第十三章生物制品

15 21 27 第十三章 生物制品分析概论 15 21 27 第一节概述 三大主要药物 化学药物 生物药物 中药 15 21 27 15 21 27 一 生物药物与生物制品 1 生物药物 一般是指从动物 植物及微生物提取的 也可用生物 化学半合成或用现代生物技术制得得生命基本物质及其衍生物 降解物以及大分子得结构修饰物等 包括 氨基酸 多肽 蛋白质 多糖 脂质 核苷酸类等 15 21 27 发展过程 第一代 利用生物材料加工制成 第二代 根据生物化学和免疫学原理 应用近代生化分离纯化技术从生物体制取的具有针对性治疗作用的特异生化成份 第三代 应用生物工程技术生产的天然生理活性物质 鱼肝油 胰岛素 重组人生长激素 15 21 27 生物药物 生化药物 生物合成药物 生物制品 从生物体内分离纯化制得得升华基本物质 以及用化学合成 微生物合成或现代生物技术制得得一类药物 利用现代生物技术研制得药物 其中用基因工程生产得药物称基因工程药物 应用普通得或以基因工程 细胞工程 蛋白质工程等生物技术获得的微生物 细胞及各种动物和人源得组织和体液等生物材料制备 用于人类疾病治疗 预防和诊断得药品 来源和生产方法 15 21 27 动植物及微生物提取 分离的天然生物活性物质及半合成得到生命基本物质及其衍生物等 2 生化药物biochemicaldrugs 人纤维蛋白原 凝血酶 胰蛋白酶 肝素 玻璃酸 氨基酸 Pr类 酶 辅酶类 多糖类 脂类 核酸类 15 21 27 应用普通的或以基因工程 细胞工程 蛋白质工程 发酵工程等生物技术获得的微生物 细胞及各种动物和人源的组织和液体等生物材料制备的药品 自动免疫制品 3 生物制品biologicalproducts 其他 血液制品 组织制品等 免疫血清 菌苗 疫苗 类毒素 诊断制品 15 21 27 基因工程药物 激素类及神经递质类药物 细胞因子类药物 酶类及凝血因子类药物 人生长激素释放抑制因子人胰岛素人生长激素 人干扰素人白细胞介素集落刺激因子 15 21 27 重组胰岛素原的合成 15 21 28 4 生化药物和基因工程药物特点1 共同特点 活性强 毒副作用小2 分子量大 结构确证难3 全过程的质量控制 从原料 菌种到生产设备 中间体 产品4 生物活性检查5 安全性检查 异常毒性检查 过敏物质检查 外源性DNA残留量 宿主菌蛋白残留量等6 效价 含量 测定 15 21 28 二 生物制品的种类和特点 一 生物制品的种类1 疫苗类药物 vaccines 用病毒或立克次体接种于动物 鸡胚 或经组织培养后制成 15 21 28 疫苗类药物种类 1 细菌类疫苗 卡介苗 狂犬病疫苗等 2 病毒类疫苗 乙肝疫苗 腮腺炎减毒活疫苗 3 联合疫苗 麻疹腮腺炎联合减毒活疫苗 4 双价疫苗及多价疫苗 15 21 28 2 抗毒素及抗血清类药物 antitoxinandantisera 1 抗毒素 用细菌类毒素或毒素免疫马等大动物所取得的免疫血清 白喉抗毒素 2 抗血清 用细菌或病毒免疫马等大动物所取得的免疫血清 抗狂犬病血清 15 21 28 3 血液制品 bloodproducts 由健康人的血液或经特异免疫的人血浆经分离 提纯或重组DNA技术制成的血浆蛋白组分 及血液细胞有型成分 人血白蛋白 乙型肝炎人免疫球蛋白 15 21 28 4 重组DNA制品 recombinantDNAproducts 利用重组DNA技术 将遗传修饰的编码DNA通过质粒或病毒载体导入受体细胞 微生物 DNA在细胞中不断复制 表达 产生蛋白质 药物 15 21 28 重组DNA制品种类 1 细胞因子 重组人干扰素 白介素2 生长因子 重组人表皮生长因子3 激素 重组人胰岛素4 酶 重组链激酶5 疫苗 重组乙型肝炎疫苗 酵母 6 单克隆抗体 抗人T细胞CD3鼠单抗 15 21 28 5 诊断制品 diagnosticreagents 用于检测相应的抗原 抗体或机体免疫状态的制品 15 21 28 诊断制品的种类 1 体外诊断制品 由特定抗原 抗体或有关生物物质制成的免疫诊断试剂 试剂盒 HBsAg酶联免疫诊断试剂盒 2 体内诊断制品 有变态反应原或有关抗原材料制成的免疫诊断试剂 结核菌素纯蛋白衍生物 15 21 28 6 其他由有关生物材料或特定方法制成的生物制剂 胰岛素 胃蛋白酶 15 21 28 二 生物制品的特点 15 21 28 生化药物即使组分相同 往往由于分子量不同而产生不同的生理活性 