有机磷诱导拟南芥差异蛋白表达及其对酯酶同工酶活性的抑制(修改稿).doc

有机磷诱导拟南芥差异蛋白表达及其对酯酶同工酶活性的抑制(修改稿) 有机磷诱导拟南芥差异蛋白表达及其对酯酶同功酶活性的抑制丛靖宇1#，高仙灵1#，朱宏2，万东莉1，李国婧1，张镝3，杜红1，王瑞刚11内蒙古农业大学生命科学学院，内蒙古呼和浩特0100182哈尔滨师范大学生命科学学院哈尔滨1500803内蒙古农牧科学院分析测试中心，内蒙古呼和浩特010000摘要研究植物响应Ops的分子机理对于建立有机磷生物修复技术具有重大的理论意义和实践价值。 以拟南芥为例，研究了有机磷胁迫下酯酶同功酶及其可溶性总蛋白的响应。 结果表明，有机磷明显抑制了植物的生长发育，并可通过根部吸收的方式迅速进入拟南芥体内，通过抑制酯酶同功酶活性对植物造成胁迫。 同时，发现在拟南芥体内存在1个有机磷诱导下的差异表达蛋白，该蛋白与1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（RuBisCO）大亚基高度同源。 关键词拟南芥；有机磷；酯酶同功酶；差异表达蛋白可溶性总蛋白X5文章标识码A*Organophosphorus Pesticides(Ops)Operate toArabidopsis Thalianaby theDifferent ExpressionProtein andInhibiting theActivity ofEsterase IsoenzymesCong JingYu1#,Gao XianLing1#,Zhu Hong2#,Wan DongLi1,Li GuoJing1,Zhang Di3,Du Hong1,Wang RuiGang1*1College ofLife Sciences,Inner MongoliaAgricultural University,Huhhot010018,China;2College ofLife Sciences,Harbin NormalUniversity,Harbin,150080,China3Center forTesting andAnalysis,Inner MongolianAcademy ofFarming andAnimal HusbandryScience,Huhhot010000,China;Abstract:Plants cantolerate oreven degradeorganophosphorus(OPs),yet withlittle knownabout themechanisms.Employing Arabidopsis thaliana,a modelplant,the responsesof theesterase isozymesand thetotal solubleproteins to OPs stresshave beenstudied.The resultsshowed thatOPs couldbe uptookeby Arabidopsis thaliana rootsrapidly intothe plant,repressed theactivity of esterase isoenzymewithout reductionin theenzyme content,promoted theproduction ofone differentprotien highlyhomologous tothe large-subunit sequenceof itsown ribulose-1,5-bisphophate*基金项目内蒙古自然科学基金资助项目（ xx08010503、xx11020515）和教育部回国留学人员启动基金 （xx）联合资助#第一作者丛靖宇（1974-），讲师、在读博士，E-mailcongjingyuwyh163.；高仙灵（1982-），在读硕士，E-mailswhxgcxy163.*通讯作者王瑞刚（1972-），博士、教授，E-mailwangruigangyahoo.。 