干细胞移植治疗慢性下肢缺血疾病的临床研究进展.doc

学习资料收集于网络，仅供参考干细胞移植治疗慢性下肢缺血疾病的临床研究进展 河南中医学院第一附属医院周围血管科 刘平慢性下肢缺血性疾病包括下肢动脉硬化闭塞症（ASO）、血栓闭塞性脉管炎（TAO）及糖尿病足等。传统的治疗方法主要是采用血管旁路移植术、经皮肤内血管成形术及药物治疗。然而对于下肢动脉流出道差, 无法行下肢动脉搭桥者, 或体质差无法耐受搭桥手术者治疗办法则较少, 内科保守治疗效果欠佳, 尤其是糖尿病足最终难以避免高平面截肢。近年来, 国内外多次报道了自体骨髓干细胞移植治疗下肢缺血。干细胞具有高度增殖并分化为体内各种细胞的潜能, 移植后能够提供种子细胞与各种成血管细胞因子, 促进血管生成与动脉生成, 为治疗此类疾病带来希望。一、概述（一）用于治疗慢性动脉缺血性疾病的干/祖细胞1.内皮祖细胞(EPCs)是内皮细胞的前体细胞, 能高度增殖并分化为成熟内皮细胞, 在缺血性疾病治疗及血管组织工程学研究中有着良好的临床应用前景。2.骨髓间充质干细胞(MSCs)可分化为多种谱系细胞。人们在研究MSCs向心肌细胞分化治疗心肌梗死时, 发现其不仅能替代受损心细胞, 改善心脏功能, 还能增加心肌血流灌注。3.进一步研究表明, 骨髓和外周血中的其他干/祖细胞亚群( 如造血干细胞/HSCs、多潜能成体前体细胞/MAPCs等, 统称骨髓源性干细胞)移植后也能够增加动脉血流灌注, 改善缺血症状。需要注意的是，由于现在尚无明确的成体干细胞标记, 所以实验所用干细胞并非纯系, 或多或少混有其他细胞成分。4.临床上所移植的干细胞并非某一系干细胞, 而是病人自体的单个核细胞(MNCs, 包含各种干/祖细胞亚群和白细胞)。抽血( 骨髓血或外周血) 后除去大部分红细胞与血小板, 所得的单个核细胞悬液不经体外细胞纯化和扩增, 直接植入缺血心肌、骨骼肌或注入血管腔内。各种干细胞亚群在局部相互协调, 共同促进侧支动脉扩张性重塑和毛细血管生长, 增加动脉血流灌注。（二）干细胞移植术：广义的干细胞移植治疗慢性动脉缺血性疾病分为3个阶段, 它们将随技术进步而逐步应用于临床。一是将干细胞直接植入缺血组织, 干细胞可分化为内皮细胞(ECs) 和血管平滑肌细胞(SMCs) 并分泌成血管细胞因子, 促进动脉生成和血管生成, 改善组织缺血。同时, 干细胞还能分化为缺血组织的细胞类型( 如心肌细胞)并行使生理功能。此项目前已应用于临床, 初步结果令人鼓舞, 但具体机制仍未阐明, 阻碍了疗效的提高。二是体外诱导干细胞定向分化为ECs、SMCs或目的细胞后植入缺血组织, 在结构和功能上替代病变的血管壁细胞或组织细胞。三是体外诱导干细胞定向发育为成熟血管组织或目的器官后植入体内, 在结构和功能上替代病变血管或缺血受损的器官。后两项虽然是干细胞治疗的理想阶段, 但仍处于基础研究阶段, 距临床应用还有很长的一段路要走。二、原理（一）基础研究1.提供细胞材料与成血管细胞因子 目前已经证实, 体外细胞培养时多种骨髓源性干细胞可被诱导分化为内皮细胞或平滑肌细胞,细胞标记物显示植入体内的骨髓源性干细胞结合进缺血组织侧支动脉和毛细血管管壁内。这些结果提示干细胞可能作为细胞材料参与血管壁的组成。Ziegel hoeffer等应用高能激光共聚焦显微镜消除了相邻细胞间不同荧光信号重叠的影响后, 观察后肢缺血小鼠的侧支动脉, 并未发现移植后迁移到侧支动脉管壁内或周围的骨髓源性干细胞分化为内皮细胞。