例如 1 低分子量肝素 其抗凝活性低于肝素 2 胶原蛋白的保湿功能远大于胶原多肽 15 21 28 不同质控方法检测对象的特点 15 21 28 三 生物制品的全程质量控制 来源与种类 纯度 性状 干燥失重或水分 鉴别 残渣 氨基酸组分分析 生物活性 肽图 热原试验 糖含量 含量分析 15 21 28 一 生物制品质量控制重点 1 有效成分的同一性 结构确证2 有效成分的均一性 纯度检验3 有害物质及残余杂质的控制4 高效灵敏的生物活性测定方法 15 21 28 收录于 中国药典 和 中国生物制品规程 鉴别 杂质检查 安全性检查 含量 效价 测定 15 21 28 1 鉴别 1 理化鉴别法 UV 肽图等 反应序列信息 RP HPLC法分析重组人胰高血糖素类多肽 1 7 36 肽图谱 rhGLP 1 7 36 由30个氨基酸组成 结构中含2Lys 1Arg 1Asp 3Glu 15 21 28 2 生化鉴别法 免疫法 酶法 电泳法等 3 生物鉴别法 动物试验等 专属性强 应用广泛 免疫双扩散法 15 21 28 2 杂质检查 1 一般杂质 氯化物 重金属 水分等2 特殊杂质 有关物质等 高效凝胶过滤色谱法 HighPerformanceGelFilter HPGFC RP HPLC 萄聚糖凝胶立体网状结构图 15 21 28 标准蛋白色谱图 1 右旋糖酐蓝2 醛缩酶3 血清白蛋白4 碳酸酐酶5 抑蛋白酶肽6 酪氨酸 15 21 28 3 安全性检查 1 热原检查家兔法 鲎试剂法2 降压物质检查3 过敏试验4 异常毒性试验豚鼠 大鼠存活试验5 无菌试验6 宿主细胞蛋白残留 DNA残留ELISA法 15 21 28 1 理化分析法 重量法 滴定法 电化学法 光谱法色谱法 HPLC法 4 含量 效价 测定 例 蛋白质含量测定 ChP2005三部 凯氏定氮法Lowry法双缩脲法 15 21 28 2 生化分析法酶法 免疫分析法 酶活力测定法以酶为分析对象进行分析酶分析法以酶为分析工具或分析试剂的分析方法 15 21 28 3 生物检定法药物对生物体或离体器官所起的生物活性 测定效价时采用参考品 体内 体外方法测定活性 计算效价IU同时测定蛋白含量 计算特异比 比活性 IU mg 15 21 28 第二节鉴别试验 一 理化鉴别法 一 化学鉴别法 呈色反应 沉淀反应鱼精蛋白 CONH 结构有双缩尿反应 胃蛋白酶 酸 碱 有机溶剂 重金属肽链破坏沉淀 15 21 28 二 紫外分光光度法辅酶A的结构中含腺嘌呤 有紫外吸收 蛋白质 多肽有固定的最大吸收波长 15 21 28 3 HPLC法保留时间 肽图的一致性 纯度95 以上 构型均一 一个峰 构型不同 会出现两个峰 15 21 28 二 生化鉴别 一 酶法尿激酶 蛋白水解酶 激活牛纤维蛋白溶酶原溶解纤维蛋白产生气泡 15 21 28 二 电泳法肝素 水溶液带负电荷 采用琼脂糖凝胶电泳法鉴别 与对照品一致 15 21 28 三 生物芯片技术人类基因组计划的实施和大量珍贵的功能基因组数据的获得 使得蛋白质研究显得越发重要 蛋白质芯片技术的出现为我们提供了一种比传统的凝胶电泳法更为方便和快速的研究方法 15 21 28 生物芯片技术是一种将生命科学研究中的许多分析检测步骤和装置通过并行化和微型化处理后集成在一个只有几平方厘米大小的载体上的分析检测系统 15 21 28 在薄片载体上有规则地放置成千上万甚至几十万个特性各异的生物单元 如DNA 蛋白质或生物组织 相应地被称作为基因芯片 蛋白芯片或组织芯片 15 21 28 然后将其与待测样品在一定条件下反应 根据荧光等信号的变化来实现对未知样品的检测 15 21 28 15 21 28 三 生物鉴别 一 血清学法 体外抗原抗体试验1 凝集反应5 免疫扩散2 沉淀反应6 免疫电泳3 中和反应7 荧光标记4 补给反应8 酶标记 15 21 28 二 生物学法家兔惊厥试验鉴别胰岛素 胰岛素大剂量注射家兔血糖降低30 惊厥注射50 葡萄糖惊厥停止 15 21 28 第三节杂质检查 一 一般杂质检查氯化物 硫酸盐 重金属 酸度 溶液澄清度 水分 干燥失重 残渣等 检查方法与化学药物相同 15 21 28 二 特殊杂质检查 特殊杂质的种类 1 生物污染物 微生物 宿主细胞蛋白 外源DNA2 产品相关杂质 二聚体 多聚体 突变物 脱氨氧化产物等3 工艺添加剂 残余抗生素 蛋白分离剂 防腐剂等 15 21 28 