吲达帕胺缓释片有关物质测定-论文.pdf

9 6 2 He r a l d o f Me d i c i n e Vo 1 3 4 N o 7 J u l y 2 0 1 5 吲达帕胺 缓释片有关 物质 测定 袁春平 张文芳 梁华娟 吴志权 广东环球制药有限公司 佛山5 2 8 3 0 5 摘要 目的建立两种高效液相色谱法测定吲达帕胺缓释片中的有关物质 方法 方法一 We l c h U l t i ma t e C 柱 2 5 0 mm 4 6 m m 5 m 流动相 水 乙腈 2 丁醇 三 乙胺 十二烷基硫 酸钠溶 液 6 9 0 3 1 0 2 0 1 0 6 用 磷酸调节 p H至3 0 检测波长2 4 0 r t m 流速 1 6 m L r a i n 柱温3 0 进样量2 0 方法二 Wa t e r s S y m me t r y S h i e l d T M C 1 8 柱 1 5 0 m inx 4 6 m m 5 Ix m 流动相 乙腈 四氢呋喃 1 5 g L 三 乙胺溶液 用磷酸调节 p H至2 8 7 2 0 7 3 检测 波长 3 0 5 a m 柱 温 3 0 流速 1 4 m L m i n 进样量 5 0 0 L 结果吲达帕胺与 4 一 氯一 3 氨磺 酰胺 苯 甲酸 杂 质 B在方法一色谱条件下分离良好 4 一 氯一 3 一 氨磺酰胺苯甲酸 杂质B检测限分别为0 0 5 0 0 5 2 Ix g mL 吲达帕胺与杂 质 A在方法二条件下分离良好 杂质 A检测限为 1 0 n g 结论建立的方法简便 准确 专属性好 灵敏度高 可用于测 定吲达帕胺缓释片的有关物质 关键词吲达帕胺 有关物质 4 一 氯 3 一 氨磺酰胺苯甲酸 色谱法 高效液相 中图分类号R 9 8 3 1 R 9 2 7 2 文献标识码B 文章编号1 0 0 4 0 7 8 1 2 0 1 5 0 7 0 9 6 2 0 5 吗l 达帕胺属噻嗪类利尿药 是一种有效 的作用强 的利尿降压药物 该缓释片治疗剂量低 疗效明 显 体内积蓄少 适合高血压患者长期应用 引 为更 好地控制产品质量 将杂质可能带来的安全性隐患降 至最小 本研究建立两种高效液相色谱 H P L C 法测 定吲达帕胺缓释片的有关 物质 方法一采用外标法测 定吲达帕胺缓释片中4 氯 3 氨磺酰胺苯甲酸 起始原 料 加校正因子的主成分 自身对照法测定杂质 B 脱 氢吲达帕胺 主要的降解杂质 并对其他单杂质及总 杂质进行控制 虽然方法一能 良好分离杂质 A 一 亚硝 基 2 甲基吲哚啉 但 由于进样量和检测限的限制 需 建立方法二测定杂质 A 报道如下 1 仪器与试药 1 1 仪器岛津 L C 一 1 0 A T高效液相色谱仪 岛津 L C 2 0 A T高效液相色谱仪 S P D M 2 0 A二极管阵列检测器 A L l 0 4型 M S 1 0 5 D U型电子天平 梅特勒一 托利多仪器 上 海 有限公司 分别为万分之一和十万分之一天平 1 2 试药 吲达帕胺缓 释片 广东环球制药有 限公 司研 制 规 格 每 片 1 5 m g 批 号 1 1 0 3 0 1 1 1 0 3 0 2 1 1 0 3 0 3 吲达 帕胺对 照 品 中国食 品药 品检 定研究 院 批 号 1 0 0 2 5 7 2 0 0 9 0 3 吲达 帕胺 杂 质 B对 照 品 U S P 批号 1 3 