1、胰岛自身抗体检测技术新进展.doc

胰岛自身抗体检测技术新进展1型糖尿病(TIDM)患者血清中存在多种自身抗体(即胰岛自身抗体)，如胰岛细胞抗体(ICA)、谷氨酸脱羧酶抗体(GADA)、蛋白酪氨酸磷酸酶自身抗体2(IA-2A)、胰岛素自身抗体(IAA)、锌转运体8自身抗体(ZnT8A)等等。检测这些自身抗体对于T1DM的发病预测、诊断和鉴别诊断、治疗监控和预后评估有着重要的临床意义。由于ICA检测难以标准化，目前应用受到限制。而GADA和IA-2A检测方法经历的多次改良和标准化，目前已能为临床诊断和治疗监控、以及发病预测提供有力的佐证。 先前的检测方法经历了免疫印迹法、免疫荧光法、免疫沉淀酶活性分析法等，终因操作繁琐耗时，灵敏度和特异性差而极少应用于临床。目前国内外临床应用得较多的是酶联免疫吸附分析法(ELISA)和放射免疫分析法(R1A)，国际标准化的检测方法是放射配体法(RLA)。 1酶联免疫吸附法分析法 酶联免疫吸附法分析法(ELISA)检测GADA和IA-2A在国内外各级医院应用较广，目前检测法主要基于3种不同原理设计。 包被抗原法(直接法) 将GAD抗原加入到96孔酶免板的微孔内，室温放置过夜。然后各孔加入封闭液，再次室温放置过夜。洗涤，加入稀释过的血清，室温反应60min，洗涤，加入连接碱性磷酸酶的羊抗人免疫球蛋白抗体，室温反应60min，洗涤。加入对硝基苯酚磷酸盐溶液，37作用30min，加入NaOH溶液终止反应。在酶免仪上于405nm处检测吸光度，与标准品对照，即可知待测血清GADA水严。因反应模式限制，该方法最终灵敏度和特异性不高。 包被抗体法(间接法) 将GADA(1A-2A)单克隆抗体包被于96孔微量滴定板内，洗涤，加入纯GAD(或IA-2)抗原，4避光固定过夜。洗涤，加入预稀释的血清，室温作用90min，再加入连接碱性磷酸酶的抗人免疫球蛋白，室温作用60min。洗涤，加入对硝基苯酚磷酸盐溶液，37作用15min，加入NaOH溶液终止反应。在酶免仪上，于405nm处检测吸光度，与标准品对照，即可知待测血清GADA(或IA-2A)水平。该方法与直接法相比，灵敏度和特异性有所提高。 应用亲和素和生物素放大系统的ELISA法 亲和素一生物素系统在ELISA中的应用有多种形式，可用于间接包被，亦可用于终反应放大。可以在固相上先预包被亲和素，应用吸附法包被固相的抗体或抗原与生物素结合，通过亲和素一生物素反应而使生物素化的抗体或抗原固相化。这种包被法不仅可增加吸附的抗体或抗原量，而且使其结合点充分暴露。另外，在常规ELISA中的酶标抗体也可用生物素化的抗体替代，然后连接亲和素 一酶结合物，以放大反应信号。 “前放大”模式是放大了抗原包被量或使抗原表位充分暴露。其原理是：第一步GAD生物素(IA-2-生物素)与抗生蛋白链菌素包被的微孔板结合，洗涤后，与样品中GADA(或IA-2A)结合。清洗后，过氧化物酶(HRP)标记的抗人IgG 与GAD(或IA-2)抗体结合。HRP复合物与ABTS底物反应并检测吸光度。颜色的深浅反映了GADA(或IA-2A)水平。该方法灵敏度和特异性好，与标准的 放射配体检测法结果判定上总体一致性良好，特别对厂低抗体水平的正常人标本以及高抗体水平的T1DM标本符合率高。 “后放大”模式是放大了显色信号。其原理是：将GAD(或IA-2)抗原包被在ELISA板上，与血清中的GADA(或IA-2A)结合，洗涤，再加入结合生物素的GAD(或IA-2)与固定好的复合物结合。这样GAD(或IA-2)BIOTIN与GADA(或IA-2A)水平成正相关。加入链酶素过氧化物酶结合，再加入底物TMB显色，读取450nm F的吸光度，与标准曲线对照，即可得到血清中的GADA(或 IA-2A)水平。