一 宿主细胞蛋白残留量检查采用酶联免疫吸附法 ELISA 测定 一般 病毒侵入的细胞就叫宿主细胞 病毒一般没有成型的细胞核 一般被蛋白质所包裹在里面的是它的遗传物质 在病毒获得宿主后 利用宿主的蛋白质和其他物质制造自己的身体 然后将遗传物质注入到细胞内部感染细胞 有的使细胞死亡 有的会使细胞变异 也就是所谓的癌变 15 21 28 残留在生物制品中的宿主细胞蛋白 Hostcellprotein HCP 属异源蛋白 既包括宿主细胞的结构蛋白也包括宿主细胞 传代细胞 分泌的促生长因子 有研究报道 HCP不仅能引起机体的过敏反应还有可能引起机体对蛋白质药物产生抗体 建立HCP残留量的检测手段对加强生物制品工艺过程的质量监控并最终提高制品的质量有极大的帮助 同时有助于开展药品生产的规范化研究 切实降低临床使用药品不良反应事件的发生 15 21 28 二 外源性DNA残留量检查 1 分子杂交技术 hybridization 2 DNA结合蛋白 threshold 分析系统 3 实时定量PCR Q PCR 15 21 28 三 产品相关杂质的检查1 重组人生长激素产品中有关物质的限量检查 1 相关蛋白质 2 高分子蛋白质2 破伤风抗毒素中痕量蛋质的检查 四 残余抗菌素生素的检查 15 21 28 二 安全性检查 一 无菌检查 二 热原检查家兔法检查热原 三 细菌内毒素检查 家兔法 鲎试验 四 异常毒性检查与特异性毒性检查 观察一定剂量药物的急性毒性反应 五 过敏试验 检查异源蛋白 六 致突变试验 七 生殖毒性试验 15 21 28 异常毒性检查和特异性毒性检查 限度试验 1 异常毒性检查 通用安全试验 检查是否污染外源性毒性物质 2 特异性毒性检查 检查某些疫苗是否存在自身毒素引起的特异性毒性的不安全因素 15 21 28 1 异常毒性检查例 小鼠 17 22g 5只腹腔注射供试品0 5ml观察7天每只小鼠体重增加不得死亡如有一只死亡重复试验 15 21 28 2 特异性毒性检查如 百日咳疫苗特异性毒性检查a 小鼠体重减轻试验b 小鼠白细胞增多试验c 小鼠组胺致敏试验 15 21 28 过敏试验 检查异性蛋白例 细胞色素C过敏试验细胞色素C用注射用水配制成7 5mg ml溶液 作为致敏液和供试液 15 21 28 豚鼠 250 350g 分别于1 3 5天皮下或腹腔注射0 5ml 致敏产生抗体 2周后股静脉注射1ml 如有致敏性 即与抗体反应 肥大细胞释放组胺 产生过敏反应 15min内不得出现过敏反应 竖毛 呼吸困难 喷嚏 干呕或咳嗽3声等现象出现2种或2种以上 抽搐 虚脱 死亡等现象之一 则为阳性 15 21 28 致突变试验 微生物回复突变试验 哺乳动物培养细胞染色体畸变试验 啮齿动物微核试验 微生物电极法的致突变试验 15 21 28 生殖毒性试验 一般生殖毒性试验 致畸敏感期毒性试验 围生期毒性试验 15 21 28 第四节含量 效价 测定 含量表示方法 百分含量 用于结构明确的小分子或水解后成小分子的药 生物效价或酶活力单位 IU 用于酶 蛋白质 15 21 28 含量测定 高效液相法 HPLC 测定总体纯度 纯度95 以上 十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS PAGE 经银染显色 测出微量杂质蛋白质 聚合体应在 以下 单体 聚合体在95 以上 15 21 28 二 效价测定体内或体外 细胞法 测生物活性 同时测蛋白质含量 计算特异比活性 活性表示 单位数 毫克蛋白 IU mg 15 21 28 常用方法 理化法 生化法 酶法 电泳法 免疫法 生物检定法 15 21 28 一 理化分析方法 一 化学分析法 重量法 滴定法 二 电化学法 三 光谱法 比色法 紫外法 荧光法 四 色谱法 HPLC法 灌注色谱法 高效毛细管电泳法 15 21 28 一 化学分析法 1 重量法 根据样品中分离出的单质或化合物的重量测定所含成分的量 1 提取法 溶剂提取成分挥发溶剂称重 2 挥发法 利用被测组分具有挥发性 A 直接挥发法 残渣法 B 间接挥发法 干燥失重 3 沉淀法 被测组分沉淀分离烘干称重 15 21 28 2 滴定分析法 样品经标准溶液滴定反应计算含量 例 淀粉酶测定淀粉酶 淀粉还原糖 斐林试剂 Cu2 OH Cu2 H KII2 Na2S2O3 滴定 从Na2S2O3滴定的量来推算淀粉的含量 15 21 28 3 