药物高通量筛选的设计与实施.doc

关键词：高通量筛选,设计,实施,综述健康网讯：利用计算机模拟技术、组合化学及高通量筛选技术发现新药的研发模式，带动了新药发现技术方法的重要变革。高通量筛选（high throughput screening, FITS)又称大规模集群式筛选，是由一些有特定靶点的微量生物筛选方法、自动化机器人技术和完整数据处理技术有机组合而成，是一种新型的、高自动化、高灵敏度、高通量的筛选发现新药的技术。目前，世界上大型制药企业都无一例外地将其作为驱动新药发现的强力引擎，纷纷引进新药研发领域，使FITS的形式和内容不断丰富发展，并日益呈现出向超高通量筛选发展的趋势。 1 HTS系统的组成 1.1 高容量的样品库系统 高容量的样品库及其数据库管理系统是开展HTS的先决条件。它们可以是生物样品（包括植物、动物和微生物的样品）、从生物样品中提取的活性部位或单体化合物以及人工合成（传统化学合成、组合化学合成）的化合物，化合物数量越多，结构多样性越高，筛选的命中率也越高。 1.2 自动化的操作系统 自动化操作系统利用计算机，通过操作软件控制整个筛选过程，一般包括计算机及其操作软件、自动化加样设备、温孵离心设备及堆栈4个部分，也可以选取不同的组合应用。 1.3 高灵敏度检测系统 HTS检测系统一般采用液闪计数器、化学发光检测计数器、宽谱带分光光度仪、荧光光度仪以及闪烁亲和分析( scintillation proximity assay，SPA)等检测方法。检测灵敏度越高，则所需的样品量越少，效果越好。 1.4 高特异性的药物筛选系统 HTS常用的筛选模型都是建立在分子水平和细胞水平上，观察的是药物与分子靶点的相互作用，能够直接认识药物的作用机制。常用的筛选模型可分为受体结合分析法、细胞因子测定法、细胞活性测定法、代谢物质测定法以及基因产物测定法等。目前，这些模型主要集中在受体、酶、通道以及各种细胞反应等方面。近年来，基因水平筛选模型可在蛋白质芯片、基因芯片上进行，使筛选模型更加多样化。 1.5 高效的数据处理系统 HTS对数以万计的样品进行多模型的筛选，数据量庞大，与此相适应的数据库管理系统主要承担样品库管理、生物活性信息管理、HTS服务、药物设计与药物发现功能。它以生物活性数据的加工和处理为主体，综合利用化合物的结构信息资源，可以更好地设计药物，加快药物的发现进程。由于FITS采用高度自动化的操作系统，采用分子、细胞水平的生物活性检测模型，借助高灵敏度的检测仪器对化合物的生物活性进行检测。其优势在于样品（包括化合物以及生物样品）可在微孔板上进行，反应体积仅有几微升到数百微升，样品消耗量小。由于广泛使用基因表达的酶、受体、信号传导因子等，筛选的特异性较高。由于应用自动化系统，每天可对数十以至数百块微孔板进行操作，对数千乃至数万的样品进行检测筛选。另外，归纳化合物的活性数据，得出构效关系，可为药物发现提供极有价值的信息。 2 HTS的设计与实施 HTS是从药物作用靶点到活性化合物发现过程，是药物发现系统工程的重要子系统之一。在此过程中，适当安排筛选靶点和测试方法对于建立生物学相关和优质高效的筛选体系至关重要。试剂的供应往往是HTS的瓶颈，必须合理安排试剂部门和筛选部门之间的工作，确保筛选体系充分高效运转。目前，为加快筛选的进度， HTS实验室正逐步采用类似工业化的供应链体系进行管理。总之，HTS系统的实施涉及众多学科，影响因素众多，需要集合包括工程技术、生物学、生物化学、信息技术(IT)、化学等领域专家的智力。以下是在HTS设计和实施中，应特别重视的因素。 2.1 作用靶点的选择在选择治疗靶点时，首先应该重点确定靶点与疾病的相关性，但也应重视其他影响HTS体系的重要因素，主要包括技术和化学方面的因素。