猪血红蛋白ACE抑制肽酶解工艺研究.doc

西南大学食品科学学院本科毕业论文 猪血红蛋白ACE抑制肽酶解工艺研究梅峰瑜西南大学食品科学学院，重庆 400715摘要：动物血液是一种具有高附加值的食品副产物和潜在的药物资源。该试验以真空冷冻干燥提取的猪血红蛋白为原料，采用碱性蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、复合蛋白酶水解猪血红蛋白制备ACE抑制肽，以体外ACE抑制率和水解度为指标筛选最佳用酶。结果表明，胃蛋白酶水解物的ACE抑制率最大。采用Central Composite Design的中心组合试验设计对胃蛋白酶制备ACE抑制肽的水解条件进行优化，建立回归方程，得出最优工艺条件为底物浓度、温度、pH值、加酶量。关键词: ACE抑制肽；猪血红蛋白；酶；工艺条件 Pig hemoglobin ACE inhibitory peptide hydrolysis processFengyu MeiCollege of Food Science， Southwest University, Chongqing 400715Abstract : animal blood is a food by-products with high added value and potential drug resources. The experiment with vacuum freeze-dried extract of pig hemoglobin as raw material, the use of alkaline protease, pepsin, neutral protease, trypsin, papain, composite hydrolysis pig hemoglobin Preparation of ACE inhibitory peptide, the rate and degree of hydrolysis in vitro ACE inhibition indicators of screening the best enzyme. The results showed that the ACE inhibitory rate of pepsin hydrolyzate. The central composite experimental design with the Central the Composite Design of pepsin Preparation of ACE inhibitory peptide hydrolysis conditions were optimized to establish the regression equation to obtain the optimum process conditions for the substrate concentration, temperature, pH value, plus the amount of enzyme.Key words: ACE inhibitory peptide; porcine hemoglobin; enzyme; conditions1. 文献综述.3 1.1.猪血红蛋白的研究概况.3 1.1.1 猪血的营养成分.3 1.1.2 猪血的应用.3 1.2.ACE抑制肽的研究概况.4 1.2.1 ACE抑制肽的作用机理.4 1.2.2 ACE抑制肽的来源.5 1.2.3 ACE抑制肽的制备.5 1.3立题意义及主要研究内容.62. 引言.73. 材料与方法.8 3.1 材料与试剂.8 3.2 仪器与设备.8 3.3 方法.8 3.3.1猪红血蛋白的制备.8 3.3.2猪红血蛋白的水解.8 3.3.3Pepsin胃蛋白酶水解的单因素试验.9 3.4 分析方法.10 3.4.1水解度（DH）的测定.10 3.4.2ACE抑制率的测定.104. 结果与分析.11 4.1最适水解酶选择的试验结果.11 4.1.1不同蛋白酶对ACE抑制率的影响.11 4.1.2不同蛋白酶对水解度的影响.12 4.2胃蛋白单因素试验结果.13 4.2.1酶解温度对酶解液ACE抑制率和水解度的影响.13 4.2.2pH值对酶解液ACE抑制率和水解度的影响.13 4.2.3底物浓度对酶解液ACE抑制率的影响.14 4.2.4酶浓度对酶解液ACE抑制率和水解度的影响.15 4.3响应面优化试验结果与分析.15 4.3.1试验结果.15 4.3.2实验验证.205. 