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文档简介

任务二 PCR扩增目的基因 一 实验目的 1 掌握PCR扩增DNA的技术与原理2 学习PCR扩增仪的使用 二 实验原理 聚合酶链式反应是一种体外DNA扩增技术 具有灵敏度高 特异性强 操作简便和应用广泛等特点 PCR工作原理类似于DNA的体内复制过程 是将待扩增的DNA片段和与其两侧的已知序列合成两个与模板DNA互补的寡核苷酸作为引物 引物序列将决定扩增序列片段的特异性和片段长度 标准的PCR过程分为三步 1 模板变性 92 96 双链DNA模板在热作用下 氢键断裂 形成单链DNA2 低温退火 37 65 系统温度降低 引物与DNA模板结合 形成局部双链 3 延伸 72 在Taq酶 在72 左右最佳的活性 的作用下 以dNTP为原料 从引物的5 端 3 端延伸 合成与模板互补的DNA链 三 实验仪器 PCR扩增仪台式高速离心机移液器高压灭菌后的Eppendorf管 0 5mL 电泳仪 四 材料与试剂 1 模板DNA 0 1 g L 用牙签挑取单菌落悬浮到50 L的裂解液中 1 TritonX 100 20mmol LTris HCLpH8 2 2mmol LEDTA 95 温浴10min 10000r min离心5min 取2 L上清液用于总体积50 L的PCR反应 2 TaqDNA聚合酶 5U L 10 扩增缓冲液 dNTP 1mmol L 购买 3 引物 100pmol L 设计并合成与目的DNA两侧互补的引物 五 实验操作 1 准备PCR反应溶液 1 按序将如下成分混合置于Eppendorf管内a 10 扩增缓冲液10 Lb 4 dNTPs8 Lc 引物11 Ld 引物2 Le 模板DNA1 L 10ng f TaqDNA聚合酶 L 2 5U 加水至 终 100 L 2 手指轻弹Eppendorf管底部离心2s 3 加石蜡油50 L封住溶液表面 2 PCR扩增反应 加好样的Eppendorf管置于PCR扩增仪内变性 95 5min95 1min退火 55 45s延伸 72 1min重复循环30次循环结束后72 延伸8min反应完毕 取样置 4 待用 3 结果观察 取样进行琼脂糖凝胶电泳溴化乙锭 EB 染色观察DNA条带 高度灵敏的荧光染色剂染色效果好操作方便稳定性差强致癌剂中度毒性 六 注意事项 1 PCR结果若出现非特异性的扩增条带 有必要进一步优化反应条件 包括改变退火温度和时间 调整Mg2 浓度等 2 PCR反
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