在技术上应该简洁、高效，化学上则应考虑样品对特定靶点产生的治疗相关效应能否重现在筛选体系中，此效应能否通过筛选被发现，以及是否具有适合作为药物开发的理化性质。 目前，虽然可用于HTS的靶基因和靶标非常有限，但据推算，人类基因组中存在300010000 个药物的靶点可供疾病治疗开发。HTS实践表明，某些作用靶点化学的可行性更高，如G蛋白偶联受体(GPCRs)、激酶、离子通道、核受体、蛋白酶等。其中，GPCRs和激酶尤其引人注目HTS筛选命中率较高。对于通过蛋白质之间相互作用而发挥效应的靶点，往往难以被HTS成功应用。原因之一在于样品库中的化合物往往不具备足够大的分子体积和结构复杂性，以阻断巨大的发生在靶点上的蛋白质-蛋白质相互作用面。天然产物由于分子较大，结构复杂，易于做到这一点。对于此类受体而言，找到具有令人满意的阻断效应和接近药物属性（如分子量不要太大）的化合物难度很大。最近，有的国外实验室首先筛选出具有阻断作用的小片段，然后再将这些片段拼接起来，以产生具有适度大小的有效阻断剂。其次，选择作用靶点时，另外一个同等重要的因素是建立高效、优质的筛选体系在技术上的可行性。当然，由于新测试技术的不断涌现，许多新的测试方法已经能够适应多种类型靶点测试的要求。尽管如此，一些类型靶点技术上的可行性仍然很低。技术上容易实现的靶点有GPCRs、激酶、蛋白酶、细胞核受体以及蛋白质-蛋白质相互作用类型的靶点，离子通道类型靶点则相对较难实现。除了激酶和蛋白酶，其他类型的酶的筛选体系必须因底物性质差异而做出适宜的选择。 对于HTS体系而言，获得充足的试剂是一个需要审慎考虑的重要因素，此项工作费钱、费力，且结果难以预料。对于蛋白质靶点而言，往往依赖于特定蛋白质表达和纯化的难易程度，每次筛选需要的蛋白质量，以及底物、配体或者消耗品的价格。所有这些因素必须在筛选体系建立之初就应该审慎考虑，认真评估，因筛选体系的差异而有所制宜。理想的作用靶点应该是化学可行性强、技术上简便、价格低廉、充分有效和高度的生物相关性，这样的靶点少而又少，但应该努力分散化解风险，均衡可用的资源。 2.2 测试方法的选择 2.2.1 生物化学的检测方法 目前，大多数的生物化学筛选都采用均质“混合一读取（mix-and-read）”形式。这些技术包括SPA、荧光增强(fluorescence intensify, FLINT)、荧光极化(fluorescence polari- zation，FP)、荧光共振能量转移（fluorescence reson- ance energy transfer，FRET)技术、时间分辨能量转移（time-resolved energy transfer，TRET）等。 在生物化学检测分析中，最常用的检测方法都是基于包括闪烁、荧光、吸收、发光等性质的光学方法。其中，基于荧光的检测方法因具有灵敏度高、易于微型化以及适应均质化的特点，是最为重要的检测分析方法之一。建立基于荧光的测试方法应该审慎考虑波长，一般来说应该避免采用短的激发波长（特别是400nm)，以减少被测试化合物带来的干扰。 尽管FLINT已经成功地应用于HTS,由于缺少适宜的荧光底物，这种形式的检测仅仅用于少数的酶靶点测试。目前，见诸报道的有多种形式的检测方法。如将FP用于1536孔板中的配体一配体结合反应以及酶测试。TRET是建立在镧系(Ln3+）复合物与适宜的能量共振受体之间大幅度能量转移基础上的双标签检测方法，它可以降低背景干扰，具有较高的灵敏度，特别适用于蛋白质-蛋白质之间的相互作用检测，被越来越多的HTS体系采用。目前，HTS已开始应用基于单分子振动荧光光谱分析方法，如荧光相关谱(fluorescence correlation spectroscopy,FCS )和荧光强度分配分析技术（fluorescence intensity distribution analysis， FIDA)，这些测试方法所需测试体积极小(1到数个 fL)。