预防兽医学技术-PCR基因克隆实验指导.doc

预防兽医学实验技术一（基于PCR的基因克隆）PCR克隆常用技术一、用氯化钙制备新鲜的大肠杆菌感受态细胞二、质粒的转化三、PCR四、琼脂糖凝胶电泳五、阳性转化子的快速鉴定六、质粒DNA的小量制备七、如何进行限制酶切反应八 附：基因工程基本知识简介(一) 基因工程宿主菌(二)、基因工程载体与质粒(三)、基因克隆的连接(四)、关于DNA的去磷酸化 (五)、质粒及其转化菌命名基因克隆将PCR产物克隆于T载体中基因克隆的方式有多种，其中以PCR的方法先对目的基因进行扩增，然后将PCR产物连接到T载体中是应用最普遍的一种方法。常用的PCRDNA多聚酶（如：Taq, Taq Plus等）在DNA双链分子末端有不依赖于模板的延伸活性，其PCR产物的末端并不是平端，而是在3端伸出一个碱基，形成3凸端，3凸端的碱基主要A，因此，PCR产物的克隆大多使用T载体。但少数DNA DNA多聚酶并无此活性，如Pfu酶，则PCR产物为平端，则需在PCR扩增最后延伸阶段加入Taq酶，使PCR产物的3端再加一个A。另一方式是在PCR引物的5端加上酶切位点，PCR产物酶切后直接克隆到载体相应的酶切位点之间。TA克隆的整个过程如下：1 基因扩增（PCR或RTPCR）：过程包括目的基因的扩增及扩增产物的电泳鉴定二个步骤2 PCR产物的回收（过程包括DNA的琼脂糖凝胶电泳、目的DNA条带的回收及回收产物的电泳鉴定三个步骤）。3 PCR产物与T载体连接：1h-过夜4 连接产物转化于DH5受体菌，12-16h5 阳性转化子的筛选：PCR法6 质粒的提取、鉴定： 试剂盒提取、酶切鉴定7 菌种、质粒的保存：如果只是克隆某一个基因，在一般情况下挑选三个阳性克隆即够了。鉴定好的克隆要妥当保存：必须保存一份质粒、同时保存菌种则更好。质粒与菌种的命名要规范、一致，同时在保存管上记录好时间。细菌在10-15%的甘油中，在-20可保存2-3年，在-70则可长期保存。这可用于菌种的保存。如果欲克隆的基因有多态性，一次又不能全部进行序列测定，则可先将快速鉴定的阳性转化子保存或快速提取质量保存，分批次测序鉴定。8 基因测序：基因测序一般送质粒或携带质粒的细菌至测序公司进行。一般每个反应可测定出800bp，测序质量好的常可读出900bp甚至1000bp。注：从公司返回的结果时常见到张冠李戴者，如果同一个基因的克隆同时送几个去测序出现这种情况，就难于辨别开。因此，同一个基因的不同克隆送至同一公司时，送两个时送正反向克隆各一个为宜。三个以上的克隆则要同时测序，可将各个克隆的命名取得相差大些以下为PCR克隆常用技术一、用氯化钙制备新鲜的大肠杆菌感受态细胞下面的方案常用于成批制备感受态细菌，这些细菌可使每微克螺旋质粒产生5x106-2x107个转化菌落，这样足以满足所有在质粒中进行的常规克隆的需要。该方法完全适用于大多数大肠杆菌菌株。1. 从于37培养16-20小时的新鲜平板中挑取一个单菌落（直径mm），转到一个含有200ml LB或SOB培养基的500mL盐水瓶中。于37剧烈振摇培养约小时。为得到有效转化，活细胞数不应超过108细胞ml，可每隔20-30分种测量OD600值来监测培养物的生长情况。在菌株与菌株之间，600值和每毫升中活细胞数间的关系变化很大，因此有必要通过测量特定大肠杆菌菌株的生长增减物在生长周期的不同时相的600值，并将各稀释度的培养物铺于无抗生素的琼脂平皿以计算每一时相的活细胞数，从而使分光光度读数得到标化。（在常用的受体菌中：DH5、JM109和BL21（DE3）中，眼观密度的高低以DH5JM109BL21（DE3）为宜）2. 将细菌转移到一个无菌250ml离心管中，在冰上放置10分钟，使培养物冷却至。于 6000转/分离心10分钟，以回收细胞。切记：下述所有步骤均不能有DNA污染、所用耗材均不能有DNA污染。3. 弃上清，将管倒置（于灭菌吸水纸上）以使最后残留的痕量培养液流尽。4. 