实验教案 培养基的制备.doc

实验一 培养基的制备一目的要求1 明确培养基的配制原理2 通过对基础培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤二 基本原理不同培养基中含有不同的微生物生长所需要的营养物质，其可供微生物生长繁殖用，为微生物提供C源、能源、N源和维生素。在配制固体培养基时还要加入一定量琼脂作凝固剂。琼脂在常用浓度下96度溶化，实际应用时，一般在沸水中或下面垫以石棉网煮沸溶化，以免烧焦，琼脂在40度时凝固，通常不被微生物分解利用，固体培养基中琼脂含量根据琼脂的质量和气温的不同有所不同。牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏：3.0g,蛋白胨10.0g,NACl5.0g,水1000ml,pH 7.2-7.4.马铃薯培养基是霉菌的基本培养基，培养基配方如下：马铃薯 100g 蔗糖 10g 琼脂 10g 水500ml pH 自然三器材：1试剂或溶液：马铃薯、蔗糖、琼脂、蒸馏水。2仪器或其它用具：试管、三角瓶、烧杯、玻璃棒、天平、牛角勺，纱布、麻绳、牛皮纸、高压灭菌锅四操作步骤1称量：依次称取马铃薯块、蔗糖、，切碎的琼脂放入三角瓶中并加入500ml蒸馏水2 把三角瓶放入锅中，锅盖好后放在电热炉上加热，等琼脂溶解后取出三角瓶3过滤：趁热用多层纱布过滤，去除里面的杂质4分装：将配制好的培养基分装入试管。5加塞：分装完后在试管口塞上塞子，以阻止外界微生物进入培养基造成污染，并保证有良好的勇气性能。6包扎：用牛皮纸再包扎瓶口，以防灭菌时弄湿棉塞。7灭菌：用高压蒸汽锅在0.1MP下灭菌20min8搁置斜面：趁热将试管里的培养基斜面，注意斜面的长度大约为试管长度的1/29无菌检查五：注意事项1培养基配制后，必须立即灭菌2分装过程中，注意不要使培养基沾在管口上，以免沾在塞子上而引起污染实验二 革兰氏染色法一目的要求1学习并初步掌握革兰氏染色法2了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性二基本原理革兰氏染色法是1884年丹麦病理学家christain Gram 创立的而后作了些改进，革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。革兰氏染色法的基本步骤是：先用初染剂结晶紫进行染色，再用碘液媒染，然后用乙醇脱色，最后用复染剂复染。经此方法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌。如果细胞中初染剂被脱色剂洗脱而细菌染上复染剂的颜色，该菌属于革兰氏阴性菌。革兰氏染色法将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是由这两类细菌细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。实际上，当用结晶紫初染后，像简单染色法一样，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色，碘作为媒染剂，它能结晶紫结合成结晶紫-碘复合物，从而增强了染料与细菌的结合力，当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果是不同的，革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，壁厚、类脂含量低，用乙醇脱色时细胞壁脱水，使肽聚糖的网状结构孔径缩水，透性降低，从而合结晶紫-碘复合物不易被洗脱，而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂 的蓝紫色，革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫-碘复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。三器材1菌种 大肠杆菌2染色剂：革兰氏染色液（1）草酸铵结晶紫：A 液：结晶2g：95%乙醇20ml; B 液：草酸铵0.8g;蒸馏水80ml; 混合AB两液，静置48h后使用（）(2)卢戈氏碘液 碘片1g;碘化钾2g;蒸馏水30ml;(3)95%乙醇（4）番红复染液：番红25g;95%乙醇 100ml取上述配好的番红乙醇溶液10ml和 80ml蒸馏水混匀即成。3仪器或其他用具 显微镜 酒精灯 载玻片 接种环 蒸馏水四 操作步骤1制片（1）涂片：取载玻片，各滴一小滴蒸馏水于玻片中央，有接种环无菌操作挑取菌苔于水滴中，混合 并涂成薄膜。（2）干燥：室温自然干燥（3）固定：涂面朝上，通过23次2 初染滴加结晶紫染色1-2Min,水洗3 媒染 用碘液冲去残水，并用碘液覆盖1min，水洗4 用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在魄背景下，用滴管流加95的乙醇脱色，直到流出的乙醇无紫色时，立即水洗，脱色时间一般20-30min5复染用番红复染2min,水洗。并用吸水纸吸干玻片上的残水。6镜检干燥后，用显微镜观察。菌体被当成蓝紫色的是革兰氏阳性菌，被染成红色的革兰氏阴性菌。