该方法批内CV为2.4-4.2%，批间CV 3.8-25.6%，灵敏度和特异性好。 这两种放大模式原理不尽相同，但在操作程序上有很多相似之处：都采用了温育振荡方式(200RPM)进行抗原抗体反应，这样能提高抗原抗体分子接触的机会，使检测灵敏度提高。同时洗板是两种方法的关键步骤，如果清洗不充分会导致检测精密度下降和本底吸光度上升。我们的研究显示不同原理设计的ELISA试剂盒检测灵敏度和特异性有显著差别。 2放射免疫分析法 放射免疫法检测GADA和IA-2A主要采用采用氯胺T标记法，用125I标记GAD(或IA-2)与血清在分析缓冲液中4作用过夜。加入蛋白A琼脂糖后于4放置1h，沉淀经洗涤3次后进行放射计数。以阳性参考血清为标准，待测血清的活性定义为阳性血清的沉淀计数百分率。Masuda等采用此方法检测了217例不同年龄与病程的IA-2A，发现阳性率为47%(103/217)，其中新发病的TIDM 阳性率57%(64/113)。有2.5%(1/40)的Graves病患者用此方法检测山IA-2A 阳性，T2DM患者IA-2A阳性率2.5%(5/204)。该方法与标准的放射配体检测法结果相关系数r为0.78。我们的研究显示采用RSR放射免疫试剂盒检测GADA与放射配体法致率达79.3%。由于采用氯胺T标记法前，必须获得高纯度及高活性的胰岛自身抗原。且在标记过程中，有可能导致胰岛自身抗原的损伤或空间构象的改变，从而降低方法的灵敏度，故该法较少应用标准化分析。 3放射配体检测法 主要检测方法是采用人GAD65(或IA-2)cDNA插入到原核表达质粒pcDNA SP6启动子下，构建重组质粒，并转化宿主菌EcoliDH10B后，通过原位杂交筛选出含重组质粒的阳性菌落，碱法提取质粒进行酶切和测序鉴定。将连接正确的重组质粒在转染的EcoliDHl0B中繁殖扩增，并抽提纯化质粒。GAD65(或IA-2)的质粒在无蛋氨酸的兔网织红细胞裂解液体系中，加入35S标记蛋氨酸(35S-Met)，经由体外转录/翻译直接得到35S标记GAD65(1A-2)抗原。采用Sephadex柱凝胶层析或三氯醋酸(TCA)沉淀等方式去除游离的35S-Met。35S标记GAD65(IA-2)与血清旋转孵育后，用蛋白A-琼脂糖沉淀抗原抗体复合物。沉淀物经TBST缓冲液充分洗涤后，加入闪烁液置于液闪仪上计数，结果以抗体指数或国际标准单位形式报告。目前该方法是国际上检测胰岛自身抗体的标准化方法，我们于1996年在国内首次建立了该方法。 2000年，Woo等报道了一种新的平板放射配体法检测胰岛自身抗体，其采用微孔平板对抗原抗体进行孵育，所需血清量小，适宜于大规模儿童人群的筛查；采用了Millipore分离技术取代了传统的试管法洗涤沉淀复合物，使洗涤更加充分完全，更易于自动化和大样本检测。目前大多数欧美发达国家的权威实验室均同时建立了该检测法，我们于2004年在国内首次建立了该方法。 4胰岛自身抗体检测的标准化 为了使各实验室检测胰岛自身抗体的结果具有可比性，以降低室间检测结果的变异系数。近几年，国际标准化重点已放在如何采用有效通用的标准物，以统一的国际标准化单位报告结果。目前，由国际糖尿病免疫学会(IDS)与美国疾病预防控制中心(CDC)共同举办的糖尿病自身抗体标准化方案(DASP)机构，专门从事胰岛自身抗体检测标准化评估。通过评估检测方法以及采用新的WHO 国际参考标准物，将结果报告换算成统一的国际单位形式，使各国(地区)实验室间抗体检测结果具有可比性。其方法是50例新诊断为T1DM的患者血清、100例健康人血清以及WHO参考标准物和稀释血清，发往13个国家的53个实验室盲法检测，并在规定时间内回报结果。目前，DASP已成为胰岛自身抗体检测的权威评估机构。