临床免疫学检验技术.ppt

临床免疫学检验技术 江西省胸科医院 熊国亮 一 概述 免疫学检验是研究免疫学技术及其在医学检验领域应用的一门学科 免疫检验技术则重点阐述各类免疫学技术的基本原理 方法类型和临床应用 19世纪末相继建立了凝集试验 沉淀试验和补体结合试验等三大经典血清学试验 用于检测病原微生物的抗原或抗体对传染病的诊断起到重要作用 一 概述 随着免疫学理论和实验技术的发展 放射免疫技术 荧光免疫技术 酶免疫技术 化学发光免疫技术 流式细胞免疫分析技术等免疫标记技术应用于临床免疫学检验 加快了免疫学检验的自动化 标准化进程 极大地提高了免疫学检验的灵敏度 拓展了免疫学检测范围 从检测免疫相关物质 抗原 抗体 补体 免疫活性细胞和细胞因子等 到检测体液中的微量物质 激素 酶 血浆微量蛋白 血药浓度 微量元素等 一 概述 免疫检验技术以其特有的特异性 敏感性和微量 快速 稳定等优势被广泛应用于临床医学 二 免疫检验技术在临床免疫学检验的应用 1 传染病的免疫学检查机体被细菌 病毒 支原体 衣原体 螺旋体等微生物感染后 常可在血清中出现与病原体相对应的特异性抗体 检测这类抗体有助于明确疾病的诊断 血清学诊断 此外 还可以用含有特异性抗体的诊断血清鉴定相应的病原体及有关抗原 为确定传染的病原提供依据 二 免疫检验技术在临床免疫学检验的应用 2 机体天然免疫的检测主要是对各种吞噬细胞如中性粒细胞 NK细胞 单核巨噬细胞的功能进行检测以及检测在机体组织损伤 局部缺血 急性感染与炎症反应时升高的血浆蛋白 如C反应性蛋白 血浆中CRP浓度在急性心肌梗死 创伤 感染 炎症 外科手术 肿瘤浸润时迅速显著地增高 可达正常水平的2000倍 CRP是引发心脏病的最强烈的危险因素 二 免疫检验技术在临床免疫学检验的应用 3 免疫球蛋白 循环免疫复合物和补体的测定包括测定五类免疫球蛋白的含量 血清总补体活性及补体成分的含量和在多种疾病时血清中升高的循环免疫复合物 二 免疫检验技术在临床免疫学检验的应用 4 细胞免疫相关指标测定检测淋巴细胞亚群和淋巴细胞的功能以及白细胞介素 2等多种细胞因子 用于判断机体细胞免疫功能状况 二 免疫检验技术在临床免疫学检验的应用 5 自身抗体测定机体在发生自身免疫性疾病时 常可出现各自身抗体 用免疫学方法检测这些抗体 可为自身免疫性病的诊断 疾病状态判断和疗效监测提供依据 二 免疫检验技术在临床免疫学检验的应用 6 肿瘤标志物测定免疫学方法定性或定量检测在肿瘤发生和增殖过程中由肿瘤细胞合成 释放或机体对肿瘤反应产生的一些生化物质 对肿瘤的筛查 鉴别诊断 治疗后病情监测及预后判断均有重要意义 三 酶联免疫吸附试验 enzyme linkedimmunosorbentassay ELISA 原理 酶联免疫吸附试验是免疫酶技术固相酶免疫测定的一种技术 是将待测抗原或抗体先固定于固相载体表面 再用酶标记的抗原或抗体与已被固定的相应抗体或抗原发生特异性反应 加入酶底物及色原后呈色 呈色程度用吸光度 A 值表示 所测A值与待测抗体或抗原的水平呈相关关系 三 酶联免疫吸附试验 enzyme linkedimmunosorbentassay ELISA 此法常用多孔聚苯乙烯反应板作为固相载体 读取结果需用酶标仪 标记抗原或抗体所用的酶常选择辣根过氧化物酶 HRP 碱性磷酸酶 AP 等 HRP常用的底物有邻苯二胺 OPD 或四甲基联苯胺 TMB 碱性磷酸酶一般采用对硝基苯磷酸酯 P NPP 作为底物 产物为黄色的对硝基酚 在405nm波长处有最高吸收峰 三 酶联免疫吸附试验 enzyme linkedimmunosorbentassay ELISA 根椐方法和步骤不同可分为以下几种基本反应模式 1 