Rehman等应用Asahara报道的方法, 从外周血中分离出人内皮祖细胞，发现大部分细胞表达单核细胞系标记, 并能够上调单核细胞活化和巨噬细胞分化标记物, 但它们增殖和分化为内皮细胞的能力却很弱。他们的发现提示骨髓源性干细胞移植后, 可能不是直接作为细胞材料参与侧支动脉重塑, 而是通过分泌各种细胞因子和生长因子促进动脉生成。Kinnaird等的研究为骨髓源性干细胞通过旁分泌成血管细胞因子促进动脉生成提供了进一步的证据。他们应用基因芯片技术检测体外缺氧条件下培养的骨髓间充质干细胞, 发现数种成血管细胞因子表达超过基线1.52.0倍, 并证实其中包括VEGF、FGF-2和MCP-1 等细胞因子。骨髓间充质干细胞与ECs或SMCs体外联合培养时, 可诱导ECs和SMCs增殖, 并对其有趋化作用。单纯将骨髓间充质干细胞培养液(不含干细胞) 注入小鼠缺血后肢, 就能够显著增加组织血流灌注。Uemura 等也有类似发现。这些结果提示骨髓源性干细胞植入缺血组织后, 可能通过旁分泌机制诱导血管生成和动脉生成。干细胞的治疗机制最终是提供细胞材料还是分泌成血管细胞因子目前仍有争论, 辩论双方都可提出证据证明自己的观点, 也有很多学者认为两种机制可能同时存在。国内研究主要侧重于干细胞移植后分化为内皮细胞促进血管生成。2. 促进血管生成( angiogenesis)与动脉生成( arteriogenesis):虽然体外细胞条件培养能够诱导多种骨髓源性干细胞分化成为ECs, 并且干细胞在体内可以作为细胞材料参与毛细血管的组成, 即干细胞移植可促进血管生成, 但是动物实验尚未证实由植入干细胞发育而成的新生小动脉和微动脉的存在, 这样就无法圆满解释缺血组织血流灌注增加的原因(新生毛细血管只能加速物质交换, 不能增加血流灌注) 。出生后血管发生理论( postnatal vasculogenesis) 作为干细胞移植术治疗机制的假设受到质疑。临床上自体单个核细胞移植术后, 组织学观察发现闭塞动脉近端的侧支动脉管壁内ECs与SMCs增殖, 侧支动脉管径增粗, 数量增加。动脉造影显示缺血组织侧支动脉数量增加, 多数侧支动脉的位置及形态与移植前已存在的较细的侧支动脉基本一致, 但管径增粗。在实验动物缺血后肢, 与对照组比较, 移植组上述组织学和影像学变化也极明显。这些结果证实, 植入的骨髓源性干细胞能够促进侧支动脉重塑, 扩大侧支动脉管径, 增加大而有功能的侧支动脉数量, 即干细胞移植促进了动脉生成。这可能是移植术后缺血组织血流灌注增加的主要原因。干细胞移植后可促进血管生成与动脉生成, 这两种机制同时存在已勿庸置疑, 目前国内研究多侧重于干细胞移植后促进血管生成领域。（二）临床研究干细胞移植治疗动脉缺血性疾病的首次报道始于2001年, 其初衷不仅是希望植入的干细胞增加心肌血流灌注, 还希望干细胞分化成心肌细胞替代梗死心肌并行使功能。Hamano等在进行冠状动脉旁路移植术时, 将单个核细胞注入无法进行血管搭桥的心肌区域，5例接受干细胞移植的病人中, 有3例移植区心肌的血流灌注得到改善, 并且不伴有相反效果和副反应。虽然结果令人鼓舞,但由于同时应用两种治疗手段, 临床上不易判断干细胞移植在其中的真正意义。首例单独使用干细胞移植治疗心肌缺血由Fuchs等完成。他们通过内镜将过滤后的骨髓细胞直接植入缺血心肌, 发现干细胞移植能够增加心绞痛评分, 缓解心肌缺血。Strauer等则首次报道了干细胞血管腔内注射治疗心肌梗死。他们于心肌梗死发生59d后行冠脉血管成形术, 在球囊扩张时, 通过气囊式导管将骨髓单个核细胞注入供应梗死区的冠状动脉管腔内。