结论.20 271 文献综述 1.1 猪血的的研究概况1.1.1猪血的营养成分 猪血是一种有益于人体健康的保健食品，含有丰富的营养物质和多种具有生物活性的物质: 猪血中含丰富的蛋白质，是一种非常重要的蛋白质资源血含蛋白质19，其中血浆占全血的65，含蛋白质8；红细胞部分占全血的35，蛋白质含量为36；猪血中脂肪非常低，每100g猪血仅含0.4 g脂肪，为猪瘦肉的十七分之一和鸡肉的二十七分之一，是低脂肪食物；猪血中含有丰富的铁，每百克中含铁量高达45mg，是猪肝含量的2倍、瘦猪肉的20倍、鸡蛋的l8倍；猪血含有丰富的维生素K，同时还含有泛酸、叶酸、核黄酸等多种维生素。此外猪血还含有铁、钠、钾、钙、镁等多种矿物质和各种酶类，如淀粉酶、转化酶、阮酶、脂肪酶、磷酸酶、过氧化氢酶等，还含有维生素A、Bl、B2 、B6、C等 1.1.2 猪血的应用 猪血可以制作猪血腐乳血豆腐和血肠，这类食品营养丰富，易于吸收。陈能飞114等人用酶法水解猪血红蛋白制备肉昧香精，并确定了其最佳工艺条件为：猪血红蛋白用Alcalase酶解后，添加7的葡萄糖、2.5的L半胱氨酸及2.0的盐酸硫胺，在pH为6.0，温度为110条件下反应60min。该肉味香精颜色浅，风味柔和。除此之外，血红蛋白与亚硝酸钠的反应产物亚硝基血红蛋白能在肉制品替代亚硝酸钠，不仅在色泽、质构、风味等方面更具优越性，也避免了类似亚硝酸钠致癌的顾虑，更实用、更健康，因此，血红蛋白可作为肉类着色剂。血红蛋白作为一种高度可溶性蛋白，具有强乳化能力。在肉制品生产中，利用其在加热过程中形成胶膜，能使产品的保水性、弹性、粒度、产品率等均有所提高。 猪血在医疗也有很多应用。猪血血红蛋白中还可以提取血红素、超氧化物歧化酶（Super oxide Dismutaee,简称SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、活性肽及氨基酸。在医疗临床上，血红素是目前治疗缺铁性贫血(IDA )疗效较好的一种补铁剂, 具有生物利用度高、无体内铁蓄积中毒及胃肠刺激等不良反应等优点118,同时还是抗贫血和抗肿瘤药物的重要原料119。吴保承120等人用中性蛋白酶酶解提取猪血中得血红素，确定了最佳工艺条件为：加酶量2、底物浓度5、酶解温度50、酶解时间10h，血红素的相对得率达到77.2。SOD能有效地防御活性氧对生物体的毒害作用,对于治疗因超氧阴离子引起的各种疾病均有一定的效果；尤其对于治疗类风湿类关节炎、红斑狼疮以及皮肤炎等疾病均有明显的治疗效果；此外在防辐射、防衰老以及抗肿瘤方面已进入临床试验阶段。生物活性肽具有涉及神经、激素和免疫调节, 抗血栓, 抗高血压, 抗胆固醇, 抗细菌、病毒, 抗癌, 抗氧化, 清除自由基, 改善食品风味、口味、硬度等功能。据资料报道 ,小分子猪血肽不仅有很好的溶解性、低粘度、抗凝胶形成性, 而且在体内消化吸收快。研究发现：从猪血中可以提取ACE抑制肽、抗氧化肽以及抗菌肽。1.2 ACE抑制肽的研究概况1.2.1ACE抑制肽的作用机理 正常人体内血压受很多因素调节。其中，肾素血管紧张素调节系统(RAS)和激肽释放酶激肽系统(KKS)是一种重要的调节系统。前者是升压调节系统，后者是降压调节系统，起调节作用如图所示： 降血压肽是一类具有ACE抑制活性的多肽，属于竞争性抑制剂。这些多肽的肽链长度和氨基酸序列不尽相同，但具有类似的功能。ACE有两个具有活性中心的作用位置，分别为C-端和N-端，二者功能几乎类似，只是针对不同底物的亲和力不同。ACE抑制肽是对ACE活性区域亲和力较强的竞争性抑制剂，它们与ACE的活性中心的亲和力比舒缓激肽或AngI对ACE的亲和力更强，而且ACE抑制肽一旦和ACE活性中心结合，就很难释放出来，从而阻碍催化水解舒缓激肽成为失活片段以及阻止AngI转化为Ang，从而达到降血压的目的。 1.2.2 ACE抑制肽的来源ACE抑制肽是一类与ACE的两个功能活性区竞争性结合, 从而达到抑制其活性的小分子肽。人们已经从各种动植物、海洋生物原料中分离出了多种具有降血压功能的活性多肽。ACE抑制肽主要来源于发酵食品类如发酵乳、酱油、豆腐乳、纳豆、豆腐乳以及一些奶酪中都有比较强的ACE抑制活性；乳蛋白类的ACE抑制肽来源包括酪蛋白源和乳清蛋白源两大类;植物蛋白源ACE抑制肽主要有大豆肽玉米肽小麦肽燕麦肽花生肽菜籽肽大米肽米糠肽苜蓿肽藻类多肽；动物蛋白。