蛋白质测定的国标规定方法 凯氏定氮法 1 原理 蛋白质是含氮的有机化合物 15 21 28 2 分析方法样品与硫酸和催化剂一同加热消化 使蛋白质分解 分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵 然后碱化蒸馏使氨游离 用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定 根据酸的消耗量乘以换算系数 即为蛋白质含量 15 21 28 三 光谱分析法 1 比色法 供试品与显色剂发生颜色反应 如 蛋白质与双缩脲试剂 15 21 28 2 UV法 供试品或反应产物在某一波长处有最大吸收 如 蛋白质在280nm处有最大吸收 15 21 28 3 荧光分光光度法 1 样品经紫外光照射产生荧光 2 与荧光试剂反应的产物有荧光 15 21 28 三 色谱分析法 1 HPLC法 1 RP HPLC 色谱柱 C18 C8烷基硅烷键合相柱流动相 甲醇 水 缓冲液 乙氰 水分析样品 肽类 氨基酸 蛋白质 多糖 15 21 28 2 高效离子交换色谱法 HPIEC 色谱柱 离子键合相柱流动相 不同浓度盐溶液 磷酸盐缓冲液 分析样品 肽类 氨基酸 蛋白质特点 根据样品离子化程度进行分离 可回收活性蛋白质 15 21 28 3 高效凝胶过滤色谱法 HPGFC 色谱柱 有亲水表面的有机物或改性硅胶流动相 缓冲液 有机改性剂 表面活性剂分析样品 肽类 蛋白质特点 可回收活性蛋白质 测定蛋白质分子量 15 21 28 2 灌注色谱法 perfusionchromatography 以具有灌穿孔的颗粒作为分离介质的新型色谱技术 主要用于基因工程药物和大分子药物的分离 纯化 15 21 28 15 21 28 3 高效毛细管电泳法 HPCE 根据带电组分在管中由于其所带电荷和分子量的大小 及荷质比不同产生不同的迁移速度而进行分离 15 21 28 15 21 28 二 生化分析法 一 电泳法 二 酶法 15 21 28 一 电泳法 电泳法是指带电微粒在电场的作用下 向其对应电极方向按各自的速度泳动 而使组分分离 再进行检测计算含量 15 21 28 1 自由界面电泳 在U型管溶液中 同分子构型及荷电的物质 与不同迁移率的物质之间形成明显界面 2 区带电泳 在惰性支持介质中 纸 醋酸纤维素 凝胶 因泳动速度不同 形成区带 15 21 28 15 21 28 15 21 28 3 高效毛细管电泳 在内径约50 m的毛细管中 高压电场作用下分离样品 15 21 28 电泳法一般分析步骤 1 配制缓冲液2 准备电泳介质3 点样4 电泳5 显色定位6 定量测定 15 21 28 常用电泳方法的类型及其应用 15 21 28 二 酶分析法 15 21 28 一酶分析法的基本知识二酶活力的测定三酶法分析 15 21 28 一酶分析法的基本知识 1 1酶分析法的两种类型1 2酶分析法的特征1 3酶分析法的意义 15 21 28 酶的化学组成 单纯蛋白酶 它们的组成为单一蛋白质 结合蛋白酶 某些酶 例如氧化 还原酶等 其分子中除了蛋白质外 还含有非蛋白组分 结合蛋白酶的蛋白质部分称为酶蛋白 非蛋白质部分包括辅酶及金属离子 或辅因子cofactor 酶蛋白与辅助成分组成的完整分子称为全酶 15 21 28 15 21 28 辅助因子分类 按其与酶蛋白结合的紧密程度 辅酶 coenzyme 与酶蛋白结合疏松 可用透析或超滤的方法除去 辅基 prostheticgroup 与酶蛋白结合紧密 不能用透析或超滤的方法除去 15 21 28 单体酶 寡聚酶 多酶复合体 1 单体酶 由一条多肽链构成的酶 大多数的水解酶 2 寡聚酶 由两条及两条以上的多肽链构成的酶 如 糖代谢的酶 3 多酶体系 由几个功能上相关的酶嵌合而成的酶的络合物 丙酮酸脱氢酶系 4 多功能酶 一些多酶体系在进化过程中由于基因的融合 多种不同催化功能存在于一条多肽链中 这类酶称为多功能酶 15 21 28 1 1酶分析法的两种类型 1 以酶作为分析对象 根据需要对样品进行酶含量或活力的测定 通常称为 酶活力测定 2 以酶作为分析试剂 用以测定样品中用一般化学方法难于检测的物质 如酶的底物 抑制剂 活化剂和辅因子等 一般称为 酶法分析 两者检测的对象虽有所不同 但原理和方法都是以酶能专一而高效地催化化学反应为基础 通过酶反应速度的测定来检测相应物质的含量 并且都需要选择适宜的反应条件和测定方法 