以1/10培养物体积的冰预冷的0.1mol/L （或75mM）CaCl2重悬每份沉淀，放置于冰浴上10min。5. 于以6000转/分离心10分钟，以回收细胞。6. 弃上清，将管倒置（于灭菌吸水纸上）以使最后残留的痕量液体流尽。 7. 重复58步骤一次8. 每100ml初始培养物用2ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl2重悬每份细胞沉淀。将重悬物置冰水中，并于此时放置12-24小时（注：5小时后可进行转化，以初步观察感受态的转化率），再加入30%的无菌甘油2ml，混均后将细胞分成小份，放于-70冻存。Dagert和Ehrlich(1979)曾表明细胞可以于在CaCl2溶液中保存24-48小时，在贮存的最初12-24小时内，转化效率增加倍，然后降低到初始水平。1 注意事项： 细菌生长至要求的密度后，立即置冰水中；所有试剂（4冰箱过夜或置冰水中）、耗材（20）均需预冷；整个操作过程均应使细菌悬液不超过4；离心前应先开机制冷。 菌种划平板、挑菌落，培养应严格无菌，在以后的过程中可以在普通环境中操作，但应注意不被基因污染 从DH5、JM109中提取的质粒质量好，用于一般的基因操作。JM109的质粒产量比DH5的高。BL21（DE3）菌质粒产量高，但质量不好，一般不用于基因操作，仅将其作表达外源蛋白之用。 如果怀疑菌种有污染，则挑菌落培养时，同一个菌落除用无抗性的LB培养外，还应同时以加有抗菌素的LB进行培养，而后者不应该有细菌生长二、质粒的转化1. 取4或70保存的感受态（可以用手捂化，并在没有完全融化前置冰水中），置冰水中，向感受态中加入待转化的（体积5l（感受态体积的1/20）,25ng/100l感受态），以指轻弹小管混匀，在冰水中放置30分钟。一般转化连接物用感受态100l、转化质粒用20l感受态即可。 2. 将管放到预加温到42的循环水浴中的浮子上(无循环水，可轻轻搅拌热水)，恰恰放置90秒，不要摇动小管。 3. 快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却分钟。 4. 每管加感受态体积4倍量的LB培养基。用水浴将培养基加温至37，然后将管转移到37摇床上，温育45分钟细菌复苏（表达质粒编码的抗生素抗性标记基因）。 5. 将适当体积（以涂布后液体不在平板上流动、且能将平板涂布均匀为度，一般每个90mm平板可涂布200l）已转化的感受态细胞涂布到相应抗生素的LB琼脂培养基上。用一无菌的弯头玻棒轻轻地将转化的细胞涂到琼脂平板表面。如在一个90mm平板上铺200l以上的感受态细胞，应离心浓缩细胞（转连接产物应浓缩，若转化保存的质粒，则取50200l直接进行转化即可）。每个平板可涂布量的多少，还与平板保存的时间有关，清鲜制备的平板可涂布的量少，而制备时间较长的，因水份蒸发，则可多涂涂布些6. 倒置平皿，于37培养，12-16小时后可出现菌落。如检查氨苄青霉素抗性，用转化细胞铺增板时密度较低（每个90mm平板不超过104菌落），于37培养平板时不应超过20小时。氨苄青霉素抗性的转化可将内酰胺酶分泌到培养基中，迅速灭活菌落周围区域中的抗生素。这样，铺平板时密度太高或培养时间太长都会导致出现对氨苄青霉素敏感的卫星菌落。在选择培养基中不用氨苄青霉素而改用羧苄青霉素，以及将抗生素浓度从60g/ml增至100g/ml，可使情况有所改善，但不能彻底根除之。以上为质粒转化的标准程序，不同的质粒可作适当的改动。在常见的Amp+和Kan+抗性质粒中，Amp+抗性质粒可从第一步直接跳到第5步, 转化效率在多数情况并不降低。若Kan+抗性质粒（非连接物），则第四步的时间可缩短。三、PCR聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)，即利用DNA聚合酶通过引物延伸DNA的某个特定的区域而进行的重复双向DNA合成。其过程共包括模板DNA变性、退火和延伸三个步骤。