间接法是检测样本中特异性抗体最常用的方法 将已知特异性抗原包被于固相载体上 加待检样本 若其中含特异性抗体则与固相抗原结合形成抗原 抗体复合物 洗弃未反应的成分 加酶标记抗抗体 一般为酶标记抗人IgG或葡萄球菌A蛋白 使在固相载体上形成抗原 待检抗体 标记抗体 或SPA 复合物 洗弃未反应的成分 加酶底物 终止反应后 在一定波长下用酶标仪测吸光度 A 值判定待测抗体的有无或含量 间接法的优点是制备一种酶标记抗抗体 或SPA 只需更换不同的固相抗原 便可检测多种抗体 如HCV IgG抗体的检测 三 酶联免疫吸附试验 enzyme linkedimmunosorbentassay ELISA 2 夹心法夹心法有双抗体夹心法 测抗原 和双抗原夹心法 测抗体 两者试验步骤相同 但包被物 酶结合物和检测对象不同 双抗体夹心法用于检测相对分子质量较大的蛋白质抗原 先将已知特异性抗体包被于固相载体上 加待测样本 若其中有相应的抗原则与固相抗体特异性结合 洗板后加入酶标记特异性抗体 使成包被抗体 待测抗原 酶标抗体复合物 抗原或抗体含量与所测吸光度 A 值呈正相关 如乙型肝炎HBsAg的检测 抗HBs的检测 HBeAg的检测 三 酶联免疫吸附试验 enzyme linkedimmunosorbentassay ELISA 3 竞争法用于检测待检样本中未知抗原或抗体 以测定抗体的竞争法为例 将已知抗体吸附于固相载体 洗涤除去未结合抗体 加特异性抗原与包被抗体形成固相抗原抗体复合物 洗涤除去游离抗原 加标本和酶标抗体 标本中的抗体与酶标抗体竞争结合固相复合物中的抗原 标本中的抗体越多 其竞争力越强 与固相抗原结合的酶标抗体越少 加酶底物显色 有色产物的多少与酶标抗体量成正比 与被测抗体量成反比 如乙型肝炎总抗HBc的检测 抗HBe的检测 三 酶联免疫吸附试验 enzyme linkedimmunosorbentassay ELISA 4 捕获法用于测定特异性IgM类抗体 被检血清中针对某抗原的特异性IgM和IgG常同时存在 为避免IgG的干扰 一般采用捕获法来测定IgM 先将已知特异性抗体 如抗人 链 包被于固相载体上 加待测人血清样本 其中的IgM IgM分子相对于固相抗 链又是一种抗原 被固相抗 链抗体特异性捕获 形成IgM 抗IgM复合物 洗涤除去血清中的其他Ig和杂质 加特异性抗原试剂 该抗原只与固相上的特异性IgM结合 三 酶联免疫吸附试验 enzyme linkedimmunosorbentassay ELISA 洗涤除去未结合的特异性抗原 加入针对特异性抗原的酶标抗体 此酶标抗体只与固相上的特异性抗原结合 洗涤除去未结合酶标抗体 加酶底物反应 色的多少与标本中特异性IgM的量成正比 如甲肝 抗HAV IgM 检测 抗HBc IgM的检测 三 酶联免疫吸附试验 enzyme linkedimmunosorbentassay ELISA 5 生物素 亲合素ELISA avidin biotin peroxi dasecomplex ABC ELISA 是将生物素 biotin 和亲合素 avidin 或链霉亲合素 streptavidin SA 引入ELISA的方法 生物素是一种小分子物质 经活化后可高比度的偶联抗体或抗原等大分子 亲合素 或链霉亲合素 与生物素的结合力极强 一分子亲合素可与4个生物素分子结合 在反应系统中引入生物素和酶标记亲合素 可将ELISA的反应多级放大 显著提高检测方法的敏感性 四 临床免疫室内质控 一 ELISA检测室内质控1 现状 ELISA法检测的影响因素多 多为手工操作 很难标准化 未得到实验室的重视 质控品来源有限或价格因素 操作人员意识不够 有些基层单位不是每天做或者根本没有做 