诊断上，常利用硝酸沉淀蛋白质的反应，检查尿中的蛋白质的存在。取三支试管，分别加入浓盐酸15滴，浓硫酸，浓硝酸10滴。小心地向三支试管中，沿管壁加入蛋白质溶液6滴，不要摇动，观察各试管内两液面处有白色环状蛋白质沉淀出现。然后摇动每个试管。蛋白质应该在过量的盐酸及硫酸中溶解。在含硝酸的试管中，虽经振荡，蛋白质沉淀也不减少。(2) 加热沉淀蛋白质几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固，变成不可逆的不溶状态。盐类和氢离子浓度对蛋白质加热凝固有重要影响。少量盐类促进蛋白质的加热凝固。当蛋白质处于等电点时，加热凝固最完全，最迅速。在酸性或碱性溶液中，蛋白质分子带有正电荷或负电荷，虽加热蛋白质也不会凝固。若同时有足量的中性盐存在，则蛋白质可因加热而凝固。 取五支试管，编号，按下表加入有关试剂（单位：滴）管号 试剂蛋白质溶液0.1%乙酸10%乙酸 饱和NaCl 10%NaOH蒸馏水12345 10 10 10 10 10 5 55 2 2 7 2 2 5将各管混匀，观察记录各管现象后，放入沸水浴中加热10min，注意观察比较各试管的沉淀情况，解释实验结果。实验2 蛋白质含量的测定目的要求：学习双缩脲法测定蛋白质的原理和方法原理：具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应，此蛋白质在碱性溶液中，能与二价Cu离子形成紫色络合物，色深浅与蛋白质的浓度成正比，可用来测定蛋白质的浓度。实验操作一 测试样品1标准蛋白溶液10mg/ ml牛血清蛋白溶液（用0.05mol/L氢氧化纳溶液配制）。作为标准用的蛋白质要预先用凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其浓度称量，配制成标准溶液。 2测试样品液人（鸭）血清（稀释十倍）。测试其他蛋白样品应稀释适当倍数，使其浓度在标准曲线测试范围内。二 试剂双缩脲试剂：将0.175g硫酸铜（CuSO45H2O）溶于15mL蒸馏水，置于100mL容量瓶中，加入30mL浓氨水，30mL冰冷的蒸馏水和20mL饱和NaOH溶液，摇匀，室温放置12h,再以蒸馏水定容至100mL后，摇匀，备用。三 器材试管，试管架，恒温水浴，722型分光光度计。四、操作1、绘制标准曲线取6支干试管，按下表平行操作。 0 1 2 3 4 5标准蛋白液/mL 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0蛋白量/(mg) 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0蒸馏水/mL 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0双缩脲试剂/mL 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0充分混匀后,室温下(2025)放置30minA540取每组测定的A540值为纵坐标,蛋白质浓度为横坐标,绘制标准曲线。2、样品的测定取1支试管，按下表平行操作。 0 1 血清稀释液/mL 0.5蒸馏水/mL 1.0 0.5双缩脲试剂/mL 4.0 4.0充分均匀后,室温下(2025)放置30minA5403、查图通过样品的A值在标准曲线上找出对应的浓度值。实验3 氨基酸的分离鉴定薄层层析法目的要求：通过氨基酸的分离，学习薄层层析的基本原理及操作方法。原理：又称为薄板层析Thin Layer Chromatography（TLC），使用涂敷一层硅胶的玻璃板为支撑体，其流动相的移动是依靠毛细作用。色谱法中的一种，是快速分离和定性分析少量物质的一种重要实验技术，属固液吸附色谱，兼备了柱色谱和纸色谱的优点，一方面适用于少量样品（少到几微克，甚至0.01微克）的分离；另一方面在制作薄层板时把吸附层加厚加大，又可用来精制样品，此法特别适用于挥发性较小或较高温度易发生变化而不能用气相色谱分析的质。