1.2.3 ACE抑制肽的制备目前,ACE抑制肽的提取工艺主要包括直接提取、化学合成、利用DNA重组制备和体外水解制备四种。1.2.3.1 直接提取提取ACE抑制肽指利用各种分离纯化技术，直接从天然产物中提取ACE抑制肽的方法。提取的过程中的应注意溶剂、pH值以及温度的选择。常用的提取方法有: 盐析法、层析法、沉淀法等。但是此种方法分离的ACE抑制肽种类有限。比如从鲤鱼内脏自溶产物中分离ACE抑制肽的工艺流程为：鲤鱼内脏压碎加水60保温3h，轻微搅拌 90加热停止反应冷却超滤。1.2.3.2 化学合成ACE抑制肽1963年，Merrifield67提出固相合成多肽的想法，经过40多年的完善和发展，现己经成为多肽合成中的一种常规技术。化学合成多肽分为固相合成和液相合成两类68。在液相合成中，所有的反应都在溶剂中进行，反应速度较快，每一步反应都将中间产物分离纯化出来，有利于提高纯度。但是存在带保护基的肽链难溶和工艺繁杂的问题。与液相合成法相比,固相合成法的优越性在于产率高、合成简化、载体可再生和易实现自动化等。但是, 由于设备和试剂的昂贵严重限制了固定相合成法在规模化生产上应用。1.2.3.3 利用DNA重组制备ACE抑制肽DNA重组技术生产ACE抑制肽，需分析ACE抑制肽的结构和功能之间的关系，人工合成具有较高活性的ACE抑制肽基因序列，并进一步串联融合成ACE抑制肽，克隆至表达载体上并转化至宿主菌中，重组菌经诱导培养、亲和色谱以及凝血酶酶切分离纯化的ACE抑制肽。目前，该技术仅限于生产大分子活性多肽和蛋白质的生产，存在于小分子的基因片段操作困难、表达困难、筛选到高校表达的菌株困难和产量低等缺点。因为ACE抑制肽大部分是短肽，因此限制了该技术在食品加工中的应用。王小莉70等人设计合成了一条IC50为4.2mol/L的VPVLPK小肽，并根据大肠杆菌偏爱密码子人工合成此肽的6拷贝片段，将其克隆至表达载体pET-15b并转化到宿主菌Ecoli BL21(DE3)中，筛选阳性克隆，通过双酶切、PCR及测序表明，研究表明已成功构建出重组降血压pET-15b-ACEIP的表达系统。1.2.3.4 体外水解制备ACE抑制肽 体外水解蛋白质生成多肽,包括化学水解71和酶水解72两种方法。化学水解又包括酸水解和碱水解两种类型。即利用不同浓度的酸或碱在一定条件下水解天然蛋白质获得ACE抑制肽的一种方法。这种方法工艺简单, 成本低，但水解程度难以控制,氨基酸易受破坏, 影响肽的结构和功能, 营养价值降低。酶解法是目前研究得最多的一种方法, 包括直接酶解和利用微生物间接酶解两类。酶法水解具有反应条件温和、专一性强、副产物少以及易于控制等特点,既不会导致营养成分的损失,也不会产生毒性方面的问题,已成为目前研究最多的一种方法。近几年报道的ACE抑制肽的制备方法绝大多数为酶解法，其工艺流程为:原料预处理离心上清液调pH(沉降蛋白质) 加入蛋白酶酶灭活层析/ 超滤成品。1.3 立题的意义及主要研究的内容我国肉类产量长期处于世界第一，且生猪产量接近世界总量的二分之一，猪血蛋白资源十分丰富。猪血蛋白质含量丰富，是酶法制备生物活性肽的良好来源。但是，在我国，由于猪血色泽差，有较重的血腥味，适口性差，猪血红蛋白不易被消化吸 收等缺点，使猪血在我国的工业化利用率较低（不超过10%）。因此，利用我国丰富的猪血蛋白资源，开发出着眼于市场与社会需求的功能保健食品，避免猪血利用单一化和部分猪血的不合理废弃对环境的污染，具有广阔的研究前景。欧美、日本等发达国家对猪血的利用率己达50以上，他们主要是开发肽类试剂、肽类药物以及功能食品和食品添加剂。 本课题首先对猪血红蛋白的水解酶进行筛选，对能够产生高ACE抑制活性水解物的蛋白酶进行酶解工艺优化。在此基础上进一步对水解物中的ACE抑制肽进行分离纯化，并鉴定ACE抑制肽的结构。最后，进行动物实验对提纯的ACE抑制肽的降血压功能进行验证。2 引言高血压是导致心脏病、脑血管病、肾脏病发生和死亡的最主要的危险因素，是全球人类最常见的慢性病。血管紧张素转换酶(Angiotensin-I-converting enzyme,ACE)对调节血压起着关键性作用2，因此，ACE抑制剂是目前治疗高血压的有效药物。我国居民高血压患病率持续增长，估计现患高血压2亿人1。所以，治疗和预防高血压病是当今社会十分重要的课题。1977年，Cushman3等首次合成ACE抑制类药物卡托普利(Captopril)。合成的ACE抑制剂虽然能有效地降低高血压，但临床有许多不良反应，如咳嗽、味觉功能紊乱及皮疹等4。