高产γ-氨基丁酸乳酸菌的等离子诱变选育毕业论文.doc

高产-氨基丁酸乳酸菌的等离子诱变选育 叶杨 （安徽工程大学生物化学工程学院，芜湖 241000）摘 要 -氨基丁酸（-amino butyric acid，简称GABA )是广泛分布于自然界的一种非蛋白质氨基酸，具有镇痛、促进生长激素分泌及预防老年痴呆等生理功能。 矚慫润厲钐瘗睞枥庑赖。为提高GABA产量 ，本实验应用常温室压等离子体（ Atmospheric and Room Temperature Plasma，简称ARTP ）对实验室已有菌株HX-3-6进行诱变，挑选致死率达到90%以上的菌株进行发酵验证，并通过梯度平板按GABA浓度的高低以及菌落的大小进行初筛，再利用发酵培养基进行复筛并进行遗传稳定性试验。获得的稳定突变株L-120-1且产量达到5.828g/L，较诱变前产量（4.904）提高18.84%。以突变株L-120-1为出发菌株进行ARTP诱变，得的稳定突变株90s-高2产量达到6.178g/L，较诱变前产量(5.319g/L)提高16.15%。最终得到稳定高产GABA的乳酸菌突变菌株90s-高2产GABA比诱变前的HX-3-6菌株产量提高 25.98%。聞創沟燴鐺險爱氇谴净。关键词：乳酸菌；GABA；ARTP；发酵；遗传稳定Lactic acid yield -amino butyric acid plasma Breeding残骛楼諍锩瀨濟溆塹籟。Ye Yang(Biochemical Engineering,College of Engineering,An hui University,Wuhu 241000)酽锕极額閉镇桧猪訣锥。ABSTRACT -amino butyric acid (-amino butyric acid,abbreviated GABA) is a non-protein amino acids are widely distributed in nature,it has analgesic and to promote growth hormone secretion and prevention of Alzheimers and other physiological function.彈贸摄尔霁毙攬砖卤庑。To improve the production of GABA,the Atmospheric and Room Temperature Plasma(ARTP) was used to mutagenesis HX-3-6 (the strain keep in the experiment),and then mutations was used for future fermentation whose fatality rate were above 90%, the gradient plate with GABA and the size of the colony were used for the first screening,and then fermentation medium was used for the next screening to test the genetic stability of mutant strains of lactic acid bacteria .Obtained stable mutants L-120-1 and the yield reached 5.828 g/L,than the pre-mutagenic production (4.904g/L) improved 18.84%,and