有的不知从何做起 四 临床免疫室内质控 2 质控品的选择 除了试剂盒附带的阴阳性对照以外 实验室还应该选择至少一个弱阳性质控品 接近Cutoff值 S CO值应该为2 4之间 最好是购买商品 四 临床免疫室内质控 3 临界值与弱阳性质控血清不同点 1 临界值血清 实验结果处于 阴 阳性 分界点时的样品中分析物浓度值 低于此值 定性实验的结果为阴性 高于此值 定性实验的结果为阳性 对于定性实验来讲 临界值是唯一的医学决定水平 当样品中被测物浓度处于临界水平时 定性实验重复检查同一样品 将产生50 的阳性结果和50 的阴性结果 当样品浓度在临界值以上增加时 阳性结果比率增加 而当样品浓度在临界值以下减低时 阴性结果比率增加 四 临床免疫室内质控 2 弱阳性质控血清 A 医疗机构临床实验室管理办法 的弱阳性定为S CO 2 4 B用阴性混合血清梯度稀释阳性混合血清 用现用检测系统进行检测所能测出阳性结果的最低浓度 C质控品S CO值 3S 1的最低浓度水平 四 临床免疫室内质控 4 测定频度 每次检测患者样本时至少测定一次室内质控品 ELISA测定每块板都要测定室内质控品 5 质控图绘制 定性测定可采用弱阳性质控品的S CO值作质控图 判定规则为12S 警告限 13S 四 临床免疫室内质控 二 标本量少的定量测定项目的质控方法是 即刻法 质控 Grubs异常值取舍法 1 对于某些不是每天开展的项目 有效期限较短的试剂盒的项目 用上述方法计算获得平均数和标准差有很大的难度 采用Crubbs氏法 只需连续测定3次 即可对第3次检验结果进行检验和控制 具有计算方法如下 四 临床免疫室内质控 A 计算出测定结果 至少3次 的平均值 X 和标准差 S B 计算SI上限值和下限值 SI上限值 X最大值 X SSI下限值 X X最小值 S 四 临床免疫室内质控 C 查表 将SI上限SI下限与SI值表中的数值进行比较 四 临床免疫室内质控 当SI上限和SI下限值 n2s时 表示处于控制范围之内 可以继续进行测定 并重复以上计算 当SI上限和SI下限有一值处于n2s和n3s值之间时 说明该值在2s 3s 四 临床免疫室内质控 范围 处于 警告 状态 当SI上限和SI下限值有一值处于 n3s时说明该值在3s范围以外 属 失控 数字处于 警告 和 失控 状态应舍去 重新测定该项目质控品和病人样本 舍去的只是失控的这次数值 其它次测定值仍可继续使用 当检测的数字超过20次以后 可转入使用常规的质控方法进行质控 四 临床免疫室内质控 三 其它免疫检测的质控1 定量测定参照临床化学的规则和失控判定 如化学发光仪检测的肿瘤标记物项目 2 胶体金 胶体硒等试纸条快速检测可不做室内质控品的测定 3 凝集试验 血凝及乳胶凝集试验的室内质控品可采用试剂盒带的阴阳对照 五 ELISA检测中的注意事项 试剂因素 抗原抗体的纯度 抗体的亲和力 标记物的比活性或免疫活性等均对测定结果产生直接影响 试剂盒的稳定有效期 运输条件及储存方式等也均会对结果产生一定程度影响 ELISA检测的主要影响因素 ELISA检测的主要影响因素 标本因素 内源性物质和外源性物质干扰 内源性物质常见的有 类风湿因子 RF 嗜异性抗体 Id 补体 人抗动物抗体 HAAA 药物及其致的代谢产物和交叉反应物质等等 RF Id和等的干扰机制相似 均为固相抗体和标记抗体之间的桥联抗原 在夹心法中易产生假阳性 ELISA检测的主要影响因素 对于含有内源性干扰物的标本可以作以下处理 1 去除分析用抗体Fc片段 用F ab 2替代完整的IgG 可以减少RF Id和HAAA等对分析结果的影响 2 用63 10min或56 30min热处理来减少RF和补体等对结果的影响 