15 21 28 1 2酶分析法的特征 选择性高 原则上讲 一种酶只催化一种反应 或者说只能催化某种特定的化合物或对特定的化学键起作用 这是由酶本身的高度专一性作用的特点所决定的 灵敏度高 一般可测到10 7mol L 如果与荧光法联用 可高达10 9mol L左右 15 21 28 反应速度快 条件温和 大多数酶促反应在30分钟以内可以完成 反应条件很温和 如在常温 常压和pH近中性的条件下 反应速度很快 酶用量甚微 所以比较经济 精确度一般 主要源于微量吸管误差 如1ul以下的量 取样误差较大 同时也与组合方式有关 15 21 28 适用范围有一定局限性 只限于酶 底物 辅酶 活化剂或抑制剂的测定 简便程度较差 必须具有酶学知识的操作训练 通常要求尽量减少人为误差 尽可能使所有反应体系条件一致 如加样量 温度 反应时间等都要求比较准确 最适反应条件 如温度 pH等 的确定很重要 一个熟练的酶学工作者 会考虑各种因素 设计的实验比较合理 而且重现性好 未经过专门训练的人 往往容易出错 15 21 28 1 3酶分析法的意义酶的应用大致可分为四个方面 1 用以制造某些产品 2 用以去除某些物质 3 用以识别某种化合物 4 用以测定某种物质 1 和 2 应用最为广泛 例如用酶法生产可的松 用凝乳酶制造乳酪 用果胶酶澄清果汁等 3 和 4 属于酶分析法的范畴 15 21 28 酶分析法正在临床诊断 食品加工和发酵等方面广泛应用 如用葡萄糖氧化酶 EC 测定血液葡萄糖是临床检验中常用的方法 而测定某些酶含量也是临床诊断的重要指标 15 21 28 二酶活力的测定 2 1酶活力单位和反应初速度2 2反应条件的确定2 3光学法 15 21 28 酶活力 酶活力是指酶催化某一化学反应的能力 酶活力的大小可以用在一定条件下所催化的某一化学反应的速率来表示 反应速率越大 酶活力越高 反之 酶活力越低 反应速率单位时间内底物的减少量和产物的生成量 初速度反应开始时 酶反应速度不变时的速度 15 21 28 2 1酶活力单位和反应初速度2 1 1酶含量常用酶活力单位表示 酶活力单位是指在某一特定条件下 使酶反应达到某一速度所需要的酶量 酶含量则可用每克酶制剂或每毫升酶制剂含有多少酶单位来表示 U g或U mL 15 21 28 1959年国际生物化学协会酶委会接受了Racker等人的建议 采用了 国际单位 表示酶活力 国际单位IU 25 最适pH 最适底物浓度下 每分钟催化1 L底物反应的酶量 当底物为蛋白质 多糖等包括多个能被酶作用的键或基团时 可用催化一个微摩尔被作用的基团或键变化表示酶单位 15 21 28 1972年酶委员会又提出一种新单位Katal 在确定的最适反应条件下每秒钟催化1摩尔底物变化所需要的酶量为1Kat 1Kat 60 106IU 在实际工作中 为了简便 人们往往采用各自习惯沿用的单位 有时甚至可直接用测得的物理量表示 如以光吸收的变化值 A t 表示酶单位 15 21 28 在估计酶制剂纯度时则用比活力 即以单位重量的酶蛋白中酶的单位数 在酶高度纯净 且酶的分子量和每个酶分子上的活性中心数目已知时 可采用分子活力或转换率 TN 表示 TN表示在最适条件下每个酶分子或每个活性中心每分钟催化底物分子 或相关基团 转化的数目 这种单位的意义是它可用以进行酶催化效率的估计和比较 15 21 28 酶活性测定方法 固定时间法优点 简单缺点 难以确定反应时间段是否处于线性区连续监测法优点 可以明显地找到反应的线性期 结果准确可靠 缺点 要求底物或产物能够直接测量 15 21 28 2 1 2反应初速度酶促反应速度可用单位时间内底物的减少或产物的增加来表示 以产物或底物变化量对时间作图 可获得 酶反应进程曲线 这条曲线的斜率就代表酶反应速度 15 21 28 酶活力测定的目的就是要通过酶反应速度的测定求得酶的浓度或含量 测得的反应速度必须和酶浓度间有线性的比例关系 这是检验酶反应和测定系统是否适宜 正确的标准 15 21 28 2 2反应条件的确定选择反应条件的基本要求是 所有待测定的酶分子都应能正常地发挥作用 也就是说 反应系统中除了待测定的酶浓度是影响反应速度的唯一因素外 其它因素都应处于最适条件 15 21 28 2 2 1底物 底物 包括人工合成底物 最好在物理化学性质上和产物不同 有些酶作用的底物和产物本身就有这种特点 如脱氢酶用的NAD P 和NAD P H 