将试样点在层析板的一端，并将该端浸在作为流动相的溶剂（常称之为展开剂）中，随着溶剂向上的移动，经过试样点时，带动试样向上运动。类似于气相色谱中的分离过程，经过在两相间的多次分配平衡，试样中各组分在板上移动的距离不同而被分离。物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用Rf值（比移）来表示：Rf = d斑点/d溶剂在一定条件下某物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构，性质，溶剂系统，层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。本实验利用薄层层析法分离氨基酸。实验操作一 器材层析缸，支架，硅胶层析板，显色剂喷雾器。二 试剂1 展开剂每20ml乙醇和5ml水的混合物中溶解0.1g柠檬酸铵。2 氨基酸标准溶液0.5%的赖氨酸，苯丙氨酸，异亮氨酸溶液各5mL。3 显色剂0.1%水合茚三酮正丁醇溶液。三 操作1.取层析滤纸（长22cm，宽14cm）一张。在层析板的一端距边缘3mm处用铅笔划一条直线，并点出4个距离相等的点。2. 点样 用毛细管将各氨基酸标准溶液和待测样品分别点在这4个位置上，干后再点一次。每点在纸上扩散的直径以1.5mm左右为宜，最大不超过3mm。3. 在层析缸中加入展开剂，其量以深度不超过2mm为宜。展层 将已经点样层析的点样端向下直立于层析缸的展开剂中（展开剂的液面需低于点样线1cm）。待溶剂上升至距层析板上沿3-5mm时取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿界线，自然干燥或用风机热风吹干。4.显色 用喷雾器均匀喷上0.1%茚三酮正丁醇溶液，然后置烘箱中或用热风吹干即可显出各层析斑点。5.计算各种氨基酸的Rf值，并判断待测样品中所含氨基酸种类。实验4 液化淀粉酶活力测定目的要求：学习和掌握测定淀粉酶活力的原理与方法。原理：液化淀粉酶能催化水解淀粉生成分子较小的糊精和少量的麦芽糖及葡萄糖。本实验以碘的呈色反应来测定液化型淀粉酶作用速度，从而衡量此酶活力的大小。实验操作一、 实验仪器、试剂及材料：（一） 实验仪器1. 反应板（白色） 2. 大试管3. 恒温水浴箱 4. 烧杯5. 容量瓶漏斗 6. 吸管（二） 试剂和材料1原碘液 500毫升称取碘11克，碘化钾22克，加少量水全部溶解后，再定容至500毫升，贮于棕色瓶内。2稀碘液 500毫升吸取原碘液2毫升，加碘化钾20克，用水溶解并定容至500毫升，贮于棕色瓶内。32%可溶性淀粉溶液 100毫升准确称取可溶性淀粉2.0克（以绝干计），用10毫升水调匀后，再倾入80毫升沸水，摇匀。再加热煮沸23分钟，使溶液透明为止，待冷却再定容至100毫升。（此溶液需新鲜配置）。40.02mol/L柠檬酸磷酸氢二钠缓冲溶液 1000毫升（pH=6.0）称取柠檬酸8.07克，磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O）45.23克。加水溶解并定容至1000毫升。配置后用pH计校正pH。5标准“终点色”溶液 90毫升（1） 准确称取氯化钴（CoCl6H2O）40.2439克。重铬酸钾0.4878克，加水溶解并定容至500毫升。（2） 0.04%铬黑T溶液：准确称取铬黑T 40毫克，加水溶解定容至100毫升。（3） 取（1）液80毫升与（2）液10毫升混合，即为“终点色”溶液。冰箱保存，有效期为15天。6液化型淀粉酶（淀粉酶）粉。二、 操作步骤1 待测酶液的制备精确称取液化型淀粉的酶粉2.0克，加入小烧杯内，用少量0.02mol/L柠檬酸磷酸氢二钠缓冲溶液，并用玻璃棒捣研。将上层清液倾入容量瓶内（容量瓶大小由酶粉稀释倍数决定），沉渣部分再加入少量上述缓冲溶液；如此反复捣研34次，最后全部移入容量瓶中，用上述缓冲液定容至刻度，摇匀，用四层纱布（滤纸）过滤。滤液即为待测酶液。如为液体样品，可以直接过滤，即取一定量滤液加入容量瓶中，加入上述缓冲液稀释至刻度，摇匀，备用。