carboxylase/oxygenase(RuBisCO)and finally,markedly inhibitedthe plantdevelopment.Also,the negativeeffects of OPs onthe plantenhanced withthe increaseofOPsamount andtreating time.This stronglysuggested thatesterase bably wasthe targetenzyme ofOPs,like inanimal,and thedifferent expressionprotein mayalso beinvolved inthe responsetoOPs.Key words:Arabidopsis thaliana；Organophosphorus Pesticides(Ops)；Esterase isozyme；Different expressionprotein;Total solubleprotei n有机磷农药（organophosphorus pesticides，OPs）作为高效、广谱杀虫剂在农业生产中有着广泛应用。 然而，OPs在为农业生产提供了高效杀虫性能的同时，也带来了严重的负面影响1-2。 随着人类生活质量的提高和环保意识的增强，OPs的残留和毒害问题已引起人们的普遍关注，并成为关系人类健康和经济发展的重大科技问题。 由于植物是Ops的直接施用对象，因此，研究植物响应Ops的分子机理对于建立有机磷生物修复技术具有重大的理论意义和实践价值。 研究表明，酯酶同功酶是动物的有机磷作用靶酶3，而植物的有机磷作用靶酶尚不清楚。 本文通过研究有机磷胁迫下拟南芥酯酶同功酶及其可溶性总蛋白的响应，试图阐明植物酯酶同功酶与有机磷胁迫的关系，明确除酯酶同功酶以外，在植物体内还存在与有机磷胁迫有关的其他分子，从而为阐明植物耐受有机磷的分子机理和建立有机磷植物修复途径提供依据。 1材料与方法1.1试验材料植物材料为野生型Columbia生态型拟南芥（Arabidopsis thaliana）。 有机磷试剂为市售15%甲基对硫磷乳油。 1.2植物培养1.2.1种子处理用70%乙醇和含0.05%Tween-20的无水乙醇分别对种子灭菌10分钟，在1.5ml无菌EP管中，加入1ml无菌水，4春化3天。 1.2.2拌毒蛭石培养取3份蛭石，每份0.37kg。 将甲基对硫磷乳油稀释100倍，分别吸取0ml、2.5ml和12.5ml，用等量蒸馏水补足体积，拌毒，使有机磷浓度分别为0g/kg、0.01g/kg和0.05g/kg。 每处理均分三份，作为三个重复。 分别接种20粒春化3天的拟南芥种子。 1.2.3有机磷灌根处理在装满蛭石的培养钵中接种6粒春化3天的拟南芥种子，置于25、12h光照/12h黑暗的条件下，培养2周后，保留2个壮苗作为试验材料。 为减少蒸发造成的误差，用保鲜膜封闭培养钵口（图1）。 图1用于有机磷灌根处理的拟南芥Fig.1Arabidopsis thalianaseedling usedfor thetreatment of the rootswith organophosphatesolution将0.2g/l的甲基对硫磷浇入培养钵底座，使有机磷溶液浸润至培养基质。 以处理0h为对照，分别在处理后2h、4h、8h、12h、24h、48h和72h取叶片，于1.5mlEP管中液氮速冻，-80保存，用于酯酶同功酶分析。 1.2.4水培处理培养皿中加入25ml1/2MS无菌培养液，均匀撒入春化3天的种子25粒，置于25、16h光照/8h黑暗条件下，培养2周。 加入甲基对硫磷稀释液，使最终有机磷浓度分别为0g/l、0.10g/l和0.20g/l。 以处理0h为对照，在处理后2h、4h、8h、12h和24h取完整植株，用蒸馏水冲洗数次，吸干植株表面水分，于1.5mlEP管中液氮速冻，-80保存，用于可溶性总蛋白分析。 1.3酯酶同功酶和可溶性总蛋白分析1.3.1酯酶同功酶和可溶性总蛋白的提取用pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液提取拟南芥植物组织中的蛋白质，用于酯酶同功酶和可溶性总蛋白分析。 1.3.2拟南芥总蛋白质定量采用考马斯亮蓝法（Bradford法）4。 