食源性的ACE抑制肽与合成ACE抑制剂相比，不仅温和、安全、易于吸收，还具有其他功能更特性。所以，越来越多的科学工作者倾向于从食物中获取ACE抑制肽。自从1965年，Ferreira5首次从南美洲蝮蛇的毒液中发现了ACE抑制肽以来，人们已经从各种动植物、海洋生物原料中分离出了多种具有降血压功能的活性多肽6。如大豆7、燕麦8、米糠9、玉米10、牛乳11、螺旋藻12、鲣鱼13、海鲤14等。目前我国年出栏生猪约5亿头，是世界上猪出栏数最多的国家，由屠宰生猪而产生的副产物猪血大约有150万吨，资源相当的丰富。猪血红蛋白是一种重要的蛋白质资源，具有较高的营养价值，科学地开发利用猪血红蛋白，为人类提供更多的优质蛋白质资源和功能性食品具有重要的意义。研究发现,与其它蛋白源酶解得到的ACE抑制肽相比较，猪血中的血红蛋白酶解产物具有较高的ACE抑制活性15,16。近年来，已有一些国内外有学者对酶解猪血红蛋白制备具有ACE抑制活性的多肽17,18,19进行了研究，但应用响应面法优化酶解工艺方面还鲜见报道。本研究是以猪血红蛋白作为原料，以胃蛋白酶水解猪血红蛋白，通过单因素实验对酶解温度、酶解pH、底物浓度、加酶量和酶解时间等酶解工艺参数进行研究，并用响应面法优化制备ACE抑制肽的酶解最佳工艺参数，以期为猪血蛋白资源的深入开发利提供参考。3 材料与方法3.1 实验材料3.1.1 材料新鲜猪血：重庆市北碚区屠宰场3.1.2 主要试剂ACE、马尿酰-组胺酰-亮氨酸（HHL）Sigma公司；Pepsin胃蛋白酶：Sigma公司；Trypsin胰蛋白酶：Solarbio公司；Alcalase碱性蛋白酶、Neutrase中性蛋白酶、Papain木瓜蛋白酶、Protamex复合蛋白酶：南宁东恒华道生物科技有限公司。3.2 主要仪器设备JA2003 电子天平 上海精天电子仪器有限公司； HH-6 数显恒温水浴锅 金坛市富华仪器有限公司；PB-10 酸度计 上海雷磁仪器厂；DF8517 超低温冰箱 韩国ilshin公司；ALPAAI-4LSC 真空冷冻干燥机 美国Chris公司；1-15PK 冷冻离心机 SIGMA公司；LC-20AD 高效液相色谱仪 日本岛津公司。3.3 实验方法3.3.1 猪血红蛋白的制备采用Zhao法14并加以改进。在屠宰过程中采集血液，并迅速加入柠檬酸钠（10g/L）抗凝，于4低温保存运回实验室。在4将血液以3500rmin冷冻离心10min ，得到上层血浆和下层血细胞；收集下层血细胞加入同等体积的去离子水，超声波辅助溶血20min并不断搅拌，然后在4 15000rmin 冷冻离心10min ，得到上清血红蛋白液，冷冻干燥成血红蛋白粉于4冰箱保存，备用。3.3.2 猪血红蛋白的水解称取5g血红蛋白粉，蒸馏水100ml将其溶解为底物浓度为5%的水解底物，加酶量为底物质量的3%的条件下，按胃蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、复合蛋白酶、木瓜蛋白酶的最适温度和pH值在恒温水浴振荡器中水解6个小时，反应中持续滴加1 mol/L NaOH或1mol/L HCl维持反应体系 pH 值在规定的范围内，分别于反应过程中0.5h、1h、2h、3h、4h、5h、6h取样，反应结束后在100沸水浴中灭酶10min后迅速冷却，在10000 rmin低温离心10 min，取上清液进行冷冻干燥，然后称取一定量的冻干粉进行ACE 抑制率的检测和水解度的测定。表1 各种蛋白酶的最适反应条件Table1 The optimum reaction conditions of six protease蛋白酶pH值温度胃蛋白酶2.037碱性蛋白酶8.055胰蛋白酶7.545中性蛋白酶7.045复合蛋白酶8.045木瓜蛋白酶6.5373.3.3 Pepsin胃蛋白酶水解的单因素试验3.3.3.1 底物浓度对酶解效果的影响pH值为2.0，酶解温度为37，,加酶量为3%，酶解4h，底物浓度分别为2.5%、5%、10%、12.5%、15%，分别测酶解液的ACE抑制率和水解度。3.3.3.2 温度对酶解效果的影响底物浓度为5%，pH值为2.0，加酶量为3%，酶解4h，酶解温度分别为27、32、37、42、47、52，分别测酶解液的ACE抑制率和水解度。3.3.3.3 pH值对酶解效果的影响 底物浓度5%，温度为37，加酶量为3%，酶解4h，pH值分别为1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0，分别测酶解液的ACE抑制率和水解度。