then the L-120-1 was mutagenesis, a stable mutants 90s-high 2 was got and production reached 6.178g/L,compared with before mutagenesis production increase in 6%.Finally the high production mutant 90s-2 compared to the strain of HX-3-6 improved 25.98% .謀荞抟箧飆鐸怼类蒋薔。Keyword: Lactobacillus;GABA ;Ferment ;Genetic stability厦礴恳蹒骈時盡继價骚。目 录插图清单图2-1 GABA的酶标仪标准曲线12图3-1 HX-3-6的生长曲线13图3-2 HX-3-6的诱变致死率曲线图14图3-3 HX-3-6诱变后GABA的产量15图3-4 L-120-1的生长曲线和Ph值曲线16图3-5 L-120-1的诱变致死率曲线17图3-6 L-120-1诱变后菌株的GABA产量和OD值的曲线18表格清单表1-1实验药品（试剂）6表1-2试验仪器7表4-1 乳酸菌HX-3-6 所测OD600值22表4-2 乳酸菌HX-3-6诱变致死率22表4-3 乳酸菌HX-3-6诱变后GABA的产量22表4-4 乳酸菌L-120-1所测的OD600 和pH值23表4-5 乳酸菌L-120-1诱变致死率23表4-6 乳酸菌L-120-1诱变后GABA产量23引言-氨基丁酸(-amino butyric acid，GABA)是一种广泛分布于动植物体内的非蛋白氨基酸，具有许多重要的生理功能。在植物中，-氨基丁酸(GABA)参与了植物抵御逆境胁迫反应，对病虫害的保卫反应等过程。在动物中，GABA作为哺乳动物中枢神经系统一种主要的抑制性神经递质，参与脑循环生理活动，具有降低血压、治疗癫病、镇静安神、促进睡眠、增强记忆力、控制哮喘、调节激素分泌、促进生殖、肾肝功能活化等功能，被广泛的应用于食品、医药等工业。因此对其作用机理、制备研究己经成为一个热点。目前主要通过大肠杆菌发酵生产GABA，但大肠杆菌存在着安全卫生方面的极大隐患。因此通过诱变的方法获得高产GABA的安全性新型菌种具有重要的意义13。茕桢广鳓鯡选块网羈泪。在食品和医药工业中，利用公认的安全性益生菌乳酸菌进行发酵生产GABA具有更广泛的前景，目前工业生产的GABA产量较低4，5，故为提高GABA产量本实验采用等离子诱变乳酸菌育种选育鹅娅尽損鹌惨歷茏鴛賴。紫外线是一种最常用有效的物理诱变因素，其诱变效应主要是由于它引起DNA结构的改变而形成突变型6。但是紫外诱变育具有育种过程繁重，诱变效果差等问题。籟丛妈羥为贍偾蛏练淨。化学诱变是通过采用一些分子结构不太稳定的化学诱变剂进行的，它通过化学试剂造成生物的损伤和错误修复，产生突变体7。但是化学诱变育种过程复杂以及具有对人体危害比较大的操作环境。預頌圣鉉儐歲龈讶骅籴。本实验采用一种新型微生物诱变育种方法-常压室温等离子体（ARTP)诱变育种系统。ARTP是近几年来发展起来的一种等离子体源，能够在大气压下产生温度在25-40之间的、具有高活性粒子浓度的等离子体射流，等离子体具有气温低、电子温度高的非平衡特性以及活性离子浓度高的特点。据科学研究表明，等离子体中的活性粒子作用于微生物，能够使微生物细胞壁/膜的结构及通透性改变，并引起基因损伤，进而使微生物基因序列及其代谢网络显著变化，最终导致微生物产生突变8。渗釤呛俨匀谔鱉调硯錦。