化学通报在线预览版.pdf

http www hxtb org 化学通报 在线预览版 1 高效液相色谱测定牛奶中邻苯二甲酸酯的方法研究 高效液相色谱测定牛奶中邻苯二甲酸酯的方法研究 徐向华 1 方晓明2 丁卓平1 陶宁萍1 1上海水产大学食品学院 上海 200090 2上海出入境检验检疫局 上海 200135 摘 要 摘 要 建立了针对欧盟指令2007 19 EC中禁止与食品接触的6种邻苯二甲酸酯 BBP DBP DEHP DNOP DINP和DIDP 的RP HPLC测定方法 样品用甲醇 正己烷 甲基叔丁基醚 v v 1 1 提取 经冷冻去脂 液液萃取和硅胶固相萃取净化后 用ODS柱 250 4 6mm 5 m 分离 UV 224 nm检测 结果表明 BBP和DBP在0 05 80 g mL DEHP和DNOP在0 1 80 g mL DINP和DIDP在0 5 80 g mL的质量浓度范围内 峰面积与质量浓度呈线性关系 相关系数 r2 均大于0 998 方 法检测限分别为 BBP 0 15 g g DBP 0 1 g g DEHP和DNOP 0 2 g g DINP和DIDP 0 6 g g 6 种PAEs的添加量在最大残留限量值的0 2 1和2倍时 其平均回收率为80 7 102 3 相对标准偏 差为1 7 9 0 所建立的方法经济 准确 可靠 满足欧盟指令中6种邻苯二甲酸酯限量的检测 要求 关键词关键词 高效液相色谱 牛奶 邻苯二甲酸酯 增塑剂 Determination of Phthalic Acid Esters in Milk by High Performance Liquid Chromatography Xu Xianghua 1 Fang Xiaoming 2 Ding Zhuoping 1 Tao Ningping 1 1College of Food Science and Technology Shanghai Fisheries University Shanghai 200090 2Shanghai Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau Shanghai 200135 Abstract The high performance liquid chromatographic method was developed for the determination of six phthalic acid esters PAEs in milk including BBP DBP DEHP DNOP DINP and DIDP which are banned in 2007 19 EC The PAEs were extracted with methanol and hexane methyl t butyl ether v v 1 1 the fat was removed by cryoapplication Extracts were purified by LLE and silica SPE cartridge Separation was carried on ODS column 250 4 6 mm 5 m coupled with UV detection at 224 nm The linear range was over 0 05 80 g mL for BBP and DBP 0 1 80 g mL for DEHP and DNOP 0 5 80 g mL for DINP and DIDP r2 0 998 The detection limits were BBP 0 15 g g DBP 0 1 g g DEHP and DNOP 0 2 g g DINP and DIDP 0 6 g g respectively The assay was validated by analyzing samples spiked with 0 2 1 2 fold of MRL the average recoveries and the relative standard deviations were in the range of 80 