我们分别作为国内唯一一家医疗单位参加了2003年和2005年的两次DASP评估，在2003年计估中综合检测质量在全球53个权威实验室中位于第15位，2005年讦估进入第9位，标志着胰岛自身抗体检测水平步入国际先进行列。 5胰岛自身抗体异质性研究 胰岛自身抗体的检测是诊断T1DM的重要依据，而对自身抗体的异质性研究能进一步阐明自身免疫的发生与发展过程。融合蛋白构建技术初步明确了抗体针对胰岛抗原的粗略区域，单克隆抗体封闭技术进一步辩明了抗体识别抗原某一肽段及表位扩展规律。然而，自身抗原具有高度构象和线性不连续的表位，抗体实际识别和接触抗原的特定氨基酸难以确定。利用特异性抗体筛选噬菌体随机肽 展示文库结合位点指导下突变技术，有利于分析构象型的表位，最终有望能鉴别抗体互补结合抗原的关键氨基酸残基。采用生物素化单克隆亚类特异性抗体，并籍助链霉亲合素琼脂糖沉淀剂是目前检测自身抗体亚类同种型的主要手段。单克隆抗体技术可用于区分IA-2AIA-2A。采用蛋白变性剂洗脱或裂解法同样能适用于胰岛自身抗体亲合力的检测。 诸多研究显示，在T1DM前期的患者中，抗体识别自身抗原表位的变化呈 动态扩展。对于GADA，最初出现与GAD分子中段结合特性，并迅速扩展到C端，扩展到N端与发病高风险性相关联；对于1A-2A，直接针对JM区和C末端，多IA-2IA-2表位的反应性抗体存在与疾病进展相关联。目前临床研究显示，自身抗体亲和力指数与抗体的滴度并无相关性，但与随后多种抗体阳性发生率明显相关，具有发病预测价值。多种IgG亚类存在与高滴度的自身抗体水平相关，GADA业类同种型分析未能区分GAD65-Ab阳性的T1DM一级亲属进展者与非进展者。而IA-2A IgG亚类同种型分析能显著改进T1DM风险性评估，且目前发现IgE-IA-2抗体是保护性的指标。 6新的胰岛自身抗体-锌转运体8自身抗体(ZnT8A) ZnT8蛋白 ZnT8属于CDF(阳离子扩散易化)家族，含369个氨基酸。为基因SLC30A8(染色体8q2411)编码，所有的蛋白有着相同的染色体组织结构，即8个外显子和7个内含子。与IGRP等其他糖尿病自身抗原一样，ZnT8是一种6次跨膜蛋白。预测序列在第四和第五螺旋结构中包含丰富的组氨酸区域。哺乳动物与人ZnT8蛋白非常相似(98%保守的氨基酸)，提示其进化过程的高度保守性。 ZnT8表达部位 研究证实，ZnT8mRNA主要表达在胰岛细胞上，激光共聚焦显微分析进一步显示，ZnT8仅定位于胰岛p细胞分泌囊膜上。 ZnT8生理作用 在胰岛素合成中，ZnT8能使锌掺入到胰岛素囊泡山，易化锌胰岛素固相六聚体的形成。分泌性的锌是胰岛细胞和细胞分泌的胰高血糖素以及胰岛素旁分泌和自分泌的调节剂。研究发现，ZnT8表达增高能刺激锌的富集和增加胰岛素分泌Ins1E细胞内锌浓度。而且，ZnT8高表达的细胞显示高的葡萄糖刺激胰岛素分泌(与对照组比较)现象。糖刺激诱导的ATPADP比率增高封闭了ATP依赖钾通道，因此激活浆膜的去极化。导致电压敏感性钙通道开放，钙流出和钙离子浓度增加，胰岛素囊泡与浆膜的融合，引起胰岛素分泌。新近研究发现，锌存在多水平调节通路，如KATP通路、胰岛素合成与储存以及。细胞水平。故目前国际研究认为ZnT8通过影响锌离子浓度而在胰岛素合成和分泌中发挥重要的作用。 ZnT8A 由于ZnT8是一种多次跨膜蛋白，很难在膜外环境维持三级结构，使其检测方法的建立面临挑战。Hutton等于2007年首次采用构建ZnT8融合蛋白技术建立了ZnT8自身抗体的放射配体检测法。即将编码ZnT8C-和N，末端单链分子蛋白结构的序列连接起来，插入到pCDNA31载体中，通过与35S_met、TNTT7快速转录翻译体系，以及凝胶过滤层析法获得35S标记ZnT8。研究发现，60%80%的新发T1MD患者ZnT8A阳性，而在健康对照组中2%，2型糖尿病组