ARTP诱变育种系统具有操作安全、过程简单、突变率高、经济环保等优点；所以本实验利用ARTP对产GABA的乳酸菌进行诱变育种将诱变后的突变菌株用含有代谢产物GABA的培养基进行抗性初筛，再利用发酵培养基进行复筛进行遗传稳定性试验，最终得到稳定高产GABA的乳酸菌突变菌株。铙誅卧泻噦圣骋贶頂廡。第一章 绪论1.1 -氨基丁酸的研究现状GABA在食品中的研究和应用始于上世纪八十年代中期，应用产品以日本茶饮料Gabaron为代表。用Gabaron茶饮料饲喂患原发性高血压的小白鼠，数周内发现其血压由175-180mmHg降低至150mmHg，同时并未发现小白鼠的其它任何生理异常现象9。1994年，Takayo等在研究用水浸泡的米胚芽的氨基酸分布时，发现经过发酵处理的米胚芽中GABA的积累量很高，达到200-300mg/100g10。1996年，富含GABA的米胚芽制品在日本实现了商业化。神经生理及神经医学的研究表明GABA是一种重要的活性物质，在人脑中，虽然GABA可由脑部的谷氨酸在专一性较强的谷氨酸脱羧酶作用下转化而成，但是年龄的增长和精神压力的加大使GABA的积累异常困难，而通过日常饮食补充可有效改善这种状况，从而促进人体健康11。擁締凤袜备訊顎轮烂蔷。最近，日本科学家利用米胚芽等原料开发制造的富含GABA的功能食品配料，已经广泛地应用于饮料、果酱、糕点、饼干、调味料等制品中。现在还有报道，应用生物技术制造的高浓度GABA饮料以及利用乳酸菌等制作的富含GABA的食品配料，均可直接作为或者用于抗高血压、增进脑机能及肝功能的功能食品。我国有关GABA食品的研究开发报道极少，这方面的研究开发尚属于起步阶段。贓熱俣阃歲匱阊邺镓騷。1.2 常压室温等离子诱变系统1.2.1 ARTP生物育种基本原理常压低温等离子体是近几年才开始研究的一种新型等离子体源，具有气体温度低、活性粒子浓度高、能量高、操作简便等优点。基础实验研究表明，常压低温等离子体中的高浓度活性粒子能够作用于微生物的遗传物质，使其在短时间内产生致畸突变，是一种效果良好的诱变源12。相比传统的物理诱变方法（如离子束注入、放射线诱变）和化学诱变方法，常压低温等离子体诱变方法具有操作安全、简便、对人体无任何副作用、对环境无污染等特点。 坛摶乡囂忏蒌鍥铃氈淚。1.2.2 ARTP的发展优势常规的诱变育种方法有化学诱变育种和物理诱变育种。 微生物的诱变育种，主要是以人工诱变的手段来诱发微生物基因突变，从而改变遗传结构和功能，再通过筛选，从很多的变异菌体中筛选出所需的产量高、性状优良的突变株，并且找出最佳培养基及最佳培养条件，使其能在最适环境条件下合成所需产物。蜡變黲癟報伥铉锚鈰赘。清华大学等离子体健康科技研究组（工程物理系）、环境生物技术实验室（化学工程系）联合北京思清源生物科技有限公司，采用国际先进的常压低温等离子体产生技术，结合近几年的最新研究成果与自动控制方法，联合研制出第二代ARTP生物育种机。该育种机具有工作稳定、无需预热、操作简便、人机交互性能好等优点，能够在工业环境下产生常压低温等离子体使菌种产生诱变，加快诱变育种进程，提高工业生产效率13。買鲷鴯譖昙膚遙闫撷凄。ARTP诱变的研究能够促进等离子体与生物科学的融合和交叉，一方面推动具有多参数、高通量、可控性更强的多通道的常压低温等离子体技术装备的发展与创新，另一方面，通过对不同生物分子及物种的调控与作用方法研究，形成了等离子体生物技术（Plasma biotechnology）的新研究领域-生命科学。綾镝鯛駕櫬鹕踪韦辚糴。1.3 立题依据与意义-氨基丁酸(-amino butyric acid，GABA)是一种非蛋白质氨基酸，是哺乳动物中枢的一种抑制性递质，GABA具有降血压、增强记忆力、活化肾功能、改善肝功能、防治肥胖、营养神经细胞等作用等诸多功能14，研究通过微生物发酵法获得GABA具有重要意义。