其他重要的放射分析技术如SPA/Leadseek- erTM和闪烁板(F1ashPlateTM)等应用日益广泛，已用于激酶、核酸处理酶、配体-受体相互作用和cAMP 水平的检测。基于荧光的分析技术也存在诸如安全性、要求试剂稳定性较高、读取时间长以及在同位素环境中特异性差等缺点，映像板读取器(imaging plate reader)的出现可以解决读取时间和测试微型化的难题。 2.2.2 基于细胞的检测方法 20世纪90年代中期以前，大多数的基于细胞分析检测技术尚不能适应HTS的要求。然而，随着技术的不断进步，筛选通量日益增大，基于细胞的测试技术越来越得到重视。目前，荧光映像板读取器(fluorescence imaging plate reader, FLIPRTM）已广泛用于GPCR 和离子通道的检测；电压敏感荧光共振能量转移技术（voltage-sensitive fluorescence resonance energy transfer，VIPRTM)则是另外一种在离子通道检测方面非常有前途的方法。报告基因方法是一种基于细胞形式的分析检测技术，可用作HTS的分析检测。由于该方法需要较少的细胞，易于实现自动化，可以在1536孔板上进行，因此比FLIPRTM和 VIPRTM更具优势。目前包括荧光素酶、分泌性碱性磷酸盐以及-内酰胺酶等的微型报告基因阅读器 (report gene readout)已用于FITS检测。另外，基于蛙类载黑素细胞(frog melanophores)暗化的检测技术也已经用于GPCR和其他作用靶点的检测。 2.3匹配检测方法与作用靶点选择检测方法应该在阐明众多影响因素的基础上进行。如GPCR 可以采用FLIPR和报告基因等基于细胞的检测分析方法，还可采用生物化学的检测技术，如SPA, FP、FIDA。选择针对GPCR功能还是针对结合性质进行分析检测，取决于筛选目的在于寻找激动剂还是拮抗剂。FLIPR和报告基因等功能性分析手段与针对结合性质的检测手段相比，更适合用于激动剂的筛选，而对于拮抗剂的筛选两种类型检测手段皆为可行。FLIPR分析检测技术易于实施，但这种筛选方法需要耗费大量的人力（特别是在细胞培养方面），也不如报告基因检测方法易于实现自动化。报告基因筛选方法的缺点是需要较长的孵育时间，筛选化合物产生的细胞毒作用可能严重干扰筛选结果。但对于筛选GPCR激动剂而言，有时报告基因阅读器较FLIPR灵敏度高。 对GPCR采用生物化学测试方法进行筛选， SPA作为放射标记易于实现。然而，FP和FIDA 等荧光测试方法正在日益受到重视，具有稳定、安全，较放射标记价廉，简便易行，可预见性强，当然也存在标记过强干扰生物化学反应的缺点。 总之，理想的测试方法应该满足可预见性高、相关性好，简便易行的要求。因此必须通盘考虑，权衡利弊，使之达到最优组合。 2.4筛选体系的建立和有效性在不降低筛选通量的前提下，应该基于筛选质量最优的原则，确定 HTS系统的条件，并使成本最低。在设计HTS体系时，生物化学数据和统计学处理十分重要。优化筛选步骤对于同时或者有选择性地显著提高生物系统的稳定性和活性，获得高性能的筛选体系，显得十分重要。 2.4.1HTS中关键的生物化学参数在HTS中能否发现有希望的作用于靶点的目标化合物，主要受两个因素影响。首先，筛选化合物库中有无目标化合物；其次，当目标化合物效应达到有统计学意义的程度时，筛选系统掌控测试的能力。对于不同的酶抑制剂而言，酶作用底物的浓度往往决定不同类型酶抑制剂的反应灵敏度，这可以充分说明HTS 设计的重要性。在一个筛选体系中，将底物的浓度设定在110Km，如果该底物一酶作用的竞争性拮抗剂的浓度高于1/11化合物浓度1 Ki的话，呈现出来的拮抗效应还不到50，因而就很可能漏筛。