3 8 8 1 2 4 氯 3 一 氨磺酰胺苯甲酸 东京 化成工业株式会社 批号 S Q 5 A D E J 吲达 帕胺杂质 A对照品 E P 批号 2 1 乙腈 四氢呋喃 冰醋酸 三 乙胺为色谱纯 超纯水为自 制 其他试剂均为分析纯 收稿日期2 0 1 4 0 8 1 2 修回日期2 0 1 4 1 0 1 9 作者简介袁春平 1 9 6 4 一 男 湖北武汉人 副主任药师 在读博士 研究方向 新药研发 电话 0 7 5 7 2 8 3 8 7 0 5 3 E m a i l y u a n c p 0 6 3 9 s i n a C O IT I 2 方法与结果 2 1 4 一 氯 3 氨磺酰胺苯 甲酸和 杂质 B的测定 方法 一 2 1 1 色谱条件 We l c h U l t i ma t e C 1 8 柱 2 5 0 mm 4 6 m i l l 5 m 流动相 水 乙腈 2 一 丁醇 三 乙 胺 十二烷基硫酸钠溶液 取 十二烷基硫 酸钠 5 g 加 冰醋酸 3 m L 加水 1 0 0 mL 摇 匀 6 9 0 3 1 0 2 0 1 0 6 用磷酸调节 p H至 3 0 检测 波长 2 4 0 a m 流 速1 6 m L ra i n 柱温 3 0 进样量 2 0 2 1 2溶 液 的配制 2 1 2 1 供试品溶液取本品适量研细 取细粉适量 相 当于吲达帕胺 1 5 m g 精密称定 置5 0 m L 量瓶中 加乙 醇适量充分振摇使溶解并稀释至刻度摇匀 离心 精密 量取上清液 2 m L 置 5 m L量瓶中 加流动相稀释至刻 度 摇匀 即得 2 1 2 2 供试品 自身对照溶液精 密量取 供试 品溶液 1 mL 置 1 0 0 mL量瓶 中 加流动相稀释至刻度 摇匀 即得 2 1 2 3 4 一 氯一 3 一 氨磺酰胺苯 甲酸对 照品溶液 取 4 一 氯一 3 一 氨磺酰胺苯甲酸对照品约 1 2 5 mg 精密称定 置 1 0 0 m L 量瓶 中 加 乙醇溶解 并稀 释至 刻度 摇 匀 精 密量取2 m L 置 1 0 0 mL量瓶 中 加 乙醇稀 释至刻度 摇匀 作为贮备溶液 精密量取贮备溶液 2 4 m L 置 1 0 m L 量瓶中 加流动相稀释至刻度 摇匀 即得 2 1 2 4 系统适用性溶液 取杂质B 4 一 氯 3 一 氨磺酰胺苯 甲酸对照品各约 1 2 m g 精密称定 置同一个 1 0 0 m L 量瓶 中 加 乙醇 溶解并 稀释 至刻 度 摇匀 精 密 量取 2 mL 置 1 0 mL量瓶 中 加 乙醇 稀释至刻度 摇 匀 作 为杂质贮备溶液 另取杂质 A对照品约1 2 m g 精密 称定 置1 0 0 mL 量瓶 中 加乙醇溶解并稀释至刻度 摇 医药导报2 0 1 5 年 7 月第3 4 卷第 7期 9 6 3 匀 作为杂质 A贮备溶液 精密称取吲达帕胺对照品 约 3 m g 置 1 0 m L量瓶中 加 乙醇溶解并稀释至刻度 摇匀 精密量取2 mL 置 5 m L量 瓶 中 加 流动相稀释 至刻度 摇匀 作为吲达帕胺对照品贮备溶液 分别精 密量取杂质贮备溶液 2 4 mL 杂质 A贮备溶液 1 mL 吲达帕胺对照品贮备溶液 1 m L 置同一个1 0 m L 量瓶 中 加流动相稀释至刻度 摇匀 即得 2 1 2 5 空白 辅料溶液取处方 比例 的空 白辅料适量 精密称定 加乙醇适量充分振摇使溶解并稀释至刻度 