每一循环的产物可作为下一个循环的模板, 这三步周而复始地循环进行使被扩增的DNA片段的量呈指数级增加。这样经过的一定数量的循环后，可得到大量复制的特异性DNA片段。利用这一技术可以很容易将一段基因复制为原来的十亿甚至一千亿倍。 在PCR管中按如下PCR反应体系配制反应混合物*：10反应缓冲液 5l4种dNTP混合物 各200umol/L 上下游（或称正反向）引物 各50200pmol模板DNA 10010000个分子 加双或三蒸水至 50ul将PCR管置PCR仪上，按预先设计设置好各反应参数。先加热至9395作用25分钟进行预变性，一般94 2分钟即可。然后乘热加入12.0的DNA聚合酶，按设置好的程序运行即可。反应完毕，取5-10l以琼脂糖电泳进行鉴定(如图所示)。 反应程序参数为：DNA的预变性（一般为94,25min）和循环过程中的变性、退火和延伸 变性：温度为9398、时间30S60S不等，但一般94、30S即可 退火：温度为3772度不等，时间30S60S，多数情况下30S即可 延伸：温度多用72（少数DNA聚合酶要求不同的温度，按产品说明书即可）。延伸时间短的可为零、长的可达十几分钟。这主要与扩增的DNA片段的长度有关、也与所用的DNA聚合酶有关。 循环次数：10-45个循环，这决定于模板的分子数和扩增效率。Taq 和Taq Plus的延伸速率为2000bp/S，Pfu的则为1000bp/S。在实际工作中延伸时间一般比理论时间要长些，以保证扩增效率。如500bp左右的DNA片段用Taq 和Taq Plus扩增、延伸30S足够了，而100bp的DNA片段的扩增延伸时间可设为0，因为为变性温度时，DNA酶有延伸活性，在温度从变性温度上升至延伸温度时，100bp的长度实际上已合成完毕，为保险起见设为5-10S，整个实验时间也长不了多少。注： 引物：是与扩增DNA片段两端序列互补的一对寡核苷酸片段。一般研究者自己设计，由生物公司合成。 DNA模板(Template): 模板可以为纯化的基因组或质粒DNA；由RNA反转录得到的cDNA；或未经纯化的粗制生物样品，如细菌培养液、菌落或噬菌斑等。 DNA聚合酶：是一类耐热的DNA聚合酶，有多种酶供应，如Taq、Vent、Pfu、Taq Plus。检测多用Taq DNA聚合酶，而基因克隆则多用Pfu和Taq Plus。 dNTP：即4种脱氧核糖核苷酸，dNTP的使用浓度一般为50200umol/L，4种dNTP的浓度相等( 等摩尔配制)。四、琼脂糖凝胶电泳DNA琼脂糖凝胶电泳技术可用来确定DNA 分子的大小、DNA的分子构象和DNA的含量以及分离纯化DNA分子片段，还可用来检测DNA溶液中是否含有不需要的核酸。不同浓度琼脂糖可形成孔径不同的凝胶，DNA分子带负电荷，在电场作用下，DNA分子从负板至正极移动。DNA 分子在琼脂糖凝胶电泳中泳动的速率与电压和凝胶阻力的大小相关。一般情况下，单位长度双链DNA 带有几乎相等的电荷，故在一定电场强度下，DNA 分子的迁移速度取决于凝胶的阻力，即DNA 分子本身的大小和构型以及琼脂糖凝胶的浓度。DNA 分子的迁移速度与相对分子量的对数值成反比关系，具有不同长度的DNA 片段由于其泳动速度不同而得到分离。具有相同一级结构但构型不同的DNA 分子也可以通过这种方法进行分离。溴化乙锭(EB)是一种荧光染料，在紫外光照射下可发出波长590nm 的红色荧光，DNA 分子与EB 形成荧光络合物后，其发射的荧光比原来要增强数十倍，常用来观察凝胶中DNA 条带的位置。琼脂糖凝胶的配制常用的缓冲液有两种：TBE和TAE。TBE缓冲能力强，但用TAE电泳条带更整齐些，即使100bp的DNA分子用0.75%的琼脂糖凝胶电泳效果也很好。常用的DNAMarker均是线性双链的DNA分子，因此，在一般情况下用该技术确定DNA 分子的大小时，也仅能用于线性双链的DNA分子（当然也有RNAMarker和超螺旋质粒Marker，但均只用于特定的实验），如PCR产物、酶切后的质粒等。