3.3.3.4 加酶量对酶解效果的影响 底物浓度为5%，温度为37，pH为2.0，酶解4h，加酶量分别为1%、2%、3%、4%、5%、6%，分别测酶解液的ACE抑制率和水解度。3.3.4 Pepsin胃蛋白酶的水解条件优化试验根据单因素实验的结果，采用响应面优化实验设计，运用Central Composite Design的中心组合试验设计原理，选择对ACE抑制率有影响的四个因素：底物浓度、酶添加量、pH值、温度，进行四因素三水平的响应面优化实验，以ACE抑制率作为响应变量。表2 响应面优化试验因素与水平Table2 Factor and level of response surface因素编码水平-10+1酶解温度（X1）353739pH值（X2）1.5 2.02.5底物浓度（X3）3%5%7%加酶量（X4）2%3%4%3.4 分析方法3.4.1 水解度（DH）的测定在中性和碱性条件下采用pH-stat法15 测定水解度，水解度计算公式如下： DH（%）= (CV/ mp htot)100式中：C、V分别为水解过程中所加NaOH标准溶液的浓度（mol/L）和体积（mL）；mp为原料中净蛋白质质量（g）；htot为1g原料蛋白质中所含肽键的毫摩尔数（取为8.3mmol/g蛋白）；为氨基的平均解离度，可按=10pH-pK/(1+10pH-pK)计算（pH为水解溶液的pH值，pK为-氨基的解离度的负对数，此处取值为7.0）。在酸性条件下，采用中性甲醛法16测定水解度，水解度计算公式如下：DH（%）=M(V1-V2)(1000/ CV) C(1/htot) 100式中：M 为NaOH标准溶液的浓度（mol/L）；V1、V2分别为滴定样品稀释液和空白试验稀释液消耗的0.05 mol/LNaOH标准溶液的体积体积（mL）；C 为所用蛋白质量浓度（g/L）；V 为甲醛滴定水解液的体积htot（mL）；htot为1g原料蛋白质中所含肽键的毫摩尔数（取为8.3mmol/g蛋白）。3.4.2 ACE抑制率的测定17在试管中依次加入1000L 硼酸盐缓冲溶液、100L酶解液、10L ACE ，把以上混合液放入37恒温水浴中保温5min，再加入50L HHL于37中恒温保持30min后，加入1mol/L HCl中止反应，至室温，取5L反应产物进样，通过反相高效液相色谱洗脱图谱定量马尿酸的生成量，从而计算降血压肽的抑制率。其中，抑制率(%)=(A1 - A2 ) / A1A1不存在降血压肽时的峰面积,A2存在降血压肽与酶时的峰面积。色谱条件：高压液相色谱系统：SHIMADZU LC-20AD；检测器：SPD-M20A；色谱柱：SHIMADZU VP-ODS 4.6150mm；洗脱液：24%乙腈：76% 超纯水；洗脱液流速：0.4mL/min；检测波长：228nm，进样量：5L。3.4.3 数据处理方法实验数据均是经过3次平行实验得到的平均值，并计算其误差，使用Design Expert分析响应面数据。4 结果与分析4.1 最适水解酶选择的试验结果4.1.1 不同蛋白酶对ACE抑制率的影响ACE抑制肽可以通过酶法水解蛋白质的方法获得。不同蛋白酶的水解位点不同，生成的肽段的结构和数目也是不同的，故酶解液的ACE抑制率和水解度各有差异。本研究选取了6种常见的商业化蛋白酶酶解猪血红蛋白，其酶解结果见图1。 图1 6种酶解液的ACE抑制率比较Figure1 Comparison the six kind of enzyme solution on ACE inhibition rate从图1中可以看出，不同的蛋白酶的水解液的ACE 抑制活性虽然不同，但其变化趋势基本相同，即除胰蛋白酶外各蛋白酶水解物的 ACE 抑制率随着水解时间的延长都表现为先升高后降低的趋势。在酶解4h时后，胃蛋白酶解液的ACE抑制率最高，达到了32.80%。而中性蛋白酶的活性最低，只有10.9%。4h后，ACE抑制率有所下降。有学者18认为ACE抑制率有所下降的原因在于随着水解程度的不断深入，具有高抑制活性的片段被继续水解为活性较低或无活性的片段。4.1.2 不同蛋白酶对水解度的影响图2 6种酶解液的水解度比较Figure2 Comparison the six kind of enzyme solution on Hydrolysis degree如图2所示，在1h至3h内，猪血红蛋白的水解速度快，水解度随着时间的增加而上升较快。3h后，随着水解的进行，水解度上升缓慢。