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dna扩增技术总结本页是最新发布的dna扩增技术总结的详细范文参考文章，感觉写的不错，希望对您有帮助，为了方便大家的阅读。篇一：PCR实验技术总结PCR实验技术总结点击次数：422 作者：佚名 发表于：2008-06-15 20:53 转载请注明来自丁香园来源：互联网PCR技术简史一、PCR的最早设想核酸研究已有100多年的历史，本世纪60年代末、70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术，Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。二、PCR的实现1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis 等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供以致一种合适的条件-摸板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复性及延伸的温度与时间。三、PCR的改进与完善Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA 聚合酶 I 的Klenow片段，其缺点是：Klenow酶不耐高温，90会变性失活，每次循环都要重新加。引物链延伸反应在37下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，其PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。此种以Klenow酶催化的PCR技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点，范文TOP100但由于Klenow酶不耐热，在DNA模板进行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序添了不少困难。这使得PCR技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视。1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR，其扩增的DNA片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次，仍需加入新酶。1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA聚合酶。此酶具有以下特点：耐高温，在70下反应2h后其残留活性大于原来的90%，在93下反应2h后其残留活性是原来的60%，在95下反应2h后其残留活性是原来的40%。在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。为与大肠杆菌多聚酶I Klenow片段区别，将此酶命名为Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。范文写作此酶的发现使PCR广泛的被应用。PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：（一）模板DNA的变性：模板DNA经加热至93左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；（二）模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；（三）引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟，23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。(Plateau)。到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。PCR的反应动力学PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用Y(1X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA 片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应” 这种效应称平台期数、PCR 扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。PCR反应体系与反应条件一、标准的PCR反应体系：10扩增缓冲液10ul4种dNTP混合物各200umol/L引物各10100pmol模板DNA0.12ugTaq DNA聚合酶2.5uMg2+1.5mmol/L加双或三蒸水至100ul二、PCR反应五要素参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+（一）引物引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。设计引物应遵循以下原则：1、引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。2、引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。3、引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带最全面的范文参考写作网站。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。4、避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。5、引物3端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。6、引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。7、引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量： 每条引物的浓度0.11umol或10100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。（二）酶及其浓度目前有两种Taq DNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2。5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。（三）dNTP的质量与浓度dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.07.5，小量分装，-20冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，思想汇报专题就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。