而用普通的DNAMarker与质粒同时进行电泳，是不能确定质粒的大小的。当没有酶切时，质粒的电泳鉴定不必用DNA Marker质粒构型与电泳鉴定：质粒提取后一般用进行琼脂糖电泳进行鉴定。由于构型的不同，同一质粒的泳动速率也不一样。质粒一般存在三种构型：超螺旋、线性与开环。泳动速率是：超螺旋线性开环。因此，超螺旋的质粒在电泳图上处于最前面。从DH5、JM109等菌中提取的质粒以超螺旋构型的为主，仅有少数开环的，因此，质粒以单酶切线性化时，电泳图DNA条带从主要位于超螺旋的位置变成线性质粒的位置。从而BL21（DE3）等菌三种构型的均有，且超螺旋构型的比例不高。指示剂:核酸电泳常用的指示剂有溴酚兰和二甲苯青及银染色.溴酚兰在碱性液体中 呈紫兰色，在0.6%、1%、1.4%和2%琼脂糖凝胶电泳中，溴酚兰的迁移率分别与1Kb、 0.6Kb、0.2Kb和0.15Kb的双链线性DNA片段大致相同.二甲苯青的水溶液呈兰色，它在 1%和1.4%琼脂糖中电泳时，其迁移速率分别与2Kb和1.6Kb的双链线性DNA大致相似.另外，应注意EB也能泳动，其泳动方向与DNA的相反，因此，当电泳时间较长时，远离加样孔一端的凝胶中EB浓度明显降低，因此，欲观察较小的DNA分子，电泳时间不能过长。如果，电泳后，小子量的DNA分子染色过浅，可将胶放置EB溶液中染色10分钟后观察。五、阳性转化子的快速鉴定目的基因与载体的连接物所形成的转化子既可能是含有目的基因的转化子和也可能是载体的转化子，有时转化子的阳性率还不高，这要求对转化子进行快速鉴定，以挑选出含有目的基因的转化子。即使通过互补(蓝白斑筛选)挑选的白色菌落也须进行鉴定。快速鉴定的方法有：、PCR鉴定法；、快速提取质粒电泳法；直接解裂细菌电泳法。一、 PCR鉴定法：因PCR模板的不同可分为三种：、 先挑选转化子在另一平板上划线，然后刮菌苔进行PCR；、 于无菌1.5ml离心管中进行培养，然后取少量菌液进行PCR，或取少量菌液离心后进行PCR；、 当转化子长得足够大，且没有卫星菌落时，可在菌落的中央直接刮菌落进行PCR（注意不能刮琼脂，以防琼脂残留的未转化的目的基因的污染）PCR的循环圈数1015圈就足够了，不要超过20个循环。既可以用载体通用引物、也可以用特异引物，或通用引物特异引物混合使用。通用引物特异引物混合使用既可鉴定转化子是否为阳性，也可达到快速鉴定目的基因插入方向的目的。二、 快速提取质粒电泳法载体连接入目的基因后，分子量增大，电泳速率降低，通过比较它们电泳速率的大小，挑选分子量大的相应的转化子，然后作进一步的鉴定。具体如下： 于1.5ml离心管中培养0.5ml转化菌或取0.5ml转化菌培养物于1.5ml离心管中； 加入0.5ml酚：氯仿，进行抽提。或将菌液浓缩到100l后加入100l酚：氯仿进行抽提。 12000g5min，取上清加等量异丙醇，混匀后12000g5min沉淀DNA（前者）。或直接进行电泳（后者） 弃上清，用70%的乙醇洗涤DNA。 悬浮DNA后，进行电泳三、 直接解裂细菌电泳法该方法快速鉴定原理与二相同，均是通过比较质粒的电泳速率、挑选分子量大的相应的转化子。直接对细菌进行解裂，然后取解裂物进行电泳。六、质粒DNA的小量制备从细菌中提取和纯化质粒，要除去细菌的蛋白质、基因组、RNA和糖类、脂类等杂质。最常用的是碱裂解法。先用强碱（NaOH）将细菌裂解，此时，细菌内的各种物质均处于可溶状态，质粒、细菌基因组均处于变性状，然后加酸中和，此时，SDS蛋白质发生相互作用、并且与来不及复性的细菌基因组包裹在一起，在离心的作用下而沉淀，而质粒因分子量小，酸中和后、复性快，则保持可溶状态而留在上清中。溶液中残留的少量蛋白质则在酚氯仿抽提作用下而除去。目前，质粒的提取多用试剂盒，但掌握手工提取的原理和方法有助于理解基因工程常用的一些基础性的实验技术。 ， 一、细菌培养：挑取单菌落，接种到35ml含相应抗生素的LB中，37震荡培养过夜（1014h）。 