大鼠海马神经元钠离子通道电流的记录与分析.ppt

大鼠海马神经元钠离子通道电流的记录与分析 大鼠海马结构 海马结构位于侧脑室下角底内 是种系发生上比较古老而简单的皮质部分 具有一致的组织结构 细胞分层排列 是研究中枢神经系统解剖和生理的可塑性模型 海马与许多高级神经活动 行为反应以及植物性神经功能有重要关系 一直被视为神经科学研究的模型 海马与学习 记忆关系密切 且对缺血和缺氧 癫痫 衰老 化学损害剂和有害物理辐射等许多致病因素较为敏感 细胞膜离子通道 细胞膜上存在多种类型的离子通道 主要有电压门控离子通道 配体门控离子通道以及机械门控离子通道等 本实验主要讨论使用膜片钳放大器测量门控离子通道的方法 在大鼠海马组织细胞膜上存在多种门控离子通道 电压门控钠离子通道 电压门控钾离子通道以及电压门控钙离子通道等 电压门控钠离子通道 电压门控钠离子通道广泛存在于神经 肌肉等可兴奋性细胞膜上 其激活可导致钠离子快速内流 使细胞去极化 产生动作电位的上升相 主要生理功能是产生可传播动作电位 钠通道在维持细胞兴奋性及正常生理功能上非常重要 而且还是一些药物的作用靶点 如局部麻醉药和I类抗心律失常药 就是分别选择性地阻断神经细胞和心肌细胞的钠通道 达到阻断兴奋性传播和减少细胞兴奋性的作用 电压门控钾离子通道 钾离子通道是人体内分布最广 种类最多的一种离子通道 电压门控钾离子通道对所有可兴奋细胞的功能是必需的 主要控制动作电位的形状 形成动作电位 调节动作电位的频率 调整静息膜电位 在调节神经递质释放 心率 胰岛素分泌 神经元兴奋性 上皮电解质传导 平滑肌收缩 细胞体积调节等细胞信号转导过程中起着重要作用 膜片钳技术 膜片钳技术是一种通过微电极与细胞膜之间形成紧密接触的方法 采用电压钳或者电流钳技术对生物膜上离子通道的电活动 尤其是可对单通道电流 进行记录的微电极技术 膜片钳技术的基本操作过程 首先在细胞膜表面 给电极间断施加负压 这样在玻璃微电极壁与膜之间就形成了紧密接触 术语叫做高阻封接 GigaohmSeal 其电阻达109 1G 以上 以使离子不能从玻璃电极尖端与膜之间通过 只能从膜上的离子通道进出 如果轻轻的回撤电极 细胞膜可被撕下一片 能记录着小片膜的跨膜离子电流 如果运气好的话 这片膜上也许只有一个离子通道 可以记录单通道电流 膜片钳技术的基本记录模式 膜片钳技术共有四种基本记录模式 其他的记录模式都是在此基础上组建发展衍变而来的 这四种记录模式为 细胞贴附记录模式 内面向外记录模式 外面向外记录模式 全细胞记录模式 前面三种是单通道记录模式 内面向外记录模式 将电极接触细胞膜 轻轻的给予负压吸引 就形成了细胞贴附记录模式 将电极迅速提起 脱离细胞 因为细胞具有流动性 粘着在电极尖端的细胞膜会自动融合 从而形成一个囊泡 当将电极提出浴液液面而短暂 2S 暴露在空气中 囊泡的外表面会破碎 再次将电极放入浴液 就形成了内面向外记录模式 另外 如果将电极放入低钙溶液中 囊泡的外表面也会破裂 形成内面向外记录模式 外膜向外记录模式 形成细胞贴附记录模式后 采用继续施加负压或者电击的方法打破细胞膜 就形成了全细胞记录模式 在形成全细胞记录模式后 将电极缓缓提起 逐渐脱离细胞 同样由于细胞具有流动性 粘在电极尖端的细胞膜会自动融合 这样细胞膜外面就朝向电极极端外 形成外膜向外记录模式 全细胞膜片钳技术 全细胞膜片钳技术可分为电流固定模式和电压固定模式 前者是在固定电流的条件下检测与其相应的膜电位 例如将电流固定在零时 可检测细胞的自然应答 静息膜电位 自发性膜电位振动或自发性动作电位等 后者是在电位固定的基础上检测钳制电压时的膜电流 全细胞膜片钳技术示意图及其等效电路图 全细胞跨膜总电流 持电位于 80mV 给予从 70mV至 60mV的阶梯去极化脉冲电压刺激 步幅 10mV 刺激波宽160ms 刺激频率0 5Hz 可记录得到CA3区锥体神经元全细胞跨膜总电流 从图中可知 全细胞跨膜总电流既有内向电流成分 又有外向电流成分 内向电流主要发生在刺激初期几毫秒 表现为快速激活和快速失活的特性 之后外向电流成分被激活 内向钠电流的I V曲线分析 分别在1 3 5 7 9min记录不同时间的钠电流 钠电流随时间变化过程 如图可知 钠电流的峰值在3min以后达到较大的较稳定的值 对I V曲线进行分析可知 海马神经元钠电流的激活电位阈值为 60mV 在 30mV时达到电流峰值 在 60mV到 10mV之间电流随电压变化比较明显 在其后电流随电压的变化较小 峰电流大小为 2339 85 1307nA 翻转电位为54 8 6 1mV 实验总结与展望 本实验介绍了运用PC2C膜片钳放大测量器大鼠海马神经元钠离子通道的方法 然后就测量所得的数据做了分析和处理 对大