摇匀 离心 取上清液 2 mL加流动相稀释至 5 m L 摇 匀 即得 2 1 2 6 空白溶剂取乙醇 2 m L 置 5 m L量瓶 中 加流 动相稀释至刻度 摇匀 即得 O 5 1 O 1 5 2 0 t rai n A 2 1 3 专属性实验精密量取系统适用性溶液 空 白 溶剂 4 一 氯一 3 氨磺酰胺苯 甲酸对照品溶液 空 白辅料溶 液 供试品溶液和自身对照溶液各2 O 注入液相色 谱仪 空白溶剂及空白辅料溶液对有关物质检查无干 扰 吲达帕胺与已知杂质 4 氯 3 氨磺酰胺苯甲酸峰 杂质 A 杂质 B分离情况 良好 见图 1 2 1 4 破坏性实验取本品研碎 取细粉适量 相当于 吲达帕胺 1 5 mg 精密称定 分别通过加入 5 m o l L 盐酸溶液水浴 2 0 mi n 破坏后加碱 中和至 中性 加入 5 m o l L 氢氧化钠溶液室温放置 1 4 h 破坏后加酸中 和至中性 加入 3 0 过氧化氢溶液室温放置 8 h 紫外 灯 2 0 0 w h m 2 下 1 4 d 和水浴2 4 h的方式进 行酸 陛 碱性 氧化 光照和高温破坏性实验 结果见图 O 5 1 O 1 5 2 0 t mi n C 0 5 1 0 1 5 2 0 0 5 1 0 1 5 2 0 t mi n t ra i n E F A 系统适用性溶液 B 空白溶剂 c 4 一 氯 3 氨磺酰胺苯甲酸对照品溶液 D 空白辅料溶液 E 供试品溶液 F 供试品自身对照溶 液 1 4 一 氯 3 氨磺酰胺苯 甲酸 2 吲达 帕胺 3 杂质 A 4 杂质 B 图 1 6种溶液 HP L C色谱 图 2 4 I I I O 1 O 2 O 3 0 4 0 0 1 0 t ra i n A 3 4 uL J 2 4 r 一 一 2 O 3 O 4 0 0 1 O 2 O 3 O 4 0 t rai n t mi n B C 0 1 0 2 O 3 0 4 0 0 1 0 2 0 3 0 4 O t mi n t mm D E A 高温破坏 B光照破坏 c 碱破坏 D 强氧化破坏 E 强酸破坏 1 4 氯 3 一 氨磺酰胺苯甲酸 2 吲达帕胺 3 杂质A 4 杂质 B 图2 强破坏实验 I I P L C图 方法一 9 6 4 He r a l d o f Me d i c i n e Vo 1 3 4 N o 7 J u l y 2 0 1 5 2 吲达帕胺与各种破坏条件下产生的杂质分离情况良 好 二极管阵列检测器对吲达帕胺主峰进行峰纯度分 析 纯度因子均在阈值限度之内 显示主峰为单一物质 2 1 5 线性关系考察及校正因子的测定取吲达帕 胺 杂质 B和4 氯一 3 氨磺酰胺苯甲酸峰对照品各适量 精密称定 分别用流动相依次稀释制成浓度为1 7 9 0 0 0 3 0 p g mL 1 0 0 5 0 0 3 8 峭 mL 1 1 7 8 0 0 0 7 la g m L 的6 个系列溶液 精密量取2 0 注入 色谱仪 记录峰面积 以浓度为横坐标 峰面积为纵 坐标 y 绘制标准曲线 以两条线性方程的斜率计算杂 质B相对于吲达帕胺的校正因子 为验证校正因子的 准确性 改变实验仪器 日期 实验人员 照上述方法重 复实验 由两次实验可知 杂质 B相对于吲达帕胺的校 正因子 为0 7 4 氯 3 氨磺酰胺苯甲酸的线性方程为 Y 3 4 6 61 X 2 4 2 2 8 