注：（1）最好在细菌的对数生长晚期时提取。过早则质粒得率太低，过晚则会有杂菌污染，或得到的质粒杂质太多，影响其后的酶切、电泳等处理； （2）某些严紧型质粒(如pBR322、pET28等)需要在进入对数生长中期后，在细菌培养物中加入氯霉素继续培养，以提高产量。 二、细菌的收获：将1.5ml菌液倒入微量离心管中，10000g离心30秒，弃培养液。上清要务必吸取干净，否则会影响质粒的质量。 三、悬浮细菌：细菌沉淀重悬于100l(或130l) 溶液。剧烈振荡，使之完全分散（务必使细菌沉淀完全分散，以利于碱液作用充分）。溶液：50mmol/L葡萄糖（可由NaCl代替，以利于储存），25mmol/LTris&HCl(pH8.0)，10mmol/LEDTA(pH8.0) 四、细菌裂解：加溶液200l(或260l)，颠倒混匀后、将离心管置冰上。此时，菌体裂解溶液变得很粘稠、清亮；（溶液：0.2mol/LNaOH，1%SDS）五、加150l（或200l）用冰预冷的溶液，轻微颠倒震荡混匀，此时，出现白色絮状沉淀 。置冰上35分钟。(溶液：5mol/乙酸钾60ml，冰乙酸11.5ml，水28.5ml )六、12000g离心5分种，将上清转移到另一离心管中。 七、加入等体积的Tris饱和酚氯仿混合液，剧烈震荡混匀。 八、12000g离心2分种，将上层液体转移到另一离心管中。 注：为了保证不吸出下层液体，可以先离心30秒，然后将上层与少量下层液体吸至另一离心管，离心5分种，再转移上层液体。切勿混入下层液体。 九、加入两倍体积的无水乙醇，颠倒混匀后，室温静置5分钟。12000g离心分钟，小心弃上清液。 沉淀即含质粒DNA 十、加0.8ml70%乙醇洗涤DNA沉淀后，小心地吸去上清。在空气中静置510分钟，待沉淀干燥后，溶解于50l含RNAnase A的高压灭菌的水中。 室温作用30min后，电泳检测或置20备用。七、如何进行限制酶切反应1DNA的酶切鉴定 根据质粒或DNA片段(如PCR产物)的酶切位点的个数，可计算出酶切后出现的DNA片段的多少和大小。因此，可结合的酶切和电泳对DNA进行鉴定。酶切鉴定反应一般总反应体积常用20l，DNA量用0.1-1.0 g。在一微量离心管中分别加入以下反应组份 1、10反应Buffer2 l 2、DNA. 0.1-1.0 g 3、限制酶2-5 4、水补至20l将上述各组份混匀后(多以指尖轻弹管壁、然后离心的方式，也可用移液器吸吹的方式进行，但注意不要将溶液粘在管壁上)，置适当温度(多为37 )作用1-4小时，进行琼脂糖凝胶电泳鉴定. 37作用期间，可倒好琼脂糖凝胶，以节约时间。 DNA的酶切量依鉴定目的而定，如果是线性化则酶切0.1-0.2g较为合适，但如能切出一定长度的DNA片段，则需要量大些，如将0.5kb的片段克隆在pUC19中，pUC19为2.69kb, 则重组质粒为3.19kb, 目的片段占重组质粒15.7%, 如重组质粒用0.5g, 则目的片段为78ng。此酶切量电泳两次，足够保证电泳所需要的量。电泳时间一般以20-30min为宜。EB的泳动方向与DNA的泳动方向相反，在胶的加样孔的另一端当电泳后EB浓度会慢慢降低(当EB直接加入到胶中时)，因此，欲观察较小的DNA片段时，电泳时间应短(可先电泳约10min观察一次，再电泳一段时间后观察大的片段)，或是先电泳、后用EB染色。2载体的酶切：酶切常见载体时，使用30l的体系， 切0.3g左右的量较为合适。酶切后，电泳10l确定是否酶切彻底。一次电泳结果不好，此酶切量还可保证第二次电泳。电泳时，将未酶切的质粒与酶切产物一起同时进行电泳，电泳量应保持一致(如约均为0.1g)。对于载体的双酶切，因此，MCS上的各酶切位点很近，一个位点被切开与二个位点被切开的电泳图是不会有区别的，仅电泳双酶切物不能断定两个酶是否均起了作用。如有疑问，可进行双酶切的同时，进行两个酶的单切；或是目的基因同时以同样的条件进行酶切，电泳鉴定目的基因被完全已酶切。