7 102 3 and 1 7 9 0 The method is economic accurate and reliable which meets the criteria of European Union Commission Directive 2007 19 EC Keywords High Performance Liquid Chromatography Milk Phthalic Acid Esters Plasticizer 徐向华 男 24岁 硕士生 从事食品营养与安全研究 通讯联系人 E mail zpding 上海市科学技术委员会科研计划项目 06DZ05133 和上海市重点学科建设项目 T1102 资助 2008 03 18收稿 2008 04 17接受 http www hxtb org 化学通报 在线预览版 2 邻苯二甲酸酯 PAEs 是塑料工业中常用的增塑剂 其含量最高可达聚合物本体的 60 用来 增加塑料的可塑性和韧性 1 但 PAEs 是一类内分泌干扰物质 具有雌激素活性 2 3 我国将这类物 质归为 环境激素类污染物 4 PAEs 有生殖毒性 胚胎毒性和遗传毒性 5 同时具有 三致 作 用 高剂量的邻苯二甲酸二 2 乙基己基 酯 DEHP 已被确认可引起肝癌 6 PAEs 已成为全球最普 遍的污染物之一 美国国家环保署 EPA 已将 6 种 PAEs 邻苯二甲酸丁苄酯 BBP 邻苯二甲酸 二丁酯 DBP DEHP 邻苯二甲酸二甲酯 DMP 邻苯二甲酸二乙酯 DEP 和邻苯二甲酸二辛酯 DOP 列为优先控制污染物 7 在我国 DMP DBP 和 DOP 也已被列入 中国环境优先污染物黑 名单 8 牛奶中的PAEs残留主要是由在加工 包装过程中接触塑料设备和容器而产生的 此外 在牛奶 采集过程中若采用聚氯乙烯 PVC 软管机械采奶 也导致牛奶中PAEs的浓度比人工法高得多 即使 以人工采奶的方式 生牛奶中仍然可以检出PAEs 欧盟指令2007 19 EC中规定6种PAEs最大残留限 量值 MRL 分别为 BBP 30 mg kg DBP 0 3 mg kg DEHP 1 5 mg kg DNOP DINP和DIDP 9 mg kg 目前 有关牛奶中PAEs测定的报道 国内仅有一篇采用气相色谱法测定奶粉中DEP和DBP的报道 9 但DEP的回收率偏低 国外有采用气相色谱 质谱法 10 和液相色谱 串联质谱法 11 测定的报道 本文采用高效液相色谱法 HPLC 测定牛奶中涉及欧盟指令2007 19 EC中禁止与食品接触的6种 PAEs BBP DBP DEHP 邻苯二甲酸二正辛酯 DNOP 邻苯二甲酸二异壬酯 DINP 和邻苯二 甲酸二异癸酯 DIDP 本方法尽管不如质谱检测法灵敏度高 但可满足欧盟指令中对PAEs残留检测 的要求 本方法所用仪器设备简单 测定结果满意 适合基层实验室推广应用 1 实验部分 实验部分 1 1 仪器与试剂 仪器与试剂 Shimadzu 20A HPLC系统 附自动进样器 柱温箱 紫外检测器SPD 20A Solution化学工作站等 固相萃取 SPE 装置 Supelco公司 硅胶填料的玻璃柱ProElut 500 mg 迪马公司 BBP DBP DEHP DNOP DINP和DIDP购自Sigma公司 甲醇 正己烷 甲基叔丁基醚 乙 酸乙酯 乙腈均为农残级 迪马公司 实验用水为超纯水 Milli Q Millipore公司 PAEs标准 储备液 分别准确称取适量的PAEs标准品 用甲醇配制成1 0 mg mL的标准储备液 4 保存 根 据需要用甲醇将储备液稀释到标准使用浓度 淋洗液 0 7 乙酸乙酯的正己烷溶液 1 2 样品处理 样品处理 1 2 1 样品提取 准确称取2 0 g牛奶样品置于具塞玻璃管中 分别加入2 0 mL甲醇 4 0 mL正己烷 甲基叔丁基醚 v v 1 1 后 涡旋振荡提取1 min 在3000 r min转速下离心2 min 取上清液 再用 4 0 mL正己烷 甲基叔丁基醚 v v 1 1 重复提取1次 合并两次上清液 于45 水浴中氮吹至干 用正己烷定容至 4 0 mL 摇匀 加盖后冷冻30 min 然后在3000 r min转速下离心2 min 取上清液 再用正己烷定容至4 0 