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SHH信号通路对脑胶质瘤干细胞增殖与分化调控作用的实验研究 第三军医大学附属新桥医院神经外科杨辉尹昌林吕胜青中国重庆 400037 Fig1HH信号通路的组成和信号传递过程A HH信号通路的组成和信号传递过程 B HH信号对GLI的调控 一 材料和方法 1 严重联合免疫缺陷小鼠 SCIDmouse 4 5周龄 雄性 10 15g 2 总共收集31例新鲜人脑胶质瘤组织标本 按世界卫生组织 WHO 确立的原则进行病理分型和分级 3例正常对照脑组织标本来源于新桥医院神经外科同期癫痫手术病人 3 U251胶质瘤细胞株 CHG 5胶质瘤细胞株 1 人脑胶质瘤组织和细胞株中脑胶质瘤干细胞的分离和体外培养 参照Singh等的方法 采用人CD133细胞分选试剂盒 以免疫磁珠法进行 2 体外培养活细胞数测定 采用CCK 8试剂盒 以WST 8法进行 3 BGSCs增殖与分化过程中SHH信号通路基因表达的检测 采用RT PCR法检测 4 BGSCs增殖与分化过程中SHH信号通路蛋白表达的检测 采用WesternBlotting和免疫荧光技术检测 5 细胞周期测定 细胞收集 固定后以PI染色 流式细胞术检测分析 6 细胞比例测定 细胞收集 固定后行免疫荧光单标染色 流式细胞术检测分析 CD133 细胞从原标本中的1 8 29 7 提高到46 8 88 7 而相应的CD133 细胞群标本中CD133 细胞比例降至1 以下 人脑胶质瘤干细胞生长情况 250bp 500bp 脑胶质瘤干细胞分化过程中SHH信号通路蛋白表达情况 1 WesternBlotting在分化第3d可检测到明显的Shh和Gli 1的表达 2 分化第3d CD133 MAP2 GFAP和MBP染色阳性的细胞均可较强地表达Gli 1 分化第7d时4类细胞表达Gli 1明显减弱 部分细胞不表达Gli 1 SHH信号通路对中枢神经系统的发育是必需的 在体实验 虽然GLI 1基因敲除的小鼠能正常发育 但SHH Ptch GLI 2或GLI 3基因敲除的小鼠均在出生前即死亡 并伴有脑部的严重缺陷 在本课题研究中我们发现 在脑胶质瘤组织和细胞株中均检测到SHH信号通路关键分子Shh Gli 1和Bmi 1表达 而正常成人脑组织中则未检测到 对其表达情况进行分析表明 Shh和Gli 1表达与胶质瘤病理分级有关 高级别胶质瘤组织中表达强于低级别胶质瘤组织中表达 胶质瘤干细胞分化时 Gli 1表达呈逐渐增强 然后逐渐减弱至消失的过程 CD133表达逐渐减弱 MAP2 GFAP和MBP出现表达并逐渐增强 因此 我们推测SHH信号通路蛋白表达可能参与了胶质瘤干细胞分化启动和阶段性调控作用 总结 1 不同病理分级的胶质瘤标本和细胞株中均存在一小部分CD133 胶质瘤细胞 具有干细胞的属性 即BGSCs 2 SHH信号通路可能与BGSCs干细胞状态和细胞存活维持
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