（四）模板(靶基因)核酸模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是： 溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。（五）Mg2+浓度 Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.52.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。三、PCR反应条件的选择PCR反应条件为温度、时间和循环次数。（一）温度与时间的设置基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在9095变性，再迅速冷却至4060，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至7075，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为100300bp时)可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94变性，65左右退火与延伸（此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性）。1、变性温度与时间变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，9394lmin足以使模板DNA变性，若低于93则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。2、退火(复性)温度与时间退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至4060，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的篇二：分子生物学技术总结分子生物学技术总结姓名：梁潇班级：2班学号：1080800066一、核酸/蛋白分离技术1DNA分离：破碎细胞抽提蛋白质DNA沉淀乙醇洗除盐琼脂糖凝胶电泳检测 用细胞裂解液裂解细胞膜，收集细胞核，加入SDS破裂核膜，用蛋白酶K使核蛋白降解成小片段并从DNA是上解离下来，经苯酚、氯仿抽提去除蛋白质，无水乙醇沉淀DNA，75%乙醇洗涤DNA沉淀，真空干燥后，溶解于TE缓冲液中即得到相对分子量高的DNA。2RNA分离：抑制RNase抽提去蛋白质DNase消化DNA甲醛变性琼脂糖凝胶电泳3蛋白分离：（1）层析法离子交换层析亲和层析（2）电泳分离：聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳是网状结构，具有分子筛效应。它有两种形式：非变性聚丙烯酰胺凝胶，在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。而SDS-PAGE仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。此鉴定方法中，蛋白质的迁移率主要取决于它的相对分子质量，而与所带电荷和分子形状无关。应用：分离蛋白质和寡糖核苷酸二、基因克隆技术1PCR：在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促和反应，PCR技术的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性。反应分为三步：1）变性（9295） 2）退火 3）延伸PCR各步骤的目的（1）预变性：破坏DNA中可能存在的较难破坏的二级结构。使DNA充分变性，减少DNA 复杂结构对扩增的影响，以利于引物更好的和模板结合，特别是对于基因组来源的DNA模板，最好不要吝啬这个步骤。此外，在一些使用热启动Taq酶的反应中，还可激活Taq酶，从而使PCR反应得以顺利进行。（2）变性-退火-延伸循环：模板DNA的变性：模板DNA经加热至93左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备；模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。（3）PCR仪扩增循环后72度延伸10分钟：用PCR仪扩增时,(变性.退火,延伸)循环完成后,继续72度延伸了10分钟的原因：延伸时间取决于待扩增DNA片段的长度。（当然是在反应体系一定的条件下）根据延伸速率推得，扩增1kb以内的DNA片段1min即可，而3-4kb则需要3-4min，依次照推。通常在最后一轮要适当的将延伸时间延长至4-10min，这样做是使PCR反应完全以提高扩增产量 继续72度延伸了10分钟除了可以使PCR反应完全以提高扩增产量外，还有一个作用是：在用普通Taq酶进行PCR扩增时在产物末端加A尾的作用，可以直接用于TA克隆的进行。基因组PCRPCR RT-PCR（含有内含子的基因）RACE/Gene WalkingSMARTTM 3-RACE：利用mRNA的3 末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点，以连有SMART寡核苷酸序列通用接头引物的Oligo(dT)30MN作为锁定引物反转录合成标准第一链cDNA。然后用一个基因特异引物GSP1（gene specific primer，GSP）作为上游引物，用一个含有部分接头序列的通用引物UPM（universal primer，UPM）作为下游引物，以cDNA第一链为模板，进行PCR循环，把目的基因3 末端的DNA片段扩增出来。SMARTTM 5-RACE：先利用mRNA的3末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点，以Oligo(dT)30MN作为锁定引物在反转录酶MMLV作用下，反转录合成标准第一链cDNA。利用该反转录酶具有的末端转移酶活性，在反转录达到第一链的5 末端时自动加上3-5个(dC)残基，退火后(dC)残基与含有SMART寡核苷酸序列Oligo(dG)通用接头引物配对后，转换为以SMART序列为模板继续延伸而连上通用接头（见下图）。然后用一个含有部分接头序列的通用引物UPM（universal primer，UPM）作为上游引物，用一个基因特异引物2（GSP 2 genespecific primer，GSP）作为下游引物，以SMART第一链cDNA为模板，进行PCR循环，把目的基因5末端的cDNA片段扩增出来。最终，从2个有相互重叠序列的3/ 5-RACE产物中获得全长cDNA，或者通过分析RACE产物的3和5端序列，合成相应引物扩增出全长cDNA。2 文库筛选（1）基因组文库：某种生物全部基因组DNA序列的随机片段重组DNA克隆的群体。该文库以DNA片段的形式贮存着某种生物全部基因组的信息，可以用来选取任何一段感兴趣的序列进行复制和研究。材料来自生物体基因组是RNA(如RNA病毒)所构建的核酸片段克隆群体，也是该生物的基因组文库。 