mL 混匀 后平分为2份溶液 一份用作BBP DBP的净化 另一份用作DEHP DNOP DINP和DIDP的净化 1 2 2 BBP DBP的净化 分取2 0 mL上节中提取的样液 加入2 0 mL乙腈 涡旋振荡提取1 min 静置分层后弃去正己烷层 再加入1 0 mL正己烷 振荡 分层后弃去正己烷层 乙腈相氮吹至干 用1 0 mL甲醇定容 进样 1 2 3 DEHP DNOP DINP和DIDP的净化 硅胶柱预先用40 mL淋洗液淋洗 以除去柱子填料和 筛板上的本底干扰物 然后用5 0 mL正己烷淋洗 取2 0 mL上节中提取的样液过柱 用3 0 mL淋洗液 淋洗 再用19 mL淋洗液洗脱并收集 于45 水浴中氮吹至干 用1 0 mL甲醇定容 进样 1 3 色谱条件 色谱条件 色谱柱 Platisil ODS柱 250 4 6 mm 5 m 迪马公司 流动相为乙腈 水 v v 99 1 流速 1 0 mL min 柱温30 UV 224 nm 进样量20 L http www hxtb org 化学通报 在线预览版 3 2 结果与讨论 结果与讨论 2 1 固相萃取柱的选择 固相萃取柱的选择 研究了 N 丙基乙二胺 PSA 柱 C18柱和硅胶柱对 4 种 PAEs DEHP DNOP DINP 和 DIDP 萃取效果的影响 发现 PSA 柱对 PAEs 的保留较弱 回收率偏低 C18柱对 PAEs 的保留时间较长 即使用纯甲醇洗脱 也会造成 DINP 和 DIDP 的严重拖尾 而硅胶柱的效果较好 考察了 3 种规格的 填充量 500 1000 和 1500 mg 结果表明 1000 和 1500 mg 填料的小柱洗脱范围过宽 而 500 mg 的填充量比较合适 为确定优化的洗脱范围 硅胶柱经活化后 取2 0 mL上述1 2 1节中的牛奶空白样液 加入适当 标准品使其添加量为2MRL浓度 即BBP 60 g g DBP 0 6 g g DEHP 9 g g DNOP 18 g g DINP 18 g g和DIDP 18 g g 过柱 然后分段收集淋洗液 氮吹至干 用1 0 mL甲醇定容后进样 得到 淋洗曲线图 图1 由图1可见 当淋洗3 0 mL后 4种PAEs开始洗脱出来 在第21 mL时基本洗脱 完全 因此 本文先用3 0 mL淋洗液淋洗 再用19 mL淋洗液洗脱并收集 0 20000 40000 60000 80000 100000 120000 140000 123456912151821242730 淋洗液体积 mL 峰面积 AU DEHP DNOP DINP DIDP 图图1 4种种PAEs的淋洗曲线图 的淋洗曲线图 Fig 1 The elution curve of 4 kinds of PAEs 2 2 色谱条件的选择 色谱条件的选择 考察了不同色谱柱 C8柱 苯基柱和ODS柱 对PAEs分离的影响 发现C8柱对PAEs的保留较弱 且DEHP和DNOP不能有效分离 苯基柱对PAEs的保留更弱 6种组分重叠出峰 而ODS柱能在25 min 内达到基线分离 图3 这是由于PAEs是非极性 疏水性化合物 在非极性固定相中有较强的保留能 力 在上述3种固定相中 ODS是最强的疏水性硅胶键合吸附相 其对非极性化合物有广泛的保留特 性 因此PAEs在ODS柱上的分离度较好 采用乙腈和水作为流动相时 由于ODS柱对PAEs的保留能力强 需用高比例的乙腈才能将6种组 分洗脱出来 本文选择乙腈 水 v v 99 1 作为流动相 若用乙腈比例递增的梯度洗脱 BBP和DBP 出峰会延后 DINP和DIDP的出峰时间过长且拖尾 另外基线漂移对低浓度检测会有干扰 因此本文 采用等度洗脱 http www hxtb org 化学通报 在线预览版 4 图图2 标准品在标准品在C8柱 柱 A 苯基柱 苯基柱 B 和 和ODS柱 柱 C 上的色谱图 柱子均为 上的色谱图 柱子均为250 4 6mm 5 m Fig 2 The chromatograms of standards on C8 PH and ODS column 250 4 6mm 5 m 1 BBP 30 g mL 2 DBP 0 30 g mL 3 DEHP 1 5 g mL 4 DNOP 9 0 g mL 5 