驅踬髏彦浃绥譎饴憂锦。随着GABA的生理功能特性逐渐被人类认识，利用GABA的富集技术开发富含GABA的保健食品必将是一个很有潜力的研究领域，化学合成GABA安全性较差，植物富集GABA含量不高，利用生物合成法中的微生物(乳酸菌)发酵生产GABA显示了广阔的开发前景15。但是乳酸菌发酵产GABA的工业产量不高。猫虿驢绘燈鮒诛髅貺庑。鉴于紫外诱变育种具有育种过程繁重，诱变效果差等问题；化学诱变育种过程复杂以及具有对人体危害比较大的操作环境。锹籁饗迳琐筆襖鸥娅薔。本实验利用新型诱变技术（常压室温等离子体诱变育种系统）对乳酸菌进行诱变育种，从而得到高产GABA的乳酸菌菌种。構氽頑黉碩饨荠龈话骛。 1.4 本课题主要研究的内容（1)本实验对实验室已筛选出的产-氨基丁酸的乳酸菌进行常温室压等离子体诱变，并使用梯度平板对诱变株进行初步筛选。輒峄陽檉簖疖網儂號泶。(2)对大量突变株进行发酵培养复筛，以期获得生长速率快，高产-氨基丁酸的乳酸菌。 第2章 实验材料2.1 菌种来源 由安徽芜湖安徽工程大学生物技术实验室保藏，编号为HX-3-6。2.2 实验药品表1-1-实验药品（试剂）药品名称药品类型生产厂家琼脂生化试剂国药集团化学试剂有限公司葡萄糖分析纯国药集团化学试剂有限公司酵母提取物生化试剂国药集团化学试剂有限公司胰蛋白胨生化试剂国药集团化学试剂有限公司鱼粉蛋白胨生化试剂国药集团化学试剂有限公司吐温分析纯国药集团化学试剂有限公司NaCl分析纯国药集团化学试剂有限公司MgSO4生化试剂上海试剂四厂硫酸锰生化试剂蚌埠化学试剂厂95%乙醇分析纯国药集团化学试剂总厂乙酸钠分析纯蚌埠化学试剂厂磷酸氢二钠分析纯蚌埠化学试剂厂丁二酸钠分析纯生工生物上海有限公司柠檬酸三胺分析纯国药集团化学试剂总厂谷氨酸钠分析纯南京吉瑞化学试剂有限公司氢氧化钠分析纯国药集团化学试剂总厂GaCO3化学试剂蚌埠化学试剂厂苯酚分析纯国药集团化学试剂总厂安徽工程大学毕业论文徽工程大学毕业设计（论文）2.3 实验仪器表1-2-试验仪器实验仪器生产厂家SPX250BS生化培养箱上海新苗医疗器械制造有限公司ARTP诱变育种系统-北京思清源物科技有限公司全自动酶标仪 Multiskan Fc塞默非世尔仪器有限公司美菱BCD-181KC冰箱美菱电器有限公司全自动高压灭菌锅 HVE-50华夏行仪器有限公司SW-CJ-CO型净化工作台苏州净化设备有限公司DHG9143BS电热恒温鼓风干燥箱上海新苗医疗器械制造有限公司LDZX50KBS立式电热压力蒸汽灭菌锅金坛市荣华仪器制造有限公司恒温水浴锅HH-2 金坛市杰瑞尔电器有限公司SK1快速混匀器金坛市杰瑞尔电器有限公司FC104电子天平上海精密科学仪器有限公司PHSJ3F型实验室pH计常州国华电器有限公司100l精密微量移液器GilsonSAS.France1000l精密微量移液器GilsonSAS.France5000ul精密微量移液器GilsonSAS.France80-2离心机江苏金檀市荣华仪器制造有限公司15W紫外灯苏州净化设备有限公司实验室pH计 PHSJ-3F上海精密科学仪器有限公司电炉丹阳市飞和五金电器厂可见分光光度计 722上海佑科仪器仪表有限公司磁力搅拌器 SK-1金坛市杰瑞尔电器有限公司美的电冰箱BCD195TC合肥荣氏达冰箱有限公司高通量恒温振荡器Canvic HTS-T008上海世平实验设备有限公司不锈钢蒸馏水器上海生银医疗仪器仪表有限公司本试验还需用品：Eppendorf离心管、烧杯、玻璃棒、镊子、试剂瓶、量筒、洗瓶、石棉网、锥形瓶、培养皿、剪刀、白铁锅、酒精灯、试管架、冰袋、试剂勺、涂布棒、甘油管等。尧侧閆繭絳闕绚勵蜆贅。