海水培养光合细菌存在的问题及其优化研究.doc

海水培养光合细菌存在的问题及其优化研究摘要 目的为光合细菌海水培养技术的大规模应用提供理论依据。方法采用对比试验研究光合细菌在不同培养基中的生长状况,探讨光合细菌在海水培养过程中出现沉降现象的原因,在此基础上对培养基组分进行优化并进行优化培养试验。结果在海水培养光合细菌的过程中,酵母膏、蛋白胨培养基中沉降现象较轻,其余培养基中培养2 d后均出现较严重的沉淀现象,主要是因为培养过程中培养基的pH值逐渐升高,其中的磷酸盐与海水中的Ca2+和Mg2+结合成沉淀,从而使细菌附着在沉淀表面生长所致。优化后的培养基组分为:乙酸钠3.0 g/L,氯化铵1.0 g/L,磷酸二氢钾0.1 g/L,酵母浸膏0.5 g/L。结论用优化后的培养基培养光合细菌效果理想,培养7d后光合细菌的个数可达3.16109个/ml。关键词 光合细菌;海水;培养Problem of Photosynthetic Bacteria Culture in Seawater and Optimization of Culture ConditionsAbstract Objective The aimwas to provide theoretical basis for the application of culture technology for photosynthetic bacteria in seawater in largescale. Method The contrast testwas taken to study the growth status of photosynthetic bacteria in differentmediums and to explore the reason of photo-synthetic bacteria appearing subsidence phenomenon inseawater in cultureprocess. Onthebasisof it, themediumcomponentswereoptimizedandtheop-timized culturewas carried out. Result In the process of photosynthetic bacteria culture in seawater, the subsidence phenomenon in yeast extract andpeptone mediumwas slight and that in othermediumswas serious after cultured for2 d.Themainreasonwas that, withthe graduallyrise of pHvalue ofmedium in culture process, the phosphate combined into precipitation with Ca2+andMg2+in seawater, so the bacteria attached to the precipitation togrown. The optimized mediumwas that sodiumacetate of 3.0 g/L, chloride of 1.0 g/L, potassium dihydrogen phosphate 0.1 g/L, yeast extract 0.5g/L. Conclusion The culture effect of photosynthetic bacteriawith optimized mediumwas ideal, and the number of photosynthetic bacteria could reach3.16109ind/ml after cultured for 7 d.Key words Photosynthetic bacteria; Seawater; Culture 光合细菌(Photosynthetic Bacteria,PSB)是一类能在厌氧光照或好氧黑暗条件下利用有机物作供氧体兼碳源,进行不放氧光合作用的有益细菌,不仅可作为光合作用机理和产氢固氮的研究材料1-2,且在养殖业、种植业、环境治理和新能源开发利用等领域具有广阔的应用前景3-8。在水产养殖中,光合细菌可降解水体中的有机质和硫化物等有毒物质,实现其充当饵料、净化水质、预防疾病和作为饲料添加剂等的功能,因此光合细菌在无公害水产养殖中具有巨大的应用价值10。目前生产上应用较多的是紫色非硫细菌中的沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalusteris)和类球红细菌(Rhodobacter spheroids),市面上所售菌种大都适合淡水培养,而用海水培养光合细菌时,因为海水中含有大量的钙、镁等物质,极易与培养基中的PO43-、HPO42-形成Ca3(PO4)2、CaHPO4等沉淀,导致细菌在沉淀表面生长,出现严重的沉降现象。为此,笔者进行了大量试验,找出了适合光合细菌在海水中生长的培养基,并采用正交试验优化了培养基中各组分的最佳配比,为光合细菌海水培养的大规模应用奠定了基础。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌种。所用菌种主要是沼泽红假单胞菌,来源于江西宜春强微高新技术专利开发中心。