碱性蛋白酶水解产物的水解度最大，水解能力最强，表明在该酶作用下，肽键的裂解程度大，生成的小肽含量最高；而复合蛋白酶蛋水解物的水解度很低，6h水解度只有8.2%，胃蛋白酶水解能力在 6种蛋白酶中处于中等水平，水解4h后水解度能达到9.3%。由图1和图2可以看出，胃蛋白酶的水解度虽然在6种蛋白酶中并不是最高的，但是ACE 抑制率最高。故选择胃蛋白酶作为酶解的最优酶。4.2 胃蛋白单因素试验结果4.2.1 酶解温度对酶解液ACE抑制率和水解度的影响图3 酶解温度对酶解液的ACE抑制率和水解度的影响Figure 3 The influence of enzyme solution ACE inhibition rate and Hydrolysis degree by temperature从图3可看出，酶解温度对酶解液的ACE抑制率的影响呈现先升高后降低的趋势，当37时为最大值28.3%；酶解温度对水解度的影响也呈现先升高后降低的趋势，在37时具有最大水解度8.2%。因此，选择37作为其最佳的酶解温度。4.2.2 pH值对酶解液ACE抑制率和水解度的影响图4 pH对酶解液的ACE抑制率和水解度的影响Figure 4 The influence of enzyme solution ACE inhibition rate and Hydrolysis degree by pH由图4可以看出，在pH2.0时，其ACE抑制率达到最大，为29.61%。再随着pH的增加，其ACE抑制率逐渐降低；水解度在此时也达到最大。因此，选取2.0作为其较佳的酶解pH。4.2.3 底物浓度对酶解液ACE抑制率的影响图5 底物浓度对酶解液的ACE抑制率和水解度的影响Figure 5 The influence of enzyme solution ACE inhibition rate and Hydrolysis degree by substrate concentration由图5中可知，随着底物浓度的增加，其ACE抑制率也逐渐增加，当底物浓度为5%时，其ACE抑制率最大，为34.20%，之后又继续下降；水解度也呈现先上升后下降的趋势，在底物浓度为5%时，达到最大水解度。因此，选取5%作为其较佳的底物浓度。4.2.4 酶浓度对酶解液ACE抑制率和水解度的影响图6 酶浓度对酶解液的ACE抑制率的影响Figure 6 The influence of enzyme solution ACE inhibition rate and Hydrolysis degree by the add concentration proteases由图6可知，加酶量为1%-3%时，其酶解液的ACE抑制率逐渐变大，3%和4%时，其ACE抑制率没有明显区别，之后随着加酶量的继续增加，其抑制率却变小；水解度在3%时达到最高。因此，选取加酶量为3%。4.3响应面优化试验结果与分析4.3.1 试验结果试验采用Central Composite Design设计，用自变量X1、X2、X3、X4来表示酶解温度（）、pH值 、底物浓度、加酶量4个影响因素，以ACE抑制率为响应值（Y）。利用Design Expert 7.0软件对试验结果进行响应面分析，得出回归模型参数的方差分析见表4。表3 响应面分析方案及试验结果Table3 Design and results of response surface编号X1（酶解温度）X2（pH）X3（底物浓度%）X4（加酶量%）Y抑制率（%）13725333.82391.57428.833725333.54352.53424.95391.53426.563735325.473725333.083729324.59392.57425.110392.53428.7113325323.3123725124.8133721324.814351.57424.7153725333.7163725524.417351.57224.1183725331.119352.53224.6203725332.9214125327.422351.53225.823391.53224.724351.57226.725351.53424.226392.55226.927352.55424.5283715326.929352.57224.330392.53226.6表4 二次响应模型方差分析Table4 ANOVA of response surface model来源离差平方和自由度均方F 