3 用2巯基乙醇加入标本稀释液中 可使RF降解 用EDTA稀释标本可缓解补体对结果的干扰 ELISA检测的主要影响因素 设备 加样系统 孵育设备 洗板机 酶标仪环境因素 水质操作 标本处理 加样 温育 洗板 显色 终止 设备 卫生行业标准 乙型肝炎表面抗原酶免疫检验方法 WS T223 2002 酶标仪在450nm和492nm的波长不精密度应在 1 分别在449nm 451nm和491nm 493nm之间 吸光度 A值 要求可以测到小数点后两位 设备 移液系统在100 l和50 l的移液不精密度应 1 分别在99 101 l和49 5 l 50 5 l之间 恒温系统在37 43 的温度变异应成士I RF多为IgM型 也有IgG和IgA型 RF具有与变性IgG产生非特异性结合的特点 因此在ELISA检测过程中可能与固相上包被的抗体及酶标抗体结合 并将这藕连起来产生假阳性结果 这种情况在利用捕获法测定IgM型抗体的过程中尤其严重 因为捕获法测定IgM型抗体试剂盒中固相上包被的抗体为抗人 链 内源性干扰 内源性干扰 补体 补体经典活化途径从C1q开始 在固相抗体和酶标抗体吸附及结合过程中 抗体分子可能发生变构 从而使Fc段的补体C1q分子结合点暴露出来 则C1q可将二者连结起来 造成假阳性 内源性干扰 可采用RF吸附剂去除RF 63 10min或56 30min灭活补体采用抗体的Fab段替代完整的IgG可有效避免RF干扰 溶血 Hb含有的血红素基团具有类似过氧化物的活性 若标本中Hb浓度过高则可能吸附于固相并于随后加入的HRP底物反应显色 外源性干扰 外源性干扰 细菌污染 细菌的一些内源性酶本身会对用相应酶作标记测定方法产生干扰 标本贮存时间过长 标本在2 8 保存时间过长 IgG可聚合成多聚体 在间接法ELISA测定中会导致本底过深甚至假阳性 外源性干扰 标本凝固不全 血液采集后如收集管中促凝剂和抗凝剂 血液一般在半小时后开始凝固 在临床工作中可能因为赶时间而在血液还未凝固之前就强行离心分离血清 此时分离的 血清 可能残留有部分纤维蛋白原 在ELISA测定过程中形成纤维蛋白而沉积 吸附在酶标板内 而常规洗板难以完全去除 溶血和非溶血 脂浊与非脂浊两组样品A值无统计学意义 AFP RF 补体 自身抗体阳性样品的吸光度值明显高于对照组吸光度值 具有统计学意义 这可能是AFP RF 补体和某些自身抗体能够与固相一抗 标记二抗Fc结合或影响它们的结合而造成假阳性 三种不同的温育方式均会导致边缘效应 中央孔和周围孔的吸光度有显著性差异但水浴法温育比较稳定 边缘效应相对较小 孵箱法较大 微波法最为明显 建议 使用抗凝血标本 便于标本的离心分离 不抗凝血液标本过夜之后才检测 让血凝块更好地收缩 让标本中的非特异性物质被充分地包裹 降低非特异性反应所致的假阳性率 2 标本离心时 加大离心转速 延长离心时间 使红细胞和纤维蛋白充分沉降 使标本的离心分离更加彻底 3 标本加样时避免加入红细胞和 或纤维蛋白 避免这两种干扰物质对实验结果的影响 12份HBsAg阳性血清标本按常规检测 加显色剂后 不加终止剂 在酶标仪上每5min测一次410nmOD值 42份HBsAg阳性血清标本做三排孔检测 每排分别加酶标记抗体40 l 50 l 60 l 其余按说明书操作并测定OD值 加酶结合物前放置不同时间得到的抗HBc结果 随机检测44份抗HBc阴性的血清样品 加样后室温25 分别放置0 5 10 15 20 30min后加入酶结合物 其后严格按说明书操作 结果0 5 10 15 20 30min阳性率分别为0 2 3 1 44 11 4 5 44 15 9 7 44 20 5 9 44 22 7 10 44 