1.1.2 仪器。WFJ-72型可见分光光度计,PHS-3C型精密pH计,YXQ-LS-50S立式压力蒸汽灭菌器。1.1.3 培养基。培养基选择试验采用5种培养基:小林达治培养基的红螺菌科配方(培养基1)、Sawad培养基(培养基2)、失木修身培养基(培养基3)、VanNiel培养基(培养基4)、酵母膏、蛋白胨培养基(培养基5)9。1.2 试验方法1.2.1 5种培养基的比较。将菌种以20%接种量接种到分别用自来水和海水配制的上述5种不同的培养基中,在其他因素(温度、光照、氧需求程度等)相同的条件下进行培养。培养过程中每天震荡摇匀35次,在660 nm处测定菌液的吸光度值(OD660)来表示菌体含量,并每天测定1次pH值,以观察细菌培养繁殖过程中菌液的pH值变化。图1 光合细菌在自来水中的生长曲线Fig.1 The growth curve of photosynthetic bacteria in tap water1.2.2 培养基组分的优化设计。为解决海水培养光合细菌的沉降凝聚问题,参照细菌在培养过程中所需要的碳源、氮源、磷源和其他生长因子4,9-12,结合海水的特点,对光合细菌生长的培养基进行了改良,同时考虑各因素间的相互作用,采用正交试验设计L8(27)13,对培养基中各组分进行优化。安徽农业科学,Journal ofAnhui Agri.Sci.2009,37(5):1901-1902,1918 责任编辑 常俊香 责任校对 张士敏图2 光合细菌在海水中的生长曲线Fig.2 The growth curve of photosynthetic bacteria in seawater2 结果与分析2.1 几种培养基的比较 在淡水中,除VanNiel培养基和酵母膏、蛋白胨培养基培养的PSB出现菌液颜色不正常(变成橙红色),菌液发臭,菌体粘壁现象外,其他3种培养基培养的PSB生长正常,菌液紫红,均匀、粘稠成胶体状,结果见图1、图2。出现这种现象的原因:从培养基的成分上看,5种培养基的氮源都是氯化铵或硫酸铵,磷源都是磷酸二氢钾或磷酸氢二钾,碳源有所不同。VanNiel培养基和酵母膏、蛋白胨培养基的碳源是蛋白胨,其他3种培养基的碳源主要是乙酸钠。乙酸钠作为小分子有机物,更适合光合细菌的生长,而蛋白胨作为碳源出现上述现象可能是因为蛋白胨同时也是其他菌种的营养物质,使其他菌种成为优势菌,PSB生长受到抑制,出现菌液不正常现象。在海水中,酵母膏、蛋白胨培养基沉降现象比较轻,但出现了严重的粘壁现象,其余培养基均在2 d后出现严重的沉降现象,后续生长缓慢。这主要是由于其余4种培养基中都含有不同量的磷酸氢二钾和磷酸二氢钾,pH值的大小决定了这些磷酸盐在培养体系中的存在形式,当pH值为6时,分布系数DHPO42-=0.058,磷酸盐主要以HPO42-的形式存在;pH值为8时,DPO43-=0.86,磷酸盐主要以PO43-的形式存在。而在PSB培养过程中培养基的pH值逐渐升高(培养第18 d时,pH值分别为6.55、6.80、7.86、8.28、8.35、8.55、8.48、8.79),磷酸盐主要以HPO42-和PO43-的形式存在,而HPO42-、PO43-极易与海水中大量存在的Ca2+形成Ca3(PO4)2、CaHPO4沉淀(Ksp Ca3(PO4)2=2.010-29,Ksp CaHPO4=1.010-7),细菌就会附着在沉淀表面生长繁殖,造成菌液不均匀。其次,海水中含有较多的钙盐和镁盐,这些盐类的存在,破坏了光合细菌胶体的稳定性,加剧了凝聚沉降现象的发生。2.2 培养基组分的优化 要防止菌悬液沉降,必须严格控制培养基的pH值和磷源的加入量,为此,笔者在充分查阅相关资料和初步试验的基础上4,10-13,对光合细菌的培养基进行了改良和培养基组分的优化(表1)。 从正交试验的直观分析结果来看,影响细菌生长的主要表1 培养基各组分的正交设计L8(27)Table 1 The design of L8(27) orthogonal test for each component in medium列号No. ofcolumnA(乙酸钠)SodiumacetateB(氯化铵)Ammonium chlorideC(磷酸二氢钾)Potassiumdihydrogen phosphateD(硫酸镁)MagnesiumsulfateE(pH)CEF(酵母浸膏)Yeast extractOD5-OD01 1(3.0) 1(1.0) 1(0.1) 1(0.0) 1(6.5) 1 1(0.5) 1.6642 1(3.0) 1(1.0) 1(0.1) 2(0.5) 2(7.5) 2 2(1.0) 1.6193 1(3.0) 2(2.0) 2(0.3) 1(0.0) 1(6.5) 2 2(1.0) 1.6774 1(3.0) 2(2.0) 2(0.3) 2(0.5) 2(7.5) 1 1(0.5) 1.3185 2(2.0) 1(1.0) 2(0.3) 1(0.0) 2(7.5) 1 2(1.0) 1.4066 2(2.0) 1(1.0) 2(0.3) 2(0.5) 1(6.5) 2 1(0.5) 1.5547 2(2.0) 2(2.0) 1(0.1) 1(0.0) 2(7.5) 2 1(0.5) 1.4268 2(2.0) 2(2.0) 1(0.1) 2(0.5) 1(6.5) 1 2(1.0) 1.506K16.348 6.213 6.185 6.043 6.272 6.064 6.132K25.892 6.027 6.055 6.197 4.563 3.003 4.602极差R0.456 0.186 0.130 0.154 1.708 3.061 1.530因素主y次Factors ranking CEEFAB D C优方案Optimumscheme A1B1C1D2E1F1 注:OD0、OD5分别表示培养当天和第5天菌悬液在660 nm处的吸光度。 