2.4 培养基及相关试剂的配制（1）MRS液体培养基：鱼粉蛋白胨10g 酵母提取物10g 葡萄糖5g 乙酸钠5g 磷酸氢二钾0.2g 柠檬酸三胺0.2g 硫酸镁0.2g 硫酸锰0.05g 吐温-80 0.1mol/L 水1000mL pH6.5 115灭菌25分钟识饒鎂錕缢灩筧嚌俨淒。（2）MRS固体培养基：鱼粉蛋白胨10g 酵母提取物10g 葡萄糖5g 乙酸钠5g 磷酸氢二钾0.2g 柠檬酸三胺0.2g 硫酸镁0.2g 硫酸锰0.05g 琼脂2025g 水1000mL pH6.5 115灭菌25分钟凍鈹鋨劳臘锴痫婦胫籴。（3）含GABA的MRS固体培养基：鱼粉蛋白胨10g 酵母提取物10g 葡萄糖5g 乙酸钠5g 磷酸氢二钾0.2g 柠檬酸三胺0.2g 硫酸镁0.2g 硫酸锰0.05g 琼脂2025g GABA 60g 水1000mL pH6.5 115灭菌25分钟恥諤銪灭萦欢煬鞏鹜錦。（4）发酵培养基：酵母提取物5g 胰蛋白胨5g 葡萄糖10g 丁二酸钠5g 1%的谷氨酸钠 水1000mL pH6.5 115灭菌25分钟鯊腎鑰诎褳鉀沩懼統庫。（5）生理盐水溶液：1.8gNaCl溶于200mL蒸馏水。115灭菌25min。（6）硼酸缓冲液1.525g硼砂和0.247g硼酸溶解后定容至100mL。 (3)谷氨酸钠溶液：0.1g的谷氨酸钠加入100mL的无菌水中，配制用于对照的谷氨酸钠溶液。 第3章 实验方法3.1 对乳酸菌HX-3-6进行ARTP诱变育种3.1.1 乳酸菌HX-3-6生长曲线的测定 （1）菌种的活化：将标准储备菌株取出，并恢复至室温后，按10%（v/v）接种量接种1mL乳酸菌于装有9mL 的 MRS液体种子培养基的50mL三角瓶中，静置于30培养箱中培养24h待用。硕癘鄴颃诌攆檸攜驤蔹。（2 ）乳酸菌生长曲线绘制：取出上述活化后的菌悬液，按10%（v/v）接种量接种接种1mL菌悬液到装有9mL MRS液体培养基的50mL三角瓶，置于30培养箱中培养，每隔3h用分光光度计在600nm条件下测得菌液OD值，并以时间为横坐标，OD值为纵坐标绘制乳酸菌的生长曲线。 阌擻輳嬪諫迁择楨秘騖。同时用pH计对乳酸菌菌悬液的pH值进行测定。3.1.2 ARTP诱变（1） 菌悬液的制备：将标准储备菌株取出，并恢复至室温后，按10%（v/v）接种量接种1mL乳酸菌于装有9mlL的 MRS液体种子培养基的50mL三角瓶中，静置于30培养箱中培养待用，取1mL待用菌液于1.5ml的离心管中，5000r/min离心5分钟，离心后去除上清液加入1mL的无菌水使用振荡器震动摇匀，制成菌悬液备用。氬嚕躑竄贸恳彈瀘颔澩。（2） ARTP诱变操作：在无菌操作台上使用20L移液枪吸取上述制备好的菌悬液10L到灭菌的小铁片上（共做8组），8组菌液用ARTP进行诱变处理的时间分别为0s、30s、 60s、 90s、 120s、 150s、 180s、210s、240s。釷鹆資贏車贖孙滅獅赘。常压室温（ ARTP ）等离子诱变育种装置，在本实验中使用条件如下所述；供电电源：220V，50Hz，电压波动范围 5% ，气体流量选用10SLM，温度2040以下，功率200W。怂阐譜鯪迳導嘯畫長凉。用镊子将待处理样品载片放置到旋转定位台上方菌片固定圆形凹槽内，之后调节旋转定位台高度，使待处理样品距离等离子体发生器出口为 3 mm，样品放置完毕后，关闭操作室门，选择照射时间。谚辞調担鈧谄动禪泻類。3.1.3 后培养及平板计数（1）后培养：将诱变后的载有菌液的小铁片迅速放入装有1.5mL MRS液体培养基的离心管中，然后将诱变的乳酸菌放入恒温培养箱中30培养2h。嘰觐詿缧铴嗫偽純铪锩。