DINP 9 0 g mL 6 DIDP 9 0 g mL 2 3 本底的影响 本底的影响 由于PAEs属于环境中普遍存在的环境激素类污染物 为了减少本底的干扰 实验中应使用玻璃 离心管和玻璃吸头的移液器 避免使用塑料容器 溶剂中也会存在本底 有文献报道采用重蒸的方 法 11 纯化试剂 但方法繁琐 为节省时间和避免二次污染 本实验中全部采用高纯的农残级试剂 同时做空白实验 http www hxtb org 化学通报 在线预览版 5 由于硅胶柱在贮藏过程中会吸附环境中微量的PAEs 使用前应预先用足够的淋洗液洗去吸附的 干扰物 实验发现 当淋洗量达到40 mL时 柱中吸附的干扰物可完全消除 2 4 线性范围与检测限 线性范围与检测限 在上述优化的实验条件下 BBP和DBP在0 05 80 g mL DEHP和DNOP在0 1 80 g mL DINP 和DIDP在0 5 80 g mL的质量浓度范围内 峰面积与质量浓度成很好的线性关系 相关系数 r2 均大于0 998 根据3倍信噪比确定的方法检测限为 BBP 0 15 g g DBP 0 1 g g DEHP和DNOP 0 2 g g DINP和DIDP 0 6 g g 2 5 回收率与精密度 回收率与精密度 取适量标准品加入到2 0 g牛奶中 使6种PAEs的添加量相当于0 2 1和2倍MRL的浓度 每个添 加水平各取6个独立样品 按1 2节所述步骤进行处理 考察方法的回收率和相对标准偏差 RSD 结果见表1 加标平均回收率为80 7 102 3 相对标准偏差为1 7 9 0 满足残留检测的要 求 表1 6种PAEs的回收率及精密度 n 6 Tab 1 Recovery and precision of 6 PAEs n 6 化合物 添加水平 g g 回收率 平均回收率 RSD BBP DBP DEHP DNOP DINP DIDP 6 30 60 0 06 0 3 0 6 0 3 1 5 3 1 8 9 18 1 8 9 18 1 8 9 18 86 71 85 47 77 97 82 19 84 29 80 84 81 32 85 61 88 30 86 08 82 82 86 52 86 31 80 29 77 05 85 23 90 30 80 52 76 87 78 00 88 01 92 01 78 40 87 27 77 68 83 78 92 04 84 42 75 96 85 66 94 46 98 38 86 13 87 18 88 49 99 79 88 30 108 80 98 00 90 76 86 78 88 72 87 96 92 73 88 61 86 78 83 77 93 47 98 62 102 45 110 90 90 03 102 88 109 03 78 80 80 89 83 07 81 82 79 45 80 38 88 07 86 86 88 90 89 90 88 65 91 14 91 02 88 55 94 82 80 88 95 42 95 24 79 82 84 34 91 24 81 46 82 07 78 57 82 72 81 81 84 60 86 31 84 02 88 88 92 55 86 48 93 40 81 73 95 98 96 08 82 18 84 27 89 28 81 26 76 07 85 30 87 80 95 02 85 87 87 64 84 56 91 01 87 57 82 50 91 41 79 36 93 35 95 29 82 9 85 1 83 4 83 4 83 2 92 4 93 6 89 0 102 3 80 7 88 9 91 0 82 9 84 7 91 0 83 1 88 7 88 3 3 9 3 0 5 6 7 7 7 0 6 4 9 0 4 1 7 4 1 9 1 7 6 2 5 5 3 0 6 3 5 3 4 3 7 2 2 6 应用 应用 图 3 为牛奶实际样品的色谱图 由图 3 可见 样品经液液萃取和固相萃取净化后 基体对被测 组分没有干扰 测得样品中含有 DBP 和 DEHP 采用外标法定量 DBP 和 DEHP 的含量分别为 0 27 g g 和 0 80 g g http www hx