与加入酶结合物0min组阳性率相比较 5min组P 0 05 10min组P 0 05 其余各组P均 0 01 不同人员稀释样品所得到的抗HBc结果将5份抗HBc临界阴性的血清混合 选择4名检验人员按照各自工作习惯对混合血清分别稀释16孔 稀释比例为1 30 同时用振荡器平行稀释16孔作为标准对照 将所有稀释样品随机加入同一酶标板中 实验结果显示 4名检验人员检测结果 S CO的 x s A值 和标准对照结果分别为0 85 0 09 0 96 0 11 1 17 0 11 0 97 0 17 1 31 0 11 两两比较差异均有统计学意义 方法1 检测样本39 水浴 反应孔底部不接触水面 方法2 37 水浴 反应孔底部2 3浸入水中 方法3 反应板置37 干式孵育箱孵育 方法2 3之间无显著性差异 方法2 3与方法1间的差异有显著性方法1液面上方的温度是通过水温进行调节的 所以反应板孵育时升温比较缓慢 达到平衡温度所需时间也较长 因此采用该方法对检测的结果影响较大 方法3孵育时反应孔的四周受热均匀 因此反应板达到平衡温度的时间要短于方法1 且反应体系中各种物质的作用较为均匀 结果也比较稳定 3种孵育方式均会产生不同程度的边缘效应 其中方法1对结果的影响最大 三种不同的温育方式均会导致边缘效应 中央孔和周围孔的吸光度有显著性差异但水浴法温育比较稳定 边缘效应相对较小 孵箱法较大 微波法最为明显 12份HBsAg阳性血清标本按常规检测 加显色剂后 不加终止剂 在酶标仪上每5min测一次410nmOD值 42份HBsAg阳性血清标本做三排孔检测 每排分别加酶标记抗体40 l 50 l 60 l 其余按说明书操作并测定OD值 加终止液后随着时间的增加 A值逐渐下降 而且浓度越高其A值随时间下降越快 但弱阳性的HBsAg质控物 其A值并不随时间增加而变化 在终止反应后28min内始终处于同一水平 HBsAg 抗HBs HBeAg三项结果阴阳性判断似乎不受时间的影响 其原因有待进一步研究 但对于竞争法而言 可能会产生假阳性或假阴性结果 因此建议在终止反应后立即比色 同步稀释测定法PEG法 酶标二抗试剂中加入4 PEG600振动态ELISA法 该方法可将HOOK效应发生的临界浓度减少两个稀释度尽量选择测定范围宽的试剂盒 每一批号试剂盒随样本做高浓度质控 10000ng ml 注 计算公式 根据正态分布u检验单侧99 5 的可信限 u值 2 58 上海市临床实验室质量管理基本内容和要求 2009年 复检范围的确定按下列公式计算 cutoff值 0 8 样品测定值 cutoff值 3 不得小于此范围 以 CO 2s 作为阳性低限判断值 其中s值是以卫生部临检中心临界质控血清 HBsAg1ng ml 抗HCV2NCU ml的RCVK所测得的s值 CO至 CO 2s 的范围称为灰区 理由为 国产试剂盒的CO一般是以阴性对照A值加或乘一个常数得出 阴性对照是小牛血清而非人血清 A值不超过0105即按0105计算 亦即CO为一不变的常数 这样就忽视了试剂批间差 板间差和操作误差 国产试剂的灵敏度普遍不高 如HBsAg进口试剂的灵敏度为0 1 0 21ng ml而国产试剂为0 5 11ng ml 一般认为0 11ng ml即有传染性 六 酶标仪的使用及维护 1 酶标仪的基本原理酶标仪实际上就是一台变相的专用光电比色计或分光光度计 光源灯发出的光波经过滤光片或单色器变成一束单色光 进入塑料微孔板中的待测标本 该单色光一部分被标本吸收 另部分则透过标本照射到光电检测器上 光电检测器将这一待测标本不同而强弱不同的光信号转换成相应的电信号 电信号经前置放大 对数放大 模数转换等信号处理后送入微处理器进行数据处理和计算 最后由显示器和打印机显示结