2 测定（1） 取标准“终点色”溶液0.5ml，滴于反应板中（调色板）空穴内，作为比较终点色的标准。（2） 吸取2可溶性淀粉20毫升及pH6.0的0.2mol/L柠檬酸磷酸盐缓冲液5毫升，置于大试管中，在60恒温水浴中预热45分钟，然后加入待测的酶液0.5毫升，立即记录时间，充分摇匀。定时用滴管从试管中取出反应液约0.25毫升，滴于预先盛好有稀碘液（约0.25ml）的调色板空穴中。当空穴内显色反应由紫色逐渐变为棕红色，直到与标准“终点色”液相同时，即为反应终点，并记录时间T（分）。三、 计算：一克酶粉(或1毫升酶液)于60，pH = 6.0的条件下，1小时液化可溶性淀粉的克数,称为液化型淀粉酶的活力单位数。酶的活力单位（60202n）/0.5T式中：T反应时间（分）601小时60分钟202可溶性淀粉的量（克）0.5吸取待测酶液的量n稀释倍数注意：1.酶反应时间控制在23分钟之内。否则，应改变稀释倍数重新测定。 2.本实验中，吸取2可溶性淀粉及酶液的量必须准确，否则误差较大。实验5 3,5-二硝基水杨酸比色定糖法目的要求：学习用3, 5二硝基水杨酸测定还原糖的方法，进一步熟悉分光光度计的使用方法。原理：样品中原有和水解后产生的转化糖均有还原性，3, 5二硝基水杨酸与还原糖共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定浓度范围内，还原糖的量与棕红色物质深浅程度成一定比例关系，利用比色法可测之样品中的含糖量。该方法操作简便，快速，杂质干扰较少。实验操作一、 实验材料、仪器及试剂（一） 材料未知浓度葡萄糖溶液（二） 仪器1、722型分光光度计2、坐标纸3、试管及试管架（三） 试剂1、3, 5二硝基水杨酸试剂（DNS试剂）甲液：熔解6.9克结晶重蒸馏酚（结晶酚）于15.2毫升10氢氧化钠溶液中，并稀释至69毫升，在此溶液中加6.9克亚硫酸氢钠。乙液：称取255克酒石酸钾钠加入到300毫升10氢氧化钠溶液中，再加入880毫升13，5二硝基水杨酸溶液。将甲乙二溶液相混合即得黄色试剂，贮于棕色瓶中备用。在室温下，放置710天以后使用。2、0.1葡萄糖标准溶液（配制见实验操作）500毫升3、10氢氧化钠溶液 500毫升二、 操作步骤（一） 葡萄糖标准曲线的制定1. 葡萄糖标准溶液的配制：准确称取100毫克（0.1000克准确到小数点后四位）分析纯的无水葡萄糖（预先在105干燥至恒重），用少量蒸馏水溶解后，定量转移到100毫升容量瓶中，再定容到刻度，摇匀，浓度为1毫克/毫升。2. 标准曲线的制定：取7支大试管，分别按表一加入试剂。将各管溶液混合均匀，在沸水中加热5分钟，取出后立即用冷水冷却到室温，再向每管加入21.5毫升蒸馏水，摇匀。于520nm波长处测O.D.值。以葡萄糖毫克数为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制标准曲线。表 一 管号试剂012345样品葡萄糖标准溶液ml00.30.60.91.21.51.0葡萄糖量mg00.30.60.91.21.5蒸馏水ml2.01.71.41.10.80.51.0DNS试剂ml1.51.51.51.51.51.51.53. 通过坐标查出未知样品的葡萄糖量，计算出未知浓度。实验6 核酸浓度测定紫外线（UV）吸收法目的要求：（1）通过实验，了解紫外线（UV）吸收法测定核酸浓度的原理。（2）熟悉紫外分光光度计的使用方法。原理：核酸及其衍生物，核苷酸、核苷、嘌呤和嘧啶有吸收紫外线的性质，其吸收高峰在260nm波长处。核酸的摩尔消光系数（或称吸收系数）用(P)来表示。(P)为每升溶液中含有1克原子核酸磷的光吸收值（即A值）。因此，采用紫外分光光度法测定核酸含量时，通常规定在260nm波长下，每毫升含有 1gDNA溶液的消光值为0.020，而每毫升含有 1gRNA溶液的消光值为0.022（见表1）。