（2）平板计数：2h后取出诱变菌液使用振荡器将离心管中的菌液混匀，用1000L移液枪吸取0.5mL置于装有4.5mL生理盐水的7mL离心管中，依次稀释至10-3、10-4、10-5、10-6，取稀释倍数10-4、10-5的两个梯度菌悬液（0s取稀释倍数为10-5、10-6的两个梯度菌悬液涂布平板），用200L移液枪吸取100L加入MRS平板，涂布均匀，每个稀释度做三个平行。将涂布后的平板倒置放入恒温培养箱中，30培养72h。熒绐譏钲鏌觶鷹緇機库。（3）ARTP致死率的计算：培养72h后对平板上的菌落进行计数，并与相对应浓度的对照组菌落数目进行对照，按照公式：致死率=（对照组-诱变菌落数）/对照菌落数，计算致死率。鶼渍螻偉阅劍鲰腎邏蘞。3.1.4 突变株的筛选（1） 梯度平板的制备：在无菌操作台，先将平板倾斜15度左右放置，倒入约10mL MRS琼脂培养基，待凝固后放回水平位置，再倒入等体积的含有GABA浓度为60g/L的MRS培养基，凝固后形成梯度平板备用。纣忧蔣氳頑莶驅藥悯骛。（2） 突变菌株的初筛：将诱变后菌株分别稀释10-4、10-5涂布梯度平板，将涂布后的梯度平板倒置放入恒温培养箱中，30培养72h（0s不需要涂布梯度平板）。培养72h后按GABA浓度以及菌落的大小挑选单菌落；验证菌落大小和抗GABA浓度高低与菌株产GABA的相关性。颖刍莖蛺饽亿顿裊赔泷。（3）突变菌株的复筛：对突变菌株利用发酵培养基进行复筛，发酵条件为装液量50mL的250mL的三角瓶。在恒温培养30静置培养72h；72h后在640nm条件利用酶标仪测突变菌株发酵产GABA的产量。濫驂膽閉驟羥闈詔寢賻。3.1.5 GABA含量的测定取1ml发酵液于1.5mL离心管中10000r/min离心2min，吸取0.5mL上清液用无菌水稀释10倍备用。銚銻縵哜鳗鸿锓謎諏涼。取0.8mL备用液于平底试管中。再依次分别加入1mol/L的碳酸钠溶液0.2mL，0.2ml/L Ph10.0的硼酸盐缓冲液0.75mL，6%的重蒸苯酚2.5mL，混匀后加入次氯酸钠(NaClO)溶液2mL，混匀后放置48分钟，然后沸水浴10min，立即冰浴20min，待溶液出现蓝绿色后，加入4mL 60%的乙醇溶液，混匀后室温3放置20min，待上述溶液制作好后，从每组溶液中吸取200L加入到酶标板上，用酶标仪在640nm条件下对每组溶液进行GABA的含量测定；用酶标仪测定GABA的标准。挤貼綬电麥结鈺贖哓类。 图3-1 GABA的酶标仪标准曲线3.1.6 菌种保藏对反复筛选并经过多次传代得到的高产GABA的乳酸菌突变菌株用甘油管在-70进行冷冻保种。3.2 对乳酸菌L-120-1进行ARTP诱变育种3.2.1 菌种来源L-120-1是原始菌株HX-3-6菌株经过ARTP诱变处理后，筛选得到的遗传性及产量稳定的突变菌株。赔荊紳谘侖驟辽輩袜錈。3.2.2 实验操作基本流程菌种的活化 乳酸菌生长曲线绘制 菌悬液的制备 ARTP诱变操作 后培养 平板计数 ARTP致死率的计算 突变菌株的筛选 GABA含量的测定 菌种保藏。塤礙籟馐决穩賽釙冊庫。第4章 结果与讨论4.1 乳酸菌HX-3-6 ARTP诱变结果 4.1.1 HX-3-6生长曲线的测定 图4-1 HX-3-6的生长曲线图表分析：乳酸菌HX-3-6乳酸菌经过活化处理后，使用分光光度计在A600条件下制成HX-3-6乳酸菌生长曲线如图4-1所示， 由图可以看出，菌体在接种培养后经过短暂的适应期进入对数生长期，约在18h左右进入对数后期，此期间菌体生长代谢旺盛且稳定是诱变的最佳时机。同时可以看出菌株约在21h后进入稳定期。裊樣祕廬廂颤谚鍘羋蔺。4.1.2 乳酸菌HX-3-6致死率测定图4-2 HX-3-6的诱变致死率曲线图由图4-2可以看出：HX-3-6乳酸菌经过ARTP诱变处理后，乳酸菌诱变致死率随着菌株诱变时间的增长而增大。