有的则需加工成色源或荧光源底物 在酶作用后产物产生颜色或荧光 如磷酸酯酶测定可用对硝基苯磷酸 15 21 28 底物浓度为了使酶反应速度不受它的限制 反应系统应该使用足够高的底物浓度 判别标准是Km例如选用 s 100Km 因为这种情况下反应速度可达最大速度的99 大多数酶具有相对的专一性 在可被它作用的各种底物中一般选择Km小的作测定用的底物 15 21 28 Km值等于酶促反应速度达到最大反应速度一半时所对应的底物浓度 是酶的特征常数之一 不同的酶Km值不同 同一种酶与不同底物反应Km值也不同Km值可近似的反应酶与底物的亲和力大小 Km值大 表明亲和力小 Km值小 表明亲合力大 15 21 28 底物表现高底物浓度抑制 或者溶解度小 或者具有毒性 或者较为昂贵而不能使用高浓度 同时又没有其它适宜的底物可以替用时 就只能根据具体的条件 选择一个恰当的底物浓度 并确定在该浓度条件下酶反应的动力学级别 如 酵母的蔗糖酶受高浓度蔗糖抑制 故一般测定时选用5 左右的蔗糖浓度 此时反应为零级 15 21 28 2 2 2pH值H 能对酶反应产生多种影响 可能改变酶活性中心的解离状况 升高或降低酶的活性 可能破坏酶的结构与构象导致失效 可能作用反应系统的其它组成成分影响酶反应 甚至改变可逆反应进行的方向 如 乳酸脱氢酶反应在pH7时向乳酸生成方向进行 而pHl0时则倾向于丙酮酸的形成 15 21 28 在进行酶活力测定时要注意选择适宜的反应pH 并将反应维持在这一范围内 有些酶反应的最适pH可能因反应的温度与底物浓度而不同 例如 碱性磷酸酯酶的最适pH在25 30 和37 分别为10 3 10 1和9 9 15 21 28 酶反应缓冲系统pK值应接近要调整的pH 磷酸缓冲液适用于pH低于7 5的反应系统 Tris 三羟甲基氨基甲烷 缓冲液适用于高于pH7 5的反应体系 Gly Gly 甘氨酸二肽 在pH大于8时是出色的缓冲系统 缓冲离子不同 可能影响酶的活性水平 甚至最适pH 15 21 28 缓冲离子也可能与酶活性的必需成份形成配合物而导致酶活性的抑制 如 磷酸能与多价阳离子如Ca2 等结合 硼酸能与多种有机化合物如呼吸链中间递体结合 从而抑制相应的酶活性 15 21 28 2 2 3温度直接影响化学反应速度本身 也能影响酶的稳定性 还可能影响酶的构象和酶的催化机制 温度变化1 速度可能相差10 以上 要得到可以高度重复的结果 温度变动应控制在 0 1 以内 15 21 28 生化联合会在1961年建议以25 为酶的反应测定温度到1964年则建议改为30 国际临床化学联合会也建议采用30 但是许多临床化学工作者常采用37 为酶反应温度 15 21 28 2 2 4辅助因子有些酶需要金属离子有些酶则需要相应的辅酶物质 在反应系统中应该满足酶对这些辅助因子的需要 而且在添加这些物质时还应注意到它们的专一性 以及某些活化剂在高浓度时可能产生抑制作用 为了提高酶在反应系统中的稳定性 有时也需要某些相应的物质 例如 对巯基酶可加入巯基乙醇 二硫苏糖醇 DTT 等 在制备样品和反应过程中为了避免待测酶遭受蛋白酶的降解 往往要加入蛋白酶的抑制剂 15 21 28 2 2 5样品许多待测样品常常包含各种干扰因素 如可能存在着作用同一底物或产物的其它酶 因此测定前应检测系统中是否杂有这些干扰因素 同时采用不同的测定方法和同时检测底物和产物的变化量 然后观察测得的结果是否一致 通过这些比较分析 确定是否存在干扰 15 21 28 2 2 6空白和对照空白是指杂反应和自发反应引起的变化量 它提供的是未知因素的影响 空白值可通过不加酶 或不加底物 或二者都加 但酶预先经过失效处理的反应系统获得 对照是指用纯酶或标准酶制剂测得的结果 主要作为比较或标定的标准 15 21 28 2 3光学法测定方法有取样法和连续法 取样法 在酶反应开始后不同的时间 从反应系统中取出一定量的反应液 并用适当的方法停止其反应后 再根据产物和底物在化学性质上的差别进行分析 求得单位时间内酶促反应变化量的方法 连续法 基于底物和产物在物理化学性质上的不同 在反应过程中对反应系统进行直接 连续观察的方法 15 21 28 2 3 1光吸收测定法根据产物和底物在某一波长或某一波段上 有明显的特征吸收差别而建立起来的连续观测方法 光吸收测定法应用的范围很广 几乎所有氧化还原酶都可用此法测定 例1 脱氢酶的辅酶NAD P H在340nm有吸收高峰 而氧化型则没有 15 