表1 核酸摩尔消光系数及相关数值 (P) 含磷量/(%) A260nm pH7,260nm 1g/mlRNA 77007800 9.5 0.022DNA 6600 9.2 0.020故测得未知浓度核酸溶液的A260nm值，即可计算出其中RNA或DNA的含量。该操作简便，迅速，对于测定含有微量蛋白质和核苷酸等吸收紫外光物质的核酸样品时误差较小，并对被测样品无损，用量也少。若样品内混杂有大量的蛋白质和核苷酸等吸收紫外的物质，应该设法先除去。实验操作一、 试剂1 钼酸铵过氯酸沉淀试剂取3.6ml 70%过氯酸和0.25g钼酸铵溶于96.4ml蒸馏水中，即成0.25钼酸铵2.5过氯酸铵溶液。2 56氨水3测试样品RNA或DNA干粉。二、 器材分析天平，离心机，离心管，紫外分光光度计，烧杯，水浴，容量瓶（50ml），吸量管，试管及试管架。三、操作方法（1）准确称取待测的核酸样品0.5g，加入少量0.01mol/LNaOH调成糊状，再加适量水，用56氨水调至pH=7.0，定容至50ml，配成核酸溶液。（2）取两支离心管，甲管加入2ml样品溶液和2ml蒸馏水，乙管加入2ml样品溶液和2ml沉淀剂（沉淀除去大分子核酸，作为对照），混匀，在冰浴上或冰箱中放置30min，然后在3000r/min下离心10min。从甲、乙两管中分别吸取0.5ml上清液，用蒸馏水定容至50ml。选择厚度为1cm的石英比色杯，在260nm波长处测定A值。计算：(甲O.D260-乙O.D260)/0.020(或0.022)（ g/ml）DNA（或RNA）% - 100核酸浓度（g/ml）在本实验中，核酸浓度为50g/ml。实验7 血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳目 的 要 求：学习醋酸纤维薄膜电泳的操作，了解电泳的一般原理。原 理：薄膜电泳是用醋酸纤维薄膜作为支持物的电泳的方法。醋酸纤维薄膜由二乙醋酸纤维素制成，它具有均一的泡沫样的结构，厚度仅为120m，有较强渗透性，对分子移动无阻力，作为区带电泳支持物进行蛋白电泳有简便，快速，样品用量少，应用广泛，分析清晰，没有吸附现象等优点。目前已广泛用于血清蛋白，脂蛋白，血红蛋白，糖蛋白和同工酶的分离及用在免疫电泳中。实验操作一 器材1 醋酸纤维薄膜 常压电泳仪2 盖玻片3 大培养皿4 粗滤纸5 竹镊二 试剂1 巴比妥缓冲液（pH8.6，离子强度0.07）1000mL巴比妥2.76g，巴比妥钠15.45g，加水至1000mL。2 染色液 300mL含氨基黑10B 0.25g，甲醇50mL，冰醋酸10mL，水40mL（可重复使用）。3 漂洗液 2000mL含甲醇或乙醇45mL，冰醋酸5mL，水50mL。4透明液 300mL含无水乙醇7份，冰醋酸3份。三、操作1 浸泡 用镊子取醋酸纤维薄膜一张放在缓冲液中浸泡20分钟2 点样 把膜条从缓冲液中取出，夹在两层粗滤纸内吸干多余液体，然后平铺在滤纸上（无光泽面朝上），将盖玻片先在血清上沾一下，再在膜条一端23cm处轻轻地水平地落下并随即提起，这样即在膜条上点上了细条状的血清样品。3 电泳 在电泳槽内加入缓冲液，使两个电极槽内的液面等高，将膜条平悬于电泳槽支架的滤纸桥上（先剪裁尺寸合适的滤纸条，取双层滤纸条附着在电泳槽的支架上，使它的一端与支架的前沿对齐，而另一端浸入电极槽的缓冲液内。用缓冲液将滤纸全部浸湿并驱除气泡，使滤纸紧贴在支架上，即为滤纸桥，它是联系醋酸纤维薄膜和两极缓冲液之间的“桥梁”）。膜条上点样的一端靠近负极。盖严电泳室。通电。调节电压至160V，电流强度0.40.7mA/cm（毫安/厘米）膜宽，电泳时间约为25分钟。4 染色 电泳完毕后将膜条取下并放在染色液中浸泡10分钟。5 漂洗 将膜条从染色液中取出后移置到漂洗液中漂洗数次至无蛋白区底色脱净为止，可得色带清晰的电泳图谱。实验8 植物中抗坏血酸含量的测定实验目的 学习和掌握用2，6二氯酚靛酚滴定法测定植物中抗坏血酸含量的原理与方法。实验原理维生素C是人类营养中最重要的维生素之一，它与体内其它还原剂共同维持细胞正常的氧化还原电势和有关酶系统的活性。维生素C能促进细胞间质的合成，人体缺乏维生素C时会出现坏血病，因而称其为抗