r 0 9 9 9 9 2 1 6 重复性实验取 同一批样 品 批号 1 3 0 1 0 1 6 份 精密称定 照 2 1 2 项方法分别制成供试品溶液和 自 身对照溶液 在上述色谱条件下测定 供试品中均未 检出 4 氯 3 氨 磺酰 胺苯 甲酸 杂质 B的平 均含量 为 0 1 4 R S D为 0 8 1 6 2 1 7 中间精密度实验精密称取同一批样品 批 号 1 3 0 1 0 1 6份 改 变 分 析 日期 人 员 设 备 照 2 1 2 项下方法平行制成供试品溶液和 自身对照溶 液 在上述色谱条件 下测定 供试 品 中均未 检 出 4 一 氯 3 一 氨磺酰胺苯甲酸 结合重复性实验结果计算 杂质 B的平均含量为 0 1 4 R S D为 1 0 0 n 1 2 2 1 8 定量 限和检测 限 取 杂质 B 吲达 帕胺及 4 一 氯 3 一 氨磺酰胺苯甲酸对照品各适量 精密称定 加乙醇 溶解并稀释制成较浓的贮备液 再用流动相逐级稀释 后进样 分别按 1 0 倍和 3 倍的信噪比计算其定量限和 检测限 吲达帕胺 杂质 B 4 一 氯 3 一 氨磺酰胺苯甲酸的 检测 限分 别 是 0 2 0 0 5 2 0 0 5 n g 定量 限分 别是 0 58 1 4 9 0 1 4 n g 2 1 9 稳定性实验取 2 1 2 项下供试 品溶液 室 温放置 7 d 分别于 0 2 4 6 h和第 2 3 4 5 6 7天时 进样 2 0 记录色谱图 结果供试品中均未检出4 一 氯 3 一 氨磺酰胺苯甲酸 杂质 B峰面积的 R S D为 1 3 1 表明供试 品溶液在室温放置 7 d稳定 2 1 1 0 加样 回收率实验 取 同一批样 品 批号 1 1 0 3 0 1 适量 约相当于吲达帕胺 1 5 m g 9 份 精密称 定 分加精密加入杂质 B贮备液3 6 9 m L 各浓度平行 操作 3 份 照 2 1 2 项方法制备供试品溶液 照上述色 谱条件进样测定 记录峰面积 平均回收率为 1 0 0 7 R S D 0 7 2 n 9 另取4 一 氯一 3 一 氨磺酰胺苯甲酸储备 液 同法操作 记录峰面积 平均回收率为9 7 6 R S D 1 2 4 n 9 表明本方法准确性 良好 2 1 U 外标法和加校正 因子 的主成分 自身对 照法分 别测定杂质 B的含量取不 同批次样品 分别采用杂 质 B对照品外标法和加校正因子的主成分 自身对照法 进行杂质 B含量检查 2种测定方式 的结果差异无统 计学意义 见表 1 表 1 吲达帕胺缓释片中杂质 B测定结果 方法一 2 2 杂质 A的测定 方法二 2 2 1色谱条 件Wa t e r s S y m m e t r y S h i e l d T M C 8 柱 1 5 0 m inx 4 6 IT U T I 5 m 以乙腈 四氢呋喃一 1 5 g L 三乙胺溶液 用磷酸调节 p H至 2 8 7 2 0 7 3 为 流 动 相 检 测 波 长 3 0 5 n m 柱 温 3 0 流 速 1 4 m L m i n 进样量5 0 0 L 2 2 2 溶液的配制 2 2 2 1 空白溶剂取 乙腈 5 mL 置 1 0 m L量瓶 中 加 水稀释至刻度 摇匀 即得 2 2 2 2 空白辅料溶液称取处方 比例的空 白辅料适量 相当于主药量 2 5 mg 精密称定 置 2 5 m L量瓶 中 精 密加 乙腈 2 