21 28 例2 细胞色素氧化酶的底物为细胞色素c 该物质在还原态时 其550nm的吸光系数2 81 104厘米 摩尔 而氧化型的0 80 104厘米 摩尔 这种光吸收差别也可用来进行测定 15 21 28 可以利用光吸收测定的 还有那些催化双键饱和化或双键形成的酶反应 以及那些催化环状结构变化的酶反应 例1 延胡索酸酶催化的反应 延胡索酸在300nm有强的光吸收 而苹果酸没有 例2 尿酸氧化酶催化尿酸氧化为尿囊素 尿酸在290nm有吸收 而尿囊素则没有 15 21 28 光吸收测定法的特点灵敏度高 可检测到nmol L水平的变化 简便易行 测定一般可在较短的时间内完成 光吸收法 应用很广 除上述氧化还原酶 许多激酶 转移酶 酯酶 肽酶等 都广泛采用这类方法 15 21 28 2 3 2荧光测定法如果酶反应的底物或产物具有荧光 则荧光强度变化速度可作为酶反应速度的一个量度 可以应用此法测定酶的反应有两种 1 脱氢酶等反应 它们的底物本身在酶反应过程就有荧光变化 例如NAD P H的中性溶液发强的蓝白色荧光 460nm 而NAD P 则没有 2 最近发展起来的 利用荧光源底物的酶反应 例如可用二丁酰荧光素测定脂肪酶 二丁酰荧光素不发荧光 但其水解后释放荧光素 15 21 28 荧光测定法优点 灵敏度极高 它比光吸收测定法还要高2 3个数量级 因此特别适于酶量或底物量极低时的快速酶分析 与此有关的是荧光光谱与荧光偏振测定 二者近年来广泛用于酶作用机制的研究 15 21 28 荧光测定法缺点荧光读数与浓度问没有直接的比例关系 而且常因测定条件如温度 散射 仪器等而不同 所以如果要将酶活性以确定的单位表示时 首先妻制备校正曲线 根据这曲线再确切定量 该法易受其它物质干扰 有些物质如重铬酸钾常会抢夺能量 降低荧光强度 有些物质如蛋白质能吸收和发射荧光 这种干扰在紫外光区尤为显著 故测定的荧光最好是可见光 特别是红荧光为好 15 21 28 2 3 3电化学测定法灵敏度和准确度都很高 可和光学方法相比 测定系统中有某些物质污染 不会影响结果 此法要求一定的仪器设备 15 21 28 离子选择性电极测定法最普通的是以玻璃电极测定酸度 pH 的变化 可用于产酸反应的测定 此法操作简单 但有两个缺点 一是随着反应的进行 pH不断改变 酶活力也将发生变化 二是测定系统的pH依赖于介质的缓冲能力 蛋白质是高缓冲性物质 粗的待测样品中往往包含大量惰性蛋白 因而难以保证恒定的缓冲强度 测定结果不易准确 15 21 28 连续滴定或恒酸滴定可以克服上述困难 所谓恒酸滴定就是在反应过程中 不断向反应系统加酸或碱使pH维持恒定 同时以加酸或加碱的速度代表反应速度 恒酸滴定仪 pH stat 就是适应这种需要而设计的一种精密测定仪 它可自动加酸加碱控制pH 并记录加入的酸碱量与时何的关系 15 21 28 氧电极测定法原理 给水溶液中的电极加上一定电压 其中的溶解物质在电极上进行氧化还原反应 产生电解电流 根据电流测定溶质浓度 各种物质产生电极反应所需要加的电极电压是不同的 可以进行选择性测定 例如 溶解氧能在较低的负电压 0 65V左右 条件下还原 而能在这种电极电压水平下发生反应的物质又很少 因此可用来测定氧化还原反应 如葡萄糖氧化酶 氨基酸氧化酶等 不过这种方法主要用于线粒体和光合成酶系的研究 15 21 28 电流测定法原理 把两个电极浸入分析样品中 其间维持一恒定电压 这样反应过程中电流的变化速度将反映酶反应的速度 例 测定葡萄糖氧化酶 反应过程中管状铂电极上发生的Fe2 氧化导致电流的变化 这种变化和酶反应速度间有线性关系 15 21 28 2 3 4放射化学测定法原理 底物用同位素标记 随着酶催化反应进行 将定量地导致放射标记的产物形成 一定时间后 将反应停止并将产物和底物加以分离 然后测定产物的放射性或未反应的底物的放射性 那么转化的底物量也就能推算出来 此法检测的灵敏度可以通过反应时间的控制 比放射性的选择而适当调整 15 21 28 已知的六大类酶几乎都可以用此法测定 通常用于底物标记的同位素有 3H 14C 32P 35S和131I它们在衰变过程中放射的都是 粒子 用于酶分析中的底物 其比放射性一般不宜太高 因为这样可以降低分析成本 避免干扰 减少误差 32P 131I等产生的高能 射线 可直接用Geigermiiller计数器探测计数 但是低能的 射线 如来自 H 35S 则常用液体闪烁仪检测 15 21 