1.3.3酯酶同功酶分析非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（native polyacrylamidegel electrophoresis，Native-PAGE）51.3.4可溶性总蛋白分析十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecylsulfate polyacrylamidegel electrophoresis，SDS-PAGE）61.4差异蛋白的肽质指纹分析由北京华大蛋白质研发中心进行（Peptide MassFingerprint，PMF）。 2结果分析2.1有机磷对拟南芥生长发育的影响有机磷处理后，拟南芥的生长明显受到影响。 从甲基对硫磷拌毒蛭石培养来看，拟南芥的生长缓慢，茎细弱，叶片呈黄绿色。 在培养30天后，对照的拟南芥已长至6-8片真叶，而生长于0.01g/kg和0.05g/kg甲基对硫磷拌毒蛭石上的拟南芥只长至4-6片真叶和3-5片真叶（图2）。 这说明甲基对硫磷的浓度越大对拟南芥的生长抑制越明显，对拟南芥的生长的胁迫作用越大。 空白对照0.01g?kg甲基对硫磷处理0.05g?kg甲基对硫磷处理图2拟南芥在甲基对硫磷拌毒蛭石上的生长情况Fig2Growth ofArabidopsis thalianacultured onthe vermiculitetreated withmethyl parathion-1-12.2拟南芥酯酶同功酶对有机磷的响应以0.2g/l甲基对硫磷溶液对拟南芥进行灌根处理，取拟南芥叶片作为酯酶同功酶分析的试验材料。 结果表明，对照出现了9条酯酶同功酶谱带，其中第 1、 3、4号为强带，第 5、6号为次强带，第 2、 7、 8、9号为弱带。 甲基对硫磷处理2h后，第1-5号酶带强度已大被减弱，第 1、3和4号酶带呈现为弱带，第 6、8号酶带消失（图3）。 从图中还可以看出在灌根处理的2-72h期间，1-9号酶带强度呈递变趋势，随处理时间的延长而逐渐变弱。 其中，第6号和第8号酶带在处理2h后消失，第 4、5和第9号酶带在处理4h后消失，第3号酶带在处理8h后消失，在处理72h后，第1号和第2号酶带呈弱带，第7号酶带消失。 酶带编号12340h2h4h8h12h24h48h72h567890.20g?l-1甲基对硫磷灌根处理图2甲基对硫磷处理的拟南芥酯酶同功酶电泳图谱Fig.2The pictureof electrophoresisofesteraseisozyme inArabidopsisthalianatreated bymethyl parathion2.3拟南芥可溶性总蛋白对有机磷的响应以0.10g/l和0.20g/l甲基对硫磷处理的水培拟南芥作为试验材料，进行可溶性总蛋白的SDS-PAGE，获得了有机磷胁迫下的拟南芥可溶性总蛋白电泳图谱（图4）。 从中可见，在拟南芥SDS-PAGE的标志性蛋白谱带1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase，通常简写为RuBisCO，E.C.9）大亚基（分子量53.4KD）（白色箭头所示）的下方产生1个差异表达蛋白（黑色箭头所示）。 在0.10g/l甲基对硫磷处理下，24h后可检测到该差异表达蛋白；而在0.20g/l甲基对硫磷的处理下，2h后即可检测到该差异表达蛋白，且在处理后的4-24h该差异表达蛋白的表达量有逐渐增加的趋势。 与此同时，似乎可见RuBisCO大亚基有随处理时间的延长而逐渐减少的趋势。 0h2h4h8h12h24h0h2h4h8h12h24h0.10g?l-1甲基对硫磷处理0.20g?l-1甲基对硫磷处理图4甲基对硫磷胁迫下的拟南芥可溶性总蛋白SDS-PAGE图谱Fig.4The pictureof SDS-PAGE oftotal solubleprotein inArabidopsisthalianatreated bymethyl parathion为了了解该差异表达蛋白的性质，将差异蛋白经脱水、还原、烷基化和胰蛋白酶（Trypsin）酶解等处理，制备为分析样品，通过Bruker AutoflexMALDI-TOF-MS质谱仪，获得肽质指纹图谱，结果如图5所示。 同时，利用.matrixscience.