90s的致死率在77.81%，120s的致死率在91.2%；实验中挑取致死率达到90%的菌株进行筛选，以期获得高产菌株。仓嫗盤紲嘱珑詁鍬齊驁。 4.1.3 HX-3-6诱变后GABA含量的测定图4-3 HX-3-6诱变后GABA的产量由图4-3可以看出，经过第一次诱变之后发现，与对照组相比大部分经过诱变的菌株产GABA的产量有所提高；其中120-1 GABA的产量为5.828g/L；GABA产量最高的突变菌株l-120-1较诱变前产量提高18.84%。并经过多次传代产量稳定。绽萬璉轆娛閬蛏鬮绾瀧。 4.2 乳酸菌L-120-1 ARTP诱变结果4.2.1 L-120-1生长曲线的绘制图4-4 L-120-1的生长曲线和pH值曲线乳酸菌 L-120-1生长曲线如图4-4所示， 由图可以看出，菌体在接种培养后经过短暂的适应期进入对数生长期，约在14h左右进入对数后期，此期间菌体生长代谢旺盛且稳定是诱变的最佳时机。同时可以看出菌株约在18h后进入稳定期。乳酸菌L-120-1由于是乳酸菌HX-3-6诱变选育后的稳定高产菌株，L-120-1乳酸菌的基因较HX-3-6乳酸菌的基因可能发生改变，所以L-120-1乳酸菌生长曲线与HX-3-6乳酸菌的生长曲线有所差别。乳酸菌L-120-1经过上述步骤活化处理后，使用pH计测出乳酸菌L-120-1培养时pH变化如图4-4所示，在培养时间为024h之间培养菌液中Ph值从6.5一直在降低5.0。培养时间在24h之后培养菌液中Ph值基本保持不变;与HX-3-6培养过程中pH基本保持不变有明显的区别，而L-120-1的pH和生长曲线走势存在相关性，可能是由于基因改变导致的结果。骁顾燁鶚巯瀆蕪領鲡赙。4.2.2 L-120-1致死率测定图4-5 L-120-1的诱变致死率曲线由图4-5可以看出：L-120-1乳酸菌经过ARTP诱变处理后，乳酸菌诱变致死率随着菌株诱变时间的增长而增大。乳酸菌菌株在诱变时间为90s时致死率为95.8%，挑取90s梯度平板上突变菌株进行初筛与复筛。瑣钋濺暧惲锟缟馭篩凉。4.2.3 L-120-1诱变后在90s GABA含量测定图4-6 L-120-1诱变后菌株的GABA含量和OD值的曲线图4-6中90s-低1，90s代表诱变时间，低代表GABA低浓度（中代表中浓度，高代表高浓度)，1代表菌落较大（2代表菌落适中，3代表菌落较小）。从图4-6可以看出L-120-1乳酸菌诱变筛选后与对照组相比，90s-高1，90s-高2突变株产GABA的产量明显提高，产量分别为6.116g/L、6.178g/L，较诱变前GABA的产量分别提高14.98%，16.15%。鎦诗涇艳损楼紲鯗餳類。本实验为获得生长较快且GABA产量高的菌株，但对突变菌株OD值进行测定与GABA的产量相关性表现不明显，即GABA的产量较高的并没有表现出较高的OD值，因此，有待于进一步的诱变筛选。栉缏歐锄棗鈕种鵑瑶锬。结论与展望微生物育种的目的就是要把生物合成的代谢途径朝人们所希望的方向加以引导， 或者促使细胞内发生基因突变后优化遗传性状， 人为地使某些代谢产物过量积累， 获得所需要的高产、优质和低耗的菌种。而基因突变作为很重要的途径之一，一直被广泛应用16。目前， 国内微生物育种界主要采用的仍是常规的物理、生物及化学因子等诱变方法使之改组。本次实验是通过新型诱变方法常压室温等离子体（ARTP）诱变育种系统。辔烨棟剛殓攬瑤丽阄应。通过本次实验得出以下结论：（1）从HX-3-6乳酸菌第一次诱变前的生长曲线得出该菌株的对数期在321h，约在18h进入对数期后期，该时间段为诱变最佳时机。