虽然最初的试验设计是想观察干细胞在心肌再生中的作用, 但临床结果显示干细胞移植最终增加了心肌血流灌注。2002年, Tateishi Yuyama 等首次报道了干细胞移植治疗下肢缺血性疾病, 这也是世界上首次在此领域进行的临床随机对照研究。试验最终纳入45例病人, 其中23例单侧下肢缺血病人接受骨髓单个核细胞移植, 对侧肢体注射生理盐水作为对照, 另外22例双下肢缺血病人的两条肢体分别接受骨髓单个核细胞移植和外周血单个核细胞移植。随访结果显示骨髓单个核细胞移植是一种安全有效的治疗方法, 能够增加缺血下肢的血流灌注, 并且效果优于外周血单个核细胞移植( 最后一项结论与国内报道有出入)。 科研人员目前正不断改进干细胞分离方法和移植方法来提高临床疗效, 但尚未取得突破性进展。国外已有多个研究小组报道了干细胞移植治疗慢性缺血性疾病的可行性、安全性和效果, 虽然有的研究聚焦于植入的干细胞替代受损心肌, 改善心脏功能, 但结果都提示干细胞移植是一种安全的治疗方法, 能够增加动脉血流灌注, 改善缺血症状。不过其中仍存在局限性: 其一, 报道的文献量有限、病例数较少；其二, 缺乏大样本临床随机对照试验, 因而提供的有价值信息不多。随机临床试验是评价干细胞移植治疗效果最严格的方法, 非随机性研究虽能表明干预效果, 但不能鉴定干细胞移植的显著差异是干预本身的作用还是混杂因素(如药物或血管扩张术) 所致的系统差异。2003年起，国内多家单位开始在临床上应用自体单个核细胞移植治疗慢性动脉缺血性疾病。谷涌泉等首次报道了自体骨髓单个核细胞移植治疗糖尿病足, 文献报道了自体外周血单个核细胞移植治疗ASO, 陈运贤等也开展了自体骨髓单个核细胞移植治疗心肌梗死。近几年来我国已有很多自体单个核细胞移植治疗心肌缺血和自体单个核细胞移植治疗慢性下肢缺血的病例报道和实验研究。三、适应证与禁忌症国内科研人员已在改进干细胞分离和移植方法进而提高临床效果方面作了大量工作, 虽然至今尚无关于干细胞移植治疗动脉缺血性疾病的多中心、大样本循证医学研究，但综合各家报道, 仍能得出初步结论。（一）适合自体单个核细胞移植的病例为: 1.保守治疗无效和远端流出道不佳、无血管旁路移植或介入手术指征, 但近端血供足够的慢性下肢缺血性疾病病人；2.手术风险大和肢端缺血较严重、身体条件差, 无法耐受动脉重建手术的病人；3.慢性下肢缺血性疾病，包括有间歇性跛行且静息状态下踝肱指数(ABI)0.60.8或已有静息痛、溃疡、坏疽者，不伴有严重肢端湿性坏疽病人等。（二）不适合自体单个核细胞移植的病例为: 1.伴有恶性肿瘤及血液病病人；2.严重心脑血管疾病, 肺、肝、肾功能不全病人；3.严重全身感染病人；4.处于急性动脉缺血性疾病初期的病人；5.采集骨髓血部位和干细胞移植部位严重皮肤病病人；6.糖尿病血糖控制不稳定的病人等。四、方法：（一）影响干细胞移植治疗下肢缺血疗效的因素：1.不同的干细胞移植途径：郭连瑞等研究认为局部肌肉注射和动脉腔内注射两种移植途径同样有效；2.不同的移植干细胞来源：谷涌泉等对骨髓来源和外周血来源的干细胞移植治疗下肢缺血发现，二者对下肢缺血的治疗都是有效的，但对同时伴心脑血管病变的患者, 进行自体干细胞移植,尤其是采用外周血干细胞移植需特别慎重；3.不同的移植干细胞数量：谷涌泉等发现自体骨髓干细胞移植治疗下肢缺血性疾病的疗效与移植的干细胞总量密切相关，移植细胞量1108 个/条下肢时, 大多数患者是有效的。4.目前认为影响骨髓干细胞移植治疗下肢缺血性疾病疗效的重要因素之一是移植干细胞，尤其是内皮组细胞（EPC）的数量与质量。