值P值模型307.291421.9521.890.0001X131.05131.0530.970.0001X20.3510.350.350.5632X30.09410.0940.0940.7640X40.3510.350.350.5632X1X20.07610.0760.0750.7873X1X30.03110.0310.0310.8636X1X40.3910.390.390.5419X2X33.1513.153.140.0966X2X40.2810.280.270.6077X3X40.1410.140.140.7133X1291.67191.6791.430.0001X2272.71172.7172.520.0001X32110.061110.06109.770.0001X42111.441111.44111.150.0001失拟项10.04101.001.000.5329误差 5.0051.00总和322.3329注:*表示在P0.05 水平上显著;*表示在P0.05)，差异不显著，未知因素对试验结果干扰小，说明残差均由随机误差引起。R2=0.9345，说明模型拟合程度良好,试验误差小，该模型能够反映响应值的变化。其二次方程为：Y=33.00+1.14X1-0.44X2X3-1.83X12-1.63X22-2.00X32-2.02X42对表4的结果作响应面及其等高视线图，如图7-图12，其中各图表示X1、X2、X3、X4中任意两个变量取零水平时，其余两个变量对ACE抑制率的交互影响。从图7-图12可以看出，任意两个因素间均存在比较明显的交互作用，最佳落点在试验考察的区域内。图7 温度和pH相互作用对ACE抑制率影响的响应面和等高线Figure7 The response surface and contours of the influence of ACE inhibition rate by the interation of temperature and pH图8 温度和底物浓度相互作用对ACE抑制率影响的响应面和等高线Figure8 The response surface and contours of the influence of ACE inhibition rate by the interation of substrate concentration and temperature 图9 温度和加酶量相互作用对ACE抑制率影响的响应面和等高线Figure9 The response surface and contours of the influence of ACE inhibition rate by the interation of temperature and add enzyme quantity图10 底物浓度和pH相互作用对ACE抑制率影响的响应面和等高线Figure10 The response surface and contours of the influence of ACE inhibition rate by the interation of substrate concentration and pH图11 加酶量和pH相互作用对ACE抑制率影响的响应面和等高线Figure11 The response surface and contours of the influence of ACE inhibition rate by the interation of add enzyme quantity and pH图12 底物浓度和加酶量相互作用对ACE抑制率影响的响应面和等高线Figure9 The response surface and contours of the influence of ACE inhibition rate by the interation of substrate concentration and add enzyme quantity4.3.2验证实验利用Design Expert 7.0软件进行工艺参数的优化组合，所得ACE抑制率最大值对应的相关参数、预测值、验证结果见表5。表5 优化工艺验证结果表Table5 Test result of optimal extraction conditions因素ACE抑制率预测值（%）实际值（%）酶解温度（X1）37.0032.32%32.510.03pH（X2）1.88底物浓度（X3）5.00加酶量（X4）3.07因此，酶解的最佳工艺条件为：温度3