Note:OD0andOD5stand for the absorbency of bacterial suspension at the wavelength of 660 nm on the same day and the fifth day after culture.因素是磷酸二氢钾和pH值的交互作用,其次是pH值,这与前面的分析结果相吻合。影响培养结果的因素依次为:CEyEyFyAyByDyC,由于硫酸镁的2水平之间没有显著差异,海水中又含较多Mg2+(约1.29 g/L),所以最终选择的优化方案是A1B1C1D2E1F1。2.3 培养基组分优化后的培养效果 用优化后的培养基对光合细菌进行扩大培养,每天测定菌悬液的吸光度值(OD660),并用乙酸和NaOH调节pH值在6.57.0之间。同时在相同温度、光照条件下,选择2种情况相比较:(1)选择优化后的培养基,但在培养过程中不调pH值;(2)选择优化后的培养基,但培养基中不加磷酸盐。培养结果见图3。由图3可知,用优化后的培养基培养的光合细菌生长状况良好,7 d后用MPN法14测定光合细菌的个数达到3.16109个/ml。用优化后但不调pH值的培养基培养光合细菌时,由于2 d后菌液pH值升高,出现明显的沉降分层现象;优化后但未加磷酸盐的培养基中虽然没有出现沉降分层现象,但菌体后期生长缓慢。可见磷源是PSB生长不可缺少的营养物质。3 结论与讨论影响细菌生长的主要因素是磷酸二氢钾和pH值的交互(下转第1918页)1902 安徽农业科学 2009年图3 不同品种番茄植株胞间CO2浓度Fig.3 The intercellular CO2concentration of different cultivars oftomato plants3 结论与讨论(1)品种是番茄生产的基础,是影响番茄产量的最重要因素,而光合作用是番茄产量与品质形成的另一重要因素。从光合作用与物质生产的角度看,番茄产量主要决定于光合速率。而光合产物能否有效分配到番茄植株各器官,则直接影响番茄产量与品质的形成。气孔是水分及气体进出的通道,气孔导度是气体及水分进出的难易程度指标,胞间CO2浓度是叶片光合作用反应底物1。 (2)该试验研究发现番茄植株上部、中部、下部叶片的净光合速率、气孔导度和胞间CO2浓度,层性明显。番茄净光合速率程下降趋势,上部中部下部;胞间CO2浓度多呈上升趋势,上部中部中部下部。40号白果强丰净光合速率数值最大,其叶片胞间CO2浓度与其他材料相反,下部中部上部。这些均为进一步研究番茄光合特性奠定了基础。另外在该试验中采用的是自然光,光照强度在不同单株间有一定差异,所以针对此问题下一步将运用红蓝光源进行解决。参考文献1王少先,李再军,王雪云,等.不同烟草品种光合特性比较研究初报J.中国农学通报,2005,21(5):245-247.2 ATHERTON J G,RUDICHJ.番茄M.郑光华,沈正言,译.北京:北京农业大学出版社,1989:144-152.3张明贤,高志奎.蔬菜CO2施肥效果及生理研究J.河北农业大学学报,1993(2):87-92.4周春菊,薛万新,邹养军,等.早熟番茄苗期光合特性的研究J.西北农业学报,1998,7(1):60-63.5陈禅友,胡志辉,徐小玉.樱桃番茄生育性能和光合特性分析J.江汉大学学报,2002,19(4):77-79.6李梅,须晖,李天来,等.不同夜温对番茄叶片呼吸及光合启动时间的影响J.石河子大学学报,2006,24(2):201-204.7朱延姝,高绍森,冯辉.弱光对不同基因型番茄品系苗期功能叶片光合速率和叶绿素含量的影响J.辽宁农业科学,2005(1):17-18.(上接第1902页)图3 不同情况下光合细菌的生长状况比较Fig.3 The growth situations comparison of photosynthetic bacteriaunder different conditions作用,其次是pH值。优化后的培养基较适合用于光合细菌的培养。在用海水培养光合细菌的过程中,由于光合细菌利用了培养基中的酸性物质或在生长过程中代谢产生碱性物质,使菌悬液的pH值不断升高,所以要严格控制培养基中磷酸盐的量,并保持pH值在6.57.0之间。最佳培养基组分配比为乙酸钠3.0 g/L,氯化铵1.0 g/L,磷酸二氢钾0.1 g/L,酵母浸膏0.5 g/L,可不加镁盐。用优化后的培养基对光合细菌进行扩大培养,效果理想,可以在海水培养中推广使用。参考文献1 LOACHPA.Supramolecular complexes in photosynthetic bacteria (comment)J.Proceedings of the Nationals Academy of Sciences of the United States ofAmerica,2000,97(10):5016-5018.2吴永强,宋鸿遇.光合细菌固氮分子生物学研究进展J.植物生理学通讯,1991,27(3):161-166.3吴向华,杨启银,刘五星.光合细菌的研究