如何提高EPCs的数量？显然简单的通过增加骨髓或外周血的采集量是不可取的，进行骨髓动员是行之有效的方法。（二）影响内皮祖细胞动员的因素：目前普遍认为EPC是血管新生的主要物质基础，骨髓来源EPC的动员、迁移、分化参与了出生后的血管新生。EPC的动员是这一过程的关键步骤。有效的EPC的动员可以促进血管新生。能够促进EPC动员的因素有以下几个方面：1.促血管生长因子、趋化因子、集落刺激因子：生理和病理状态下组织缺血或血管损伤时，局部组织释放血管内皮生长因子，通过作用于成熟内皮细胞而促进血管形成，血管内皮生长因子还能促进EPC的动员。应用血管内皮生长因子发现外周EPC数量明显增加，其迁移和促血管新生作用明显加强。2.他汀类药物：在用阿托伐他汀治疗稳定性心绞痛患者的过程中发现，4周后外周血中CD34+/CD133+/KDR+/CD45+ 的细胞数升高了3倍，并证实外周血中内皮祖细胞来源于骨髓，这种动员机制是通过Akt 信号转导途径实现的。研究结果表明他丁类药物除降脂作用外还可以促进骨髓EPC的动员。3.雌激素：Strehlow等发现经雌二醇治疗后外周血中EPC数量增多，并参与损伤血管的在内皮化。（三）骨髓动员剂的选择：无论是惠尔血或是洁欣, 其疗效差别不大,可根据患者的具体情况选用。对于经骨髓动员刺激后的骨髓单个核细胞移植的疗效明显增高的原因,可能有以下几点: 1.骨髓中存在许多种类的成体干细胞，其中包括造血干细胞、内皮细胞祖细胞以及间充质干/祖细胞等干细胞群和间充质细胞、成纤维细胞等多种细胞亚群, 因此相对于外周血源的单个核细胞来说，骨髓源的单个核细胞群中含有更多的有利于血管新生的细胞亚群。2.经动员刺激的骨髓内存在大量更原始的干细胞/ 血管内皮祖细胞,这些细胞的分化能力更强,更利于细胞的融合和血管的新生。3.经动员刺激可使附壁的骨髓间充质细胞的贴壁能力下降, 经过带侧孔的骨髓穿刺针的用力抽吸,可使更多的骨髓间充质细胞被抽出, 同时也可得到一部分细胞生长因子,有利于创造一个细胞生长所需要的基质环境。（四）手术方法：无论是自体骨髓干细胞移植还是外周血干细胞移植,治疗下肢缺血都是有效的方法, 二者疗效无明显差异；但是对于同时伴有心脑血管病变的患者, 进行自体干细胞移植, 尤其是采用外周血干细胞移植需特别慎重。1.骨髓动员：应用重组人粒细胞集落刺激因子( G-CSF )150g肌肉注射, 每天2 次2d5d，每天抽血检测血常规了解白细胞计数，术晨化验WBC(25)109 /L。2.自体骨髓血干细胞移植术：麻醉下经髂后上嵴穿刺抽取骨髓血300500ml,采用人淋巴细胞分离液经密度梯度离心法提取出单个核细胞,再用生理盐水稀释成50ml悬液备用。在连续硬膜外或腰麻下, 采用患肢缺血处肌肉内注射方法（注射器多点注射入腓肠肌或股四头肌等缺血部位）,将提取出的自体骨髓单个核细胞（BM-MNC）悬液沿下肢动脉走行路径进行多点注射, 每针间隔13cm，每次注射1.0ml(1.01.5cm深)。患肢股动脉未闭塞者加用干细胞液及肝素钠1020ml行股动脉内注射。3.外周血干细胞移植术：骨髓动员后，应用血细胞分离机采集干细胞 ,其处理血量按自身循环血量的22.5 倍,约800010000ml，全血：枸橼酸钠抗凝剂(ACD)=1011：1 ,全血流速3950ml/min。将分离出的外周血干细胞浓缩成“干细胞液”5060ml ,按上述方法进行缺血部位肌肉注射。4.其它新方法：缺血下肢骨开窗(例如进行胫骨穿刺)从而使骨髓干细胞直接漏人周围肌肉组织中，但此种方法造成髓内感染的机率增大。