提供的Mascot软件，将此蛋白在拟南芥数据库（Arabidopsis060317）中查询，结果如图6所示。 图5差异蛋白的部分肽质指纹图谱Fig.5Part ofthe peptide mass fingerprinting of differential protein图6可见，该差异蛋白的肽质指纹图谱结果非常可信。 拟南芥数据库检索结果显示，该差异蛋白与1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶大亚基（Ribulose-1,5-bisphosphate Gi|7525041）高度同源。 carboxylase/oxygenase largechain，图6差异蛋白的肽质指纹图谱结果的评估图Fig.6The appraisalfor theresult ofpeptidemassfingerprintingofdifferentialprotein3结论讨论3.1有机磷对拟南芥生长发育的抑制作用。 从实验结果（图2）可以看出，0.01g/kg甲基对硫磷对拟南芥已造成胁迫，明显抑制了拟南芥的生长发育。 而且0.05g/kg的甲基对硫磷对拟南芥的生长发育的抑制更为显著。 这说明有机磷的浓度越大对拟南芥的生长发育抑制越明显，对拟南芥的生长的胁迫作用越大。 3.2有机磷进入拟南芥体内，选择性地抑制酯酶同功酶的活性。 从上述结果可以看出，有机磷处理已经对拟南芥的生长发育造成了胁迫。 那么植物是如何响应有机磷胁迫或是参与有机磷代谢的呢？有机磷的毒理学分析表明，有机磷在动物体内与胆碱酯酶形成磷酸化胆碱酯酶，从而抑制胆碱酯酶的活性，使其不能分解乙酰胆碱，致使组织中乙酰胆碱过量积累，造成胆碱能神经过度兴奋，引起毒蕈碱样、烟碱样和中枢神经系统症状3。 由此可知动物中的酯酶同功酶是有机磷的作用靶酶，那么植物中的酯酶同功酶的作用如何？是否也是有机磷的作用靶酶呢？拟南芥酯酶同功酶分析结果表明，有机磷处理后酯酶同工酶合成没有受到影响，酯酶活性明显降低甚至消失，这说明有机磷是通过抑制酯酶活性对植物造成胁迫的。 同时我们可以看出不同酯酶的活性被抑制的程度有所不同，表现为对照共有9条酯酶同功酶谱带，而经甲基对硫磷处理后的2-72h，1-9号酶带强度呈递变趋势，并随处理时间的延长而逐渐变弱，而酯酶活性的变化程度不同 1、 3、 4、 5、 6、8号酶带活性在较短的处理时间内均被明显减弱；而 2、7和9号酶带活性变化相对较弱，这说明有机磷对拟南芥酯酶同功酶活性的抑制具有选择性。 3.3有机磷胁迫下，拟南芥产生差异表达蛋白的表达水平与有机磷处理浓度和时间成正相关关系。 为了了解植物中是否还存在与有机磷有关的其他蛋白质，本实验研究了甲基对硫磷胁迫下的拟南芥可溶性总蛋白。 对甲基对硫磷胁迫下的拟南芥可溶性总蛋白进行SDS-PAGE检测后，发现了1个差异表达蛋白。 这说明，拟南芥中可溶性总蛋白中的某一种蛋白质对有机磷胁迫产生了响应，其应答机制是产生差异表达蛋白。 通过肽质指纹分析，确定该差异表达蛋白与1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（RuBisCO）大亚基高度同源。 从甲基对硫磷胁迫下的拟南芥可溶性总蛋白SDS-PAGE图谱可以看出，在0.10g/l甲基对硫磷处理浓度下，该差异蛋白条带仅出现在处理24h的样品中，而在0.20g/l甲基对硫磷处理浓度下，该差异蛋白条带在处理2h的样品中就已出现，且在处理4-24h的样品中该差异蛋白条带有逐渐变大的趋势，而RuBisCO大亚基条带却有逐渐减弱的趋势。 这说明，有机磷胁迫越严重，该差异蛋白响应得就越迅速，从而使拟南芥能较好的耐受有机磷的胁迫；并且该差异蛋白可能与RuBisCO大亚基系同源蛋白，只是被有机磷胁迫诱导而产生响应。 同时肽质指纹分析发现此差异蛋白与1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（RuBisCO）大亚基高度同源，这也说明该差异蛋白可能与RuBisCO大亚基属同系物而且在抵抗逆境胁迫方面具有相同的功能。 RuBisCO约占植物可溶性蛋白总量的50%，是自然界中最丰富的蛋白质。 