28 优点 灵敏度极高 高于光学和电学等方法 缺点 操作较繁而费时 同位素的保存和操作必须特别小心 它直接关系到使用者的健康 安全 不能进行连续跟踪 故测定时反应时间不能太长 应使底物的转变落在初速度范围内 辐射线的淬灭问题 如3H发射的 射线可被纸吸收 放射化学测定法是一种重要的测定方法 它的应用愈来愈广 愈多 有些酶反应目前还只能采用此法测定 15 21 28 2 3 5酶偶联分析法应用过量 高度专一的 偶联工具酶 使被测酶反应能继续进行到某一可直接 连续 简便 准确测定阶段的方法 15 21 28 1 酶偶联分析测活力的实例 例1 如果被测酶反应的产物是某脱氢酶的底物 在这种情况下 可向反应测定系统中 加入足够量的相应的脱氢酶和辅酶 使反应继续进行 然后通过NAD P H特征吸收变化而加以测定 15 21 28 其中G和G 6 P O分别代表葡萄糖和葡萄糖 6 磷酸 内酯 大约有50种左右的脱氢酶可以利用NAD 和NADH 20多种脱氢酶能利用NADP 或NADPH 它们都可用作偶联指示酶 如 己糖激酶 HK 的测定就可在过量的葡萄糖 6 磷酸 G 6p 脱氢酶 G6PDH 和NADP 存在的条件下进行 15 21 28 例2 被测反应不能直接和上述脱氢酶反应偶联 可再插入一个起联结作用的辅助酶反应 如测定肌激酶活力 其中PEP Pyr和L分别代表磷酸烯醇丙酮酸 丙酮酸和乳酸 AMP ADP和ATP分别为腺苷一 二和三磷酸 15 21 28 2 应用酶偶联测活力应注意的事项 1 加入的偶联工具酶应当高度纯净 尤其不能混有待测酶 也不能混有干扰测定的其它酶 2 偶联酶的用量必须过量 以保证被测酶的反应速度是总反应系统的限制因子 使测得的反应速度和被测酶浓度呈线性关系 15 21 28 三酶法分析 应用酶作为分析工具的酶分析法可以对酶的底物 辅酶 活化剂或抑制剂进行定量分析 常用的方法有动力学分析法 终点测定法和 酶标免疫铡定法 终点测定法应用最为普遍 15 21 28 终点测定法是借助某种酶作用 使被测物质定量地进行转变 然后在转化完成后 测定底物 产物或辅酶物质等的变化量 单酶反应定量法偶联酶反应定量法 15 21 28 3 1单酶反应定量法单酶反应只需要一种催化酶 如下式所示 用这种反应作底物定量时 可以测定底物的减少量 也可以测定产物的增加量 对含有辅酶的酶 测定辅酶的变化量也是有效的方法 15 21 28 3 1 1底物减少量的测定在待测物质为底物的酶反应中 如果底物能接近完全地转化为产物 当有99 转化成产物时 则认为反应完全 而且底物又具有某种特征性质 如具有特殊的吸收光谱 时 就有可能直接测定底物的减少量而定量待测物 据此原理能进行测量的物质有胞嘧啶 胞嘧啶脱氨酶反应280nm处吸光度的减少 腺嘌呤 腺嘌呤脱氨酶反应 280nm处吸光度的减少 以及尿酸等 15 21 28 例 尿酸的定量测定尿酸在293nm 297nm处具有特征吸收峰 其摩尔吸光系数分别为有明显差别 利用这一性质 通过尿酸酶反应 根据它的吸光度的减少就可算出尿酸量 15 21 28 3 1 2产物增加量的测定在被测物作为底物的酶促反应中 如果底物基本上都能转变成为产物 而产物又具有可专一性进行定量测定的物质 那么 根据产物的增加量就能检测底物的量 如 各种氨基酸类 L Lys L Arg L Tyr L His L Glu L Asp等 和草酸等 都可借助相应的专一性脱羧酶的作用 用Warburg呼吸测定生成的CO2 15 21 28 还有一类物质在某种酶的作用下 形成的产物具有特征的 吸收谱带 因此也能用此法定量 如 黄嘌呤和次黄嘌呤 黄嘌呤氧化酶反应 293nm处吸光度增加 以及CoA 磷酸转乙酰基酶反应 233nm处吸光度增加 等 15 21 28 3 1 3由辅酶变化量进行底物定量NADH和NADPH在340nm处有特征最大吸收峰 NAD 和NADP 在340nm处没有吸收 所以以NAD 或NADP 为辅酶的脱氧酶反应 通过测定340nm处吸光度的变化 就可以对相应脱氢酶的底物作定量分析 此法应用范围很广 如下表是可以由辅酶变化量进行底物定量的物质和工具酶 15 21 28 15 21 28 15 21 28 3 1 4辅酶的定量辅酶种类很多 由于它们在酶系统中非常重要 因而经常对它们作定量分析 单酶反应可测定的辅酶有多种 例如 CoA可用磷酸转乙酰酶 PTA 乙酰CoA 正磷酸乙酰基转移酶 进行