经诱变，对致死率达到90%的突变进行筛选，最后筛选出突变菌L-120-1产量为5.828g/L，较出发菌株产量提高18，84%，峴扬斕滾澗辐滠兴渙藺。（2）本次实验所测得的乳酸菌HX-3-6的生长曲线和乳酸菌L-120-1的生长曲线有所不同，可能是乳酸菌诱变后基因发生改变。詩叁撻訥烬忧毀厉鋨骜。（3）本实验对乳酸菌菌株L-120-1进行诱变后，得到90s-高2的突变菌株产GABA产量最高的突变菌株较原始乳酸菌菌株HX-3-6产量提高25.98%。则鯤愜韋瘓賈晖园栋泷。（4）对出发乳酸菌菌株L-120-1进行诱变处理，诱变初筛后从梯度平板上的高、中、低三个浓度中挑选单菌落进行筛选。筛选后得到90s-高2的突变菌株的产量最高，较诱变前L-120-1(5，319g/L）产量提高16.15%。胀鏝彈奥秘孫戶孪钇賻。由于时间的不足本次实验最终得到的产GABA的乳酸菌提高率不是太理想，建议可以在以下方面开展进一步工作：鳃躋峽祷紉诵帮废掃減。（1）对突变株进行紫外诱变育种和化学诱变育种相结合的复合育种育种，以期获得高产GABA乳酸菌突变菌株。稟虛嬪赈维哜妝扩踴粜。（2）将诱变与高通量筛选相结合，提高筛选突变株的效率，获得高产菌株。（3）对诱变后获得的高产菌株与基因工程相结合，探讨诱变导致高产的机制与原理。致 谢回首大学四年的生活，充实而快乐，特别是毕业设计的顺利完成给我的大学活画上了完满的句号。本论文从课题的选择到项目的最终完成，从结果分析到最终成文，薛正莲教授始终对我细心指导严格要求，并多次询问实验进程，为我答疑解难，帮助我开拓研究思路，热忱鼓励。在完成论文的过程中，我的动手能力、分析和解决问题的能力，以及独立思考的能力都得到了很大的提高。在此谨向薛老师致以诚挚的谢意和崇高的敬意！陽簍埡鲑罷規呜旧岿錟。感谢生技专业各位专业课老师对我的悉心教导。正是因为有了这些专业基础知识，我才能了解到实验的原理，并且设计实验方法完成实验。在此，谨向老师们表示衷心的感谢！沩氣嘮戇苌鑿鑿槠谔應。在此次毕业实验的过程中，特别感谢梁慧学姐及其他几位学长学姐对我的指导和支持，还有实验室的其他同学的热心帮助，在此一并致谢！钡嵐縣緱虜荣产涛團蔺。 叶杨 2014年6月4日参考文献 1杨胜远，陆兆新，吕风霞，别小妹. -氨基丁酸的生理功能和研究开发进展J. 食品科学，2008，09（04）：528-533懨俠劑鈍触乐鹇烬觶騮。2温博贵：国外医 学参考资料(中山医学院 )，2011，11( 05)：132-1343何熙璞，张敏，李俊芳，王邕. -氨基丁酸的生理学功能及研究现状J. 广西大学学报(自然科学版，2007，7（02）：464-466謾饱兗争詣繚鮐癞别瀘。4李瑞芝，郭建友，李昌逸.焦虑症-氨基丁酸受体机制与药物干预研究进展J.中国药理学报，2010，26（9）：221-223呙铉們欤谦鸪饺竞荡赚。5黄俊. 利用短乳杆菌制备-氨基丁酸相关过程研究D.浙江大学，2006.6胡超. 高产-氨基丁酸酵母菌株的诱变选育及发酵条件优化D.湖南农业大学，2011.7梁金钟，李雯，王风青. 产-氨基丁酸乳酸菌的筛选及诱变育种J. 食品科学，2013，23（06）：228-232莹谐龌蕲賞组靄绉嚴减。8 B. Mandal， K. Nath， D. Das， Improvement of biohydrogen production under decreased partial pressure of H2 by Enterobacter cloacae， Biotechnol. Lett. 2009，12（04）： 831835麸肃鹏镟轿騍镣缚縟糶。9林亲录，王婧，陈海军. -氨基丁酸的研究进展J. 现代食品科技，2008，21（05）：496-5