一般30-50ng的DNA量在凝胶呈像系统上观察即可很清楚。因此，鉴定重组质粒进行酶切时，欲观察一定大小的DNA片段、酶切质粒用量视片段的大小和观察的敏感性而定。但直接对提取的质粒进行电泳鉴定，因质粒的有3种构型，各构型的量不一，因此，电泳质粒时用量要大些，常见的质粒用0.5g较为合适。pUC、pGEM等高拷贝质粒小量提取的产量(1.5ml培养物)一般在15-20g之间， 这何作为载体酶切量的参考。八 附：基因工程基本知识简介(一) 基因工程宿主菌1 实验室基因工程常用的宿主菌有：DH5、JM109、BL21（DE3）， Rosta等。这些菌株均是由E.coli K12菌株衍生而来，并经过了人工改造。如：DH5、JM109基因组中已整合了LaZ基因的lacZ C端的编码序列，可利用互补原理进行转化子的初步筛选。而BL21（DE3）， Rosta已整合了T7 polymerase 基因，是原核表达宿主菌，可用于蛋白质的基因工程表达。（pBV220原核表达质粒本身已具备表达的全部表达元件，在常见的所有宿主菌中均可表达外源基因）。2 只要感受态效率高，任一菌均可用于基因克隆(连接物的转化)。但从DH5、JM109等专用于基因克隆的宿主菌中提取的质粒的质量要优于从表达菌株(如BL21（DE3）)中提取的质粒。从DH5、JM109等菌中提取的质粒以超螺旋构型的为主，仅有少数开环的，而BL21（DE3）等菌三种构型的均有，且超螺旋构型的比例不高。3 从DH5、JM109提取的质粒质量均高(一般认为从DH5中提取的最好)，但JM109生长较快，且质粒产量也较DH5的高，因此，在多数情况下基因克隆用JM109更合适些。4 一些种类的表达宿主菌多是一个系列，如BL21系列包括BL21、BL21（DE3）和BL21（DE3）LySs三个菌种，BL21是基础，基因组中没有整合T7 polymerase 基因，而另外两种均已整合了，而BL21（DE3）LySs菌中还整合了LySs基因，LySs对T7 polymerase有抑制作用，构建该菌的目的是使整合了T7 polymerase基因的菌株更加稳定。更多的详情，请参考一些工具书及提供这些菌株的供应商的说明，如pET操作手册。DH5、JM109生长速度及菌落的大小均是从低到高排列。(二)、基因工程载体与质粒1 载体可分为克隆载体和表达载体，后者又可分为原核表达和真核表达载体两大类。载体的基本元件是复制子、筛选标志(抗性基因)和多克隆位点(MCS)。表达载体在MCS的两侧有表达所需要的元件(启动子和终止子)。真核表达载体可分为酵母、哺乳动物细胞和植物表达载体等。只要酶切位点合适，大多数表达载体均可作为克隆载体2 常用克隆载体：pUC系列(pUC19、pUC18)、pGEM系列(pGEM3ZF、pGEM5ZF、pGEM7ZF)、pBleuskcript KS(+) 、pKF19 pKF3等。这些载体大多均含有lacZ基因的N端146个aa的编码序列，这些载体可以用互补对重组质粒进行初筛。pKF19为Kan抗性、pKF3为氯霉素抗性。其它均为Amp抗性。3 常用原核表达载体：pET28、pET20、pET32、pET30等系列、pGEX系列、pEZZ18以及pBV220等4 常用真核表达载体：pcDNA3、pIRESNeo1、pDisplay、pVAX1、pSV。5 上述载体的图谱、核酸序列、特性、用途等均可从网上找到(GenBank、供应商网站及一些专业网站)。掌握这些资料对工作会带来极大的方便.6 质粒构型与电泳鉴定：质粒提取后一般要进行琼脂糖电泳进行鉴定。由于构型的不同，同一质粒的泳动速率也不一样。质粒一般存在三种构型：超螺旋、线性与开环。泳动速率是：超螺旋线性开环。因此，超螺旋的质粒在电泳图上处于最前面。从DH5、JM109等菌中提取的质粒以超螺旋构型的为主，仅有少数开环的，因此，质粒以单酶切线性化时，电泳图DNA条带从主要位于超螺旋的位置变成线性