实验三 酵母菌的形态观察及死活细胞的的鉴别一目的要求1观察酵母菌的形态及出芽生殖方式，学习区分酵母菌死活的实验方法2 掌握酵母菌的一般特征及其与细菌的区别二基本原理酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，共大小通常比常见细菌大几倍甚至十几倍，大多数酵母以出芽方式进行无性繁殖，有的分裂繁殖有性繁殖通过接合产生子囊孢子，本实验 通过美蓝染水浸片来观察酵母的形态和出芽生殖方式。美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈现蓝色，还原型无色。用美蓝对酵母的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型 变为无色的还原型 ，因此，具有还原能力的酵母活细胞是无色的，而死细胞或代谢微弱的衰老细胞则呈蓝色或淡蓝色，借此即可对酵母菌的死细胞和活细胞进行鉴别。三器材1菌种：酿酒酵母培养约2天的纯培养物2溶液或试剂：吕氏碱性美蓝染色液3仪器或其他用具：显微镜，载玻片 盖玻片四操作步骤1美蓝浸片的观察（1）在载玻片中央加一滴吕氏碱性美蓝染色液，然后按无菌操作用接中环挑取水量酵母菌放在染液中，混合均匀。（2）用镊子取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下，使其不着边际在菌液上（3）将制片放置约3分钟，镜检。先用低倍镜，然后用高倍镜观察酵母的形态，和出芽情况。并根据颜色区别死活细胞。（4）染色约0.5小时后再次进行观察，注意死细胞的数量是否增加。2 水碘液浸片的观察在载玻片中央加一小滴革兰氏染液用碘液，然后在其上加3小滴水，取少许酵母菌苔放在水碘液中混匀，盖上盖玻片后镜检。五实验结果观察的酵母菌的形成特征：实验四 霉菌的形态观察一实验目的1学习并掌握观察霉菌的形态的基本方法2了解甲类常见霉菌的基本形态特征。二实验原理霉菌可产生复杂的分枝的菌丝体，分基内菌丝和气生菌丝，气生菌丝生长 到一寂阶段分化产生繁殖菌丝，由繁殖菌丝产生孢子。霉菌菌丝体及孢子的形态特征是识别不同种类霉菌的重要依据。霉菌菌丝和孢子的宽度通常比细菌和放线菌粗得多。常是细菌菌体的几倍到几十倍 ，因此，用低倍显微镜即可观察。观察霉菌的形态有多种方法，常用的有下列三种：直接制片观察法、载玻片培养观察法，玻璃纸培养观察法。三实验器材1菌种：黄典霉 青霉 产黄青霉 黑根霉2溶液与试剂：吕氏美蓝染色液 蒸馏水3仪器或其他用具：显微镜 载玻片 盖玻片 接种环 滤纸四实验步骤1在载玻片中央加一滴吕氏碱性美蓝染色液，然后按无菌操作用接种环挑取少量霉菌放在吕氏碱性美蓝染色液中，混合均匀。2用镊子取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下使其盖在菌液上。3将制片放置约3MIN后镜检，先用低倍镜，后用高倍镜，观察霉菌的形态。五结果六思考：霉菌的孢子有哪些形态。实验五 微生物的分离纯化一目的要求掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化微生物的基本操作技术二基本原理从混杂的微生物群体中获得只含一种工某一株微生物的过程为微生物的分离与纯化。常用的方法有：1简易单细胞挑取法 它需要特制的显微镜操纵器或其它显微技术，因而其使用受到限制。简易单孢子分离法是一种不需要显微单孢操纵器，直接在普通显微镜下利用低倍镜分离单孢子的方法，它采用很细的毛细管吸取较稀的萌发的孢子悬液滴在培养皿盖的内壁上，在低倍镜下逐个检查微滳，将只含有一个萌发孢子的微滴放在一小块营养琼脂片，使其发育成微菌落，再将微菌落转移2到培养基中，即可获得公由单个孢子发育而成的纯培养。2平板分离法该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化，其基本原理包括两方面：（1） 选择适合待分离微生物生长条件，如营养、酸碱度、温度和氧等要求或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其它微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。（2） 微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落，可以是由一个细胞繁殖而成的集合体，因此可以通过挑取单菌落而获得一种纯培养，获取单个菌落的方法，可通过稀释涂布平板或平板划线等技术完成。三器材1菌种：米曲霉2培养基：牛肉膏蛋白胨培养基 马铃薯培养基3溶液或试剂：试管、三角瓶、琼脂4仪器或其他用具：无菌玻璃棒、无菌吸管、接种环、无菌培养基、样品四操作步骤平板划线分离法1倒平板：按稀释涂布平板法倒平板，并用记号笔标明培养基名称，样品编号和实验日期。2划线：在近火焰处左手拿皿底，右手拿接种环，挑取样品悬液一环在平板上划线。划线的方法很多，但无论采用哪种方法，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使之形成 单个菌落。常用的划线方法有下列二种：（1） 用接种环以无菌操作挑取样品悬液一环，先平板培养基的一边作第