0 mL 充分 摇匀 离 心 精 密量 取上 清 液 4 mL 置 1 0 m L量瓶 中 加水稀释至刻度 摇匀 即得 2 2 2 3 供试品溶液取本 品细粉适量 相 当于吲达 帕 胺 2 5 m g 精密称定 置 2 5 m L量瓶 中 精密加入 乙腈 2 0 m L 密塞 振摇使溶解 离心 取上 清液 即得供试 品贮备溶液 精密量取供试 品贮备溶液 4 m L 置 1 0 m L 量瓶中 加乙腈 1 m L 用水稀释至刻度 摇匀 即 得供试品溶液 2 2 2 4 杂质A对照品溶液取杂质 A对照 品1 2 5 mg 精密称定 置于 1 0 0 m L量瓶 加 乙腈溶解并定量稀 释 制成每毫升中约含 0 1 2 5 g 的溶液 即得杂质 A贮备 溶液 精密量取杂质 A贮备溶液 1 m L 置 1 0 m L量瓶 中 加水稀释至刻度 摇匀 即得杂质 A对照品溶液 2 2 2 5 混合溶液精密量取供试 品贮备溶液 4 m L 杂 质 A贮备溶液 1 mL 置同一个 1 0 m L量瓶 中 加水稀 释至刻度 摇匀 即得 2 2 3 专属性精密量取 2 2 2 项下的空白溶剂 空 白辅料溶液 供试品溶液 混合溶液 杂质 A对照 品 医药导报 2 0 1 5年7月第 3 4卷第 7 期 9 6 5 溶液各 5 0 0 tx L 注入液相色谱仪 色谱图见图 3 结果 表 明混合溶液 中吲达帕胺峰与杂质 A峰分离度 良好 空 白溶剂 空 白辅料对样品中杂质 A的检查无干扰 2 2 4 强破坏实验取本品细粉适量 分别通过加入 5 m o l L 盐酸溶液水浴 2 0 m i n 破坏后加碱中和至 中 性 加入5 to o l L 氢氧化钠溶液室温放置 1 4 h 破坏后 加酸中和至中性 加人 3 0 过氧化氢溶液室温放置 2 h 紫外灯 z o o w h m 2 下 1 4 d 和水浴2 4 h的方式 进行酸 碱 氧化 光照和加热破坏性实验 结果显示各种 破坏下产生的杂质与吲达帕胺分离良好 见图4 2 2 5线性关 系考察精密量取 2 2 2 项下杂质 A贮备溶液 0 6 0 8 1 0 1 2 1 6 2 0 m L 分别 置 1 0 mL 量瓶 中 加水稀释至刻度 摇匀 制成每毫升中含 杂质 A 0 0 0 7 6 0 0 2 5 2 g的系列浓度对照品溶液 相当于杂质含量 1 5 5 0 g g 分别精密量取 5 0 0 Ix L 注入色谱仪 记录色谱图 以浓度 为横坐 标 峰 面 积 1 为 纵 坐 标 得 线 性 回 归 方 程 Y 51 8 0 3 X 0 0 5 5 4 r 0 9 9 9 9 2 2 6 稳定性实验取 2 2 2 项下的供试品溶液和 混合溶液于室温条件下放置 在0 2 4 8 2 4 h分别进 样测定 记录色谱图 供试品溶液中均未检出杂质 A 混合溶液中杂质 A峰面积的R S D为 1 5 9 表明供试 品溶液在室温放置 2 4 h稳定 2 2 7精密度实验取 2 2 2 项下 的供试品溶液 和混合溶液 重复进样 6 次 供试品溶液中均未检出杂 质 A 混合溶液中杂质 A峰面积 的 R S D为 1 4 8 改 变分析 日期 人员 设备 同法测定 计算得杂质 A峰 面积的 R S D为 1 6 7 0 1 O 2 O 3 O 4 0 0 1 0 2 0 3 0 40 0 1 0 2 0 3 0 4 0 t mi n t mi n