RuBisCO是所有光合生物进行光合碳同化的关键性酶，催化光合作用卡尔文循环的第1步CO2的固定即羧化反应；RuBisCO还是一个双功能酶，在参与光合作用的同时还参与光呼吸作用过程，既催化羧化反应，又催化加氧反应，并且调节两者之间的关系；高等植物的RuBisCO是由8个大亚基和8个小亚基所构成的，其催化活性要依靠大、小亚基的共同存在才能实现；RuBisCO全酶由细胞质中合成的小亚基前体和叶绿体中合成的大亚基前体经修饰后组装而成，其活性中心位于大亚基上，而不在小亚基上7-9。 霍晨敏等10分析了1%NaCl胁迫72h的一对小麦耐盐（RH8706249）及敏盐突变体（H8706234）的蛋白质组，发现在对照组中，耐盐突变体的RuBisCO小亚基表达量与敏盐突变体无明显差别，在盐胁迫72h后，耐盐突变体中RuBisCO小亚基的含量无变化，而敏盐突变体中此蛋白的量下降至不能检测到的水平，因此作者认为RuBisCO小亚基的稳定表达很可能对于提高耐盐植物的耐盐性有着重要作用。 Hajduch等11的研究发现，用铜、镉和汞三种重金属处理水稻叶，其RuBisCO显著减少或断裂为片段，另外还有33个蛋白也发生了明显变化，且这些蛋白的大多数是与RuBisCO蛋白同源的，这表明三类重金属对水稻叶有着高度特异的影响，那就是干扰其光合机制。 夏兰芹等12分析检测了豌豆中与RuBisCO小亚基前体蛋白（preSSU）相互作用并参与其调控的蛋白，结果表明，preSSU通过与相关蛋白的相互作用，似乎参与了植物抗逆信号转导系统，并在植物的生长发育、成熟和衰老过程中起重要作用。 Law等13的研究结果显示，在高温胁迫下，棉花叶中的新蛋白合成很快由主要表达RuBisCO的大、小亚基转变为表达热激蛋白。 Parry等14研究发现，在干旱胁迫下，烟草的RuBisCO活性由于一种紧密结合抑制物的出现而降低。 综上所述，在盐、重金属、高温和干旱胁迫下，RuBisCO都做出了响应，或是改变表达量，或是降低活性，总之都说明RuBisCO在一定程度上参与了植物抗逆反应。 本论文中，拟南芥在甲基对硫磷的胁迫下，产生与RuBisCO大亚基高度同源的差异蛋白，也正是拟南芥对有机磷这种逆境胁迫的响应。 此外，在甲基对硫磷拌毒蛭石上（图2），野生型拟南芥生长情况优于0.01g/kg甲基对硫磷处理，而0.01g/kg甲基对硫磷处理又优于0.05g/kg甲基对硫磷处理，这个现象似乎是和RuBisCO大亚基及差异表达蛋白相关的。 在0.20g/l甲基对硫磷处理2小时RuBisCO大亚基差异表达蛋白就已产生，而在0.10g/l甲基对硫磷处理24小时RuBisCO大亚基差异表达蛋白才产生。 将上述两个方面结合起来可得出甲基对硫磷处理的浓度越高，对拟南芥生长发育的胁迫越强；而有机磷胁迫越强，RuBisCO大亚基高度同源的差异表达蛋白出现的越早而迅速。 也就是说拟南芥受胁迫越强烈，差异表达蛋白对胁迫的响应也越强烈。 至于差异表达蛋白在有机磷胁迫响应中的具体作用以及它是怎样对有机磷进行响应的，该差异表达蛋白的存在机制又是怎样的？这一系列的问题还需要进一步进行研究。 参考文献1Edwards JW,Lee SG,Heath LM,et al.Worker exposureand arisk assessmentof malathionand fenthionused inthe controlof Mediterraneanfruit flyin SouthAustraliaJ.Environ Res,xx,103 (1):38-452De SilvaHJ,Samarawickrema NA,Wickremasinghe AR.Oxicity dueto organophosphoruspounds:what aboutchronic exposureJ.Trans RSoc TropMed Hyg,xx,100 (9):803-8063Bajgar J.Complex viewon poisoningwith nerveagents andorganophosphatesJ.Acta Medica(Hradec Kralove),xx,48 (1):3-214Bradford MM.A rapidand 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