也就是说在一个10mol/L的筛选体系中，当竞争性拮抗剂的浓度达到1 Ki(0.91mol/L)或更高时，就可能漏筛。而对非竞争性拮抗剂而言，当底物的浓度设定在1/10Km时，类似的问题也将出现。因此，在特定的底物浓度下，如果要获得满意的筛选结果，必须对筛选的目标化合物类型进行深入了解，是筛选竞争性拮抗剂，还是筛选非竞争性拮抗剂，底物浓度的设定尽量兼顾两种类型拮抗剂的筛选。 总之，基于酶的筛选体系中，对底物浓度、酶浓度、孵育时间及底物降解、加入试剂的顺序等，应该审慎考虑。在基于结合作用（包括蛋白质一蛋白质、蛋白质-核酸等）筛选体系中，对配体浓度、受体浓度、前孵育和平衡情况应该予以重视。在基于细胞的筛选体系中，由于存在很多难于控制的内在因素，以下因素应审慎考虑：(1)效应与细胞数目成线性关系；(2)如果应用预孵育，细胞与备筛样品预孵育应该审慎考虑；(3)在不降低阻断效应或激动效应测量值的前提下，优化孵育时间。 2.4.2 影响筛选因素的优化 由于HTS是在人为的条件下进行的，生物系统可能存在稳定性差、活性难于显著显现等问题。因此，与其他领域的研究工作相比，对稳定性要求更高。由于稀释后的试剂溶液往往要长时间使用（通常412h)，保证试液较低的变异度和对背景的灵敏反应信号十分重要。另外，要筛选成千上万的样品，试剂用量和花费巨大，必须想方设法减少试剂消耗，筛选容积日益微型化，已从试管筛选，先后开发了96孔板、384孔板，直到1536孔板，甚至9600孔板。目前，还出现了微阵列技术、芯片膜片钳( patch-on-a-chip ) 技术等。特别是更新的采用光刻技术制造的微流体芯片，可以做到超高的筛选通量，适用多种检测方法（包括结合分析、酶分析和细胞分析），具有广阔的前景。但微孔板技术的发展也面临着困难，如微量液体极易挥发，不适于那些不能用DMSO作溶剂的筛选方法，以及受限于当今仍不完善的微量液体分配技术等。在HTS样品库中，往往采用DMSO溶解人工合成或天然提取物，DMSO对筛选系统影响应加以考虑。如果用标准浓度（0.51，v/v) DMS溶解的筛选样品的活性结合效应明显下降，就应该降低DMS的浓度。力争做到在优化后的条件下，避免溶剂的不利影响。 在HTS体系运行的各种条件中，必须测试试剂的稳定性，测试的内容包括溶剂浓度、储备液浓度、储藏池、多孔板等。有时会发生信号缺失，原因并非反应体系中生物配对试剂的降解，而在于试剂被所用塑料制品（储存池、移液器头或者多孔板）的吸附所致。在条件的优化过程中，需要测试优化的因素众多，包括缓冲液的组成、pH值、温度、离子强度、渗透压、单价离子(Na、K+、Cl-）、二价阳离子 (Mn+、Mg2+、Ca2+、Zn2+、C u2+、Co2+）、调节剂（甘油、PEG)、聚阳离子（肝磷脂、右旋糖酐）、载体蛋白 钝化牛血清蛋白(BSA)、酪蛋白、鳌合剂(EDTA、 EGTA)、封阻剂( PEI、奶粉）、蛋白酶抑制剂 (PSMF、leupeptin)及去垢剂(triton、吐温、chaps) 等。 除了单独分析上述因素外，鉴于它们之间常出现协同或拮抗作用，这些因素之间的作用也应通盘考虑。全因素设计或者部分因素设计可以采用 JMP、Design expert等统计软件包进行。当因素多于4个时，实验设计将导致复杂的组合结果。对于高密度的筛选体系，如果想通过随机测试优化获得可靠的数据，优化工作任务艰巨，这就迫切需要自动化的解决方案。目前，有的实验室采用自动分析优化(automated assay optimization,AAO)组件进行几种类型靶点和测试方式的优化。典型的因素优化做法是首先采用包括多个因素的部分水平设计，而后进行针对找出的主要影响因素的所有水平的实验，以分析此因素产生的主要影响和两因素交互作用。测试