t mi n A B C O 1 0 2 O 3 0 40 0 1 0 2 0 3 0 40 t mi n t mi n D E A 空白溶剂 B 空白辅料溶液 c 杂质 A对照品溶液 D 供试品溶液 E 混合溶液 1 杂质 A 2 吲达帕胺 图3 空白溶剂 空白辅料 杂质 A对照品 供试品和混合溶液的I t P L C图 O 5 1 0 1 5 2 0 2 5 O 5 1 0 l 5 2 0 2 5 0 5 1 O 1 5 2 0 2 5 t mi n t mi n t m i n A B C 0 5 l O l 5 2 0 2 5 0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 t mi n t m i n D E A 强氧化破坏 B 高温破坏 C 强酸破坏 D 碱破坏 E 光照破坏 1 杂质 A 2 吲达帕胺 图4 强破坏实验 I I P L C图 方法二 J t J J 一 9 6 6 He r a l d o f Me d i c i n e Vo 1 3 4 No 7 J u l y 2 0 1 5 2 2 8 定量限和检测限取 2 2 2 项下的杂质 A对 照品溶液 采用逐步稀释法 分别按 1 0 倍和3 倍的信噪比 计算其定量限和检测限 杂质A的定量限为3 0 n g 检测 限为 1 0 n g 2 2 9 样 品测定 取 中试 3批 吲达 帕胺 缓释片 批 号 1 1 0 3 0 1 1 1 0 3 0 2 1 1 0 3 0 3 考察长期稳定性实验中 杂质 A的含量变化 结果见表 2 表2 吲达帕胺缓释片中杂质 A含量测定结果 方法二 I L g g一 3讨 论 本实验考察 中华人民共和国药典 2 0 1 0年版 C P 2 0 1 0 吲达帕胺片标准 有关物质测定的色谱条 件 流动相为 甲醇一 水一 醋酸 4 5 5 5 0 1 时不能有效 分离 已知杂质 4 一 氯一 3 磺 酰胺苯 甲酸 经考察 英 国 药典 2 0 1 0版 B P 2 0 1 0 吲达帕胺片标准 有关物质 的流动相 水 乙腈 2 丁醇一 三 乙胺 十二烷基 硫酸钠溶 液 6 9 0 3 1 0 2 0 1 0 6 能有效分离 自研制剂的杂 质和各种破坏条件下产生 的杂质 国内外药典标准 中吲达帕胺制剂有关物质检测的 供试 品处理方法 主要有两种 一是缓 释片研 细混匀后 取细粉溶解 二是直接取整 片溶解 振摇 2 h 本品经 两种方式处理后 的检验结果无 明显差异 鉴 于本 品为 高分子材料骨架缓释片 取整片振摇需时长 增加杂质 增长 的风险 因此选择第一种处理方法 B P 2 0 1 0版采用杂质对照 品外标法测定杂质 B含 量 由于杂质 B对照品昂贵且不易获得 本 实验采用 加校正因子的主成分 自身对照法测定 方法准确可行 B P 2 0 1 0版仅在 吲达帕胺原料 中控制杂质 A的限 度 5 g g 制剂 中并无控制 在 自研 吲达帕胺缓 释片稳定性研究过程 中发现杂质 A的含量 随储存时间 延长有所增加 故建立制剂 中杂质 A的检测方法并进 行方法学验证 对其安全性进行控制 方法一中虽然 能检测到杂质 A 但 由于 自研制剂 中只有微量杂质 A 受方法一的进样量和检测波长 2 4 0 n m非最大吸收波 长 的限制 杂质 A的内控限度上限值 5 0 g g 在 方法一的测定条件下不