（五）自体骨髓血干细胞移植术与外周血干细胞移植术优缺点比较：1.自体骨髓血干细胞移植术：(1)技术、设备要求相对低。获取骨髓单核干细胞时，需全身麻醉，局部损伤大。患者对大量骨髓血采集有恐惧感，依从性较差。(2)采集300500ml骨髓血仅分离单个核细胞，其他血液成分废弃，对患者身体状况要求高。(3)采集后的细胞总量较少，低于外周血单核干细胞总量。2.外周血干细胞移植术:(1)避免了大量抽骨髓血，但技术、设备要求高。(2)动员过程中因白细胞增多或高凝状态可能导致急性动脉血栓形成或心脑血管意外，加之下肢缺血性疾病患者中绝大多数为中老年则更应慎重。(3)对具有潜在骨髓增生异常倾向者，粒细胞集落刺激因子有诱发血液病的可能。3.为了克服上述缺点，进一步提高疗效，目前谷涌泉建议采用骨髓刺激后的自体骨髓干细胞移植的新方法，结果发现效果明显优于外周血干细胞和单纯骨髓干细胞移植，抽取的骨髓血仅仅110200ml，而且其细胞数量也明显多于单纯骨髓干细胞移植；由于骨髓刺激次数少，出现心脑血管事件意外的发生率也明显降低。五、疗效评价现阶段评价移植疗效尚未建立完整客观指标体系，国内目前多采用首都医科大学宣武医院分级指标。（一）主观标准：1.患肢疼痛。根据疼痛与否及程度分为5级：O级，无疼痛；1级，偶有疼痛，被问及能回忆起；2级，疼痛经常出现但能耐受，不需或偶用一般止痛剂；3级，经常用一般止痛剂；4级，因疼痛影响睡眠，一般止痛药剂难以缓解。2.患肢冷感。根据患肢有无冷感及冷感程度分为5级：0级，无冷感；1级，患者偶述受累肢体有发凉、怕冷的感觉；2级，受累肢体经常有发凉、怕冷的感觉；3级，受累肢体有明显的冷、凉感觉，需要采用局部保温措施，症状能得到一定程度的缓解；4级，受累肢体有明显的冷、凉感觉，采用局部保温措施，症状也无明显改善。3.患肢麻木。根据其程度分为3度：轻度麻木(麻木能够感觉, 但不影响日常活动)，中度麻木(感觉麻木比较明显,但是能够忍受), 重度麻木(感觉非常明显, 影响到日常活动)。（二）客观标准：1.间歇性跛行距离。根据在正常速度(6070m/min)下行走的距离分为5级：0级，行走500m，无疼痛；1级，行走400499m，有疼痛；2级，行走300399m，有疼痛；3级，行走100299m，有疼痛；4级，静息痛，无法行走或行走l00m，有疼痛。2.踝肱指数(ABI)测定。3.经皮氧分压(TcPO2)测定。4.新生侧支血管评估。分4级：0级, 无新生侧支血管；+1级, 少许新生侧支血管；+2级, 中量新生侧支血管；+3级, 丰富新生侧支血管。5.保肢率评价: 评价术后4周的截肢和保肢率。6.足部创面的变化：包括溃疡面的愈合、扩大或缩小, 创面感染的控制情况等。（三）新的客观评价方法：双下肢放射性核素扫描。与下肢动脉造影及下肢动脉3DCTA比较，具有费用低、创伤小、并发症少等优点。六、现阶段存在问题干细胞移植治疗下肢缺血性疾病，这一新方法刚用于临床，病例数不多，经验不足，许多问题有待研究。第一，干细胞具有多种分化方向，移植干细胞是否会引起其他问题，以及如何诱导其向血管内皮细胞定向分化。第二，对健康人G-CSF仅引起一过性骨髓增生，停药后可很快自行恢复。但对于具有潜在的骨髓增生异常倾向的人，G-CSF有诱发血液病的可能性，其安全性尚需要进一步观察、研究。第三，因有报道发现用G-CSF动员可出现白细胞增多或血液高凝状态而有可能诱发心绞痛或急性动脉血栓形成,故在动员过程中是否需要常规进行抗凝和（或）抗血小板治疗。第四，G-CSF是否具有改善下肢供血作用，还需对照观察。