基因上下游：基因上游：存在P-box和TATA-box一个是识别启动子的位点，一个是激活启动子的位点 基因下游： 核酸分子杂交筛选：是指具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下按碱基配对原则形成双链的过程。杂交双方分别称为探针与待测核酸。杂交分子：杂交后形成的异源双链分子。核酸分子杂交技术：是指用标记的已知DNA或RNA片段检测样品中未知核酸序列，通过碱基互补配对原则发生同源性结合，再经显影或显色的方法，将结合的核酸序列的位置或大小显示出来。核酸探针( probe )：带有可检测标记的已知序列的互补DNA或RNA片段。通常用核素或非核素示踪标记。原理：具有互补序列的两条单链核酸分子在一定条件下（适宜的温度及离子强度等）碱基互补配对结合，重新形成双链；在这过程中，核酸分子经历了变性和复性的变化，以及复性过程中各分子间键的形成和断裂等。应用：定性或定量检测DNA或RNA序列片段的有力工具。（1）cDNA文库：以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。纯正基因 分子杂交/免疫筛选三、基因功能分析技术（一）基因结构：1转录起始点：（1）TATA框（TATA box）：其一致顺序为TATAATAAT。它约在基因转录起始点上游约-30-50bp处，基本上由A-T碱基对组成，是决定基因转录始的选择，为RNA聚合酶的结合处之一，RNA聚合酶与TATA框牢固结合之后才能开始转录。（2）CAAT框（CAAT box）：其一致顺序为GGGTCAATCT，是真核生物基因常有的调节区，位于转录起始点上游约-80-100bp处，可能也是RNA聚合酶的一个结合处，控制着转录起始的频率。2引物延伸：变性退火延伸3启动子：启动子是一段位于结构基因5端上游区的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确地相结合并具有转录起始的特异性。启动子的结构影响了它与RNA聚合酶的亲和力，从而影响了基因表达的水平4瞬时表达：瞬时转染后的初期，质粒或DNA片段是游离在细胞中的，能够进行表达，成为瞬时转染表达。随后，游离在细胞中的质粒或DNA片段有两种归化，一种是被降解，还有一种是插入染色体中而能够持续地稳定地表达。人类结构基因4个区域：编码区，包括外显子与内含子；前导区，位于编码区上游，相当于RNA5末端非编码区（非翻译区）；尾部区，位于RNA3编码区下游，相当于末端非编码区（非翻译区）；调控区，包括启动子和增强子等。基因编码区的两侧也称为侧翼顺序外显子和内含子大多数真核生物的基因为不连续基因（interruptesd或discontinuous gene）。所谓不连续基因就是基因的编码顺序在DNA分子上是不连续的，被非编码顺序所隔开。编码的顺序称为外显子（exon），是一个基因表达为多肽链的部分；非编码顺序所称为内含子（intron）,又称插入顺序（intervening sequence,IVS）。内含子只转录，在前mRNA(pre-mNRA)时被剪切掉。如果一个基因有几个内含子，一般总是把基因的外显子分隔成n+1部分。内含子的核苷酸数量可比外显子多许多倍。外显子外显子内含子接头每个外显子和内含子接头区都有一段高度保守的一致顺序（consensus seqence）,即内含了5末端大多数是GT开始，3末端大多是AG结束，称为GT-AG法则，是普遍存在于真核基因中RNA剪接的识别信号。侧翼顺序侧翼顺序在第一个外显子和最末一个外显子的外侧是一段不被翻译的非编码区，称为侧翼顺序（flanking sequence）。侧翼顺序含有基因调控顺序，对该基因的活性有重要影响。转录过程启动子 启动子（promoter）包括下列几种不同顺序，能促进转录过程：（1）TATA框（TATA box）（2）CAAT框（CAAT box）（3）GC框（GC box）：有两个拷贝，位于CAAT框的两侧，由GGCGGG组成，是一个转录调节区，有激活转录的功能。此外，RNA聚合酶负责转录tRNA的DNA和5SrDNA，其启动子位于转录的DNA顺序中，称为下游启动子。5增强子在真核基因转录起始点的上游或下游，一般都有增强子（enhancer）,它不能启动一个基因的转录，但有增强转录的作用。此外，增强子顺序可与特异性细胞因子结合而促进转录的进行。研究表明，增强子通常有组织特异性，这是因为不同细胞核有不同的特异因子与增强子结合，从而对基因表达有组织、器官、时间不同的调节作用。6终止子在一个基因的末端往往有一段特定顺序，它具有转录终止的功能，这段终止信号的顺序称为终止子（termianator）。终止子的共同顺序特征是在转录终止点之前有一段回文顺序，约7-20核苷酸对。回文顺序的两个重复部分分由几个不重复碱基对的不重复节段隔开，回文顺序的对称轴一般距转录终止点16-24bp。在回文顺序的下游有6-8个A-T对，因此，这段终止子转录后形成的RNA具有发夹结构，并具有与A互补的一串U，因为A-U之间氢健结合较弱，因而RNA/DNA杂交部分易于拆开，这样对转录物从DNA模板上释放出来是有利的，也可使RNA聚合酶从DNA上解离下来，实现转录的终止。（二）基因拷贝数拷贝数就是指某目的基因（可以是质粒）在某一生物群体或个体中存在的个数.单拷贝就是该基因在基因组中只有一个,多则指有多个。Southern blot检验：常用的 DNA 定量的分子生物学方法。原理：Southern杂交是利用标记的探针（probe）与膜上靶DNA片段进行杂交的技术，检测靶DNA片段中是否存在与探针同源的序列。将待测的 DNA 样品固定在固相载体（硝酸纤维膜或尼龙膜）上，与标记的核酸探针进行杂交，在与探针有同源序列的固相 DNA 的位置上显示出杂交信号，通过检测信号的有无、强弱可以对样品定性、定量，从而计算出转入的拷贝数。杂交过程是高度特异性的,可以根据所使用的探针(序列已知)进行特异性的靶序列检测。应用：目的基因检测，定性基因拷贝数，定量过程：基因重组与转化重组质粒提取与鉴定质粒大量制备探针制备细胞培养 基因组DNA制备 DNA浓度测定 酶切（三）转录模式1Northern blot：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern Blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。用途：检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。2（半）定量RTPCR：半定量RT-PCR一般是在没有条件做实时PCR 的情况下使用，用于测定体内目的基因的表达增加减少与否，即通过目的基因跑出来的电泳带与管家基因（如-actin）的电泳带的相对含量比较，观测目的基因表达增减，另外还要做一个-actin的内参照对照。（四）生物功能分析1过表达分析：2基因抑制或敲除分析：某一突变基因的表型效应由于第二个突变基因的出现而恢复正常时，称后一突变基因为前者的抑制基因。回复突变使突变基因的脱氧核糖核酸（DNA）分子结构恢复正常；抑制基因则并不改变突变基因的DNA分子结构，而只是使突变型的表型恢复正常。抑制基因一般用符号Su代表。当抑制作用发生在同一基因中时，这种抑制作用称为基因内抑制，属于不同基因的抑制作用则称基因间抑制。（五）蛋白定位GFP融合表达亚细胞定位：亚细胞定位是指某种蛋白或表达产物在细胞内的具体存在部位。