PNH-阵发性睡眠性血红蛋白尿的流式细胞术检测.ppt

阵发性睡眠性血红蛋白尿的流式细胞术检测 PNH paroxysmalnocturnalhemoglobinuria 是一种罕见的获得性克隆造血干细胞疾病 但近年来有增多趋势 我国北方多于南方 半数以上发生在20 40岁青壮年 男性多于女性 与遗传及种族无关 本病起病隐袭缓慢 呈慢性过程 以贫血 出血为首发症状者较多 以血红蛋白尿起病者较少 血红蛋白尿 睡眠有关 早晨较重 下午较轻尿液外观为酱油或红葡萄酒样 伴乏力 胸骨后及腰腹疼痛 发热等 原因 因为补体作用最适宜的pH是6 8 7 O 而睡眠时呼吸中枢敏感性降低 酸性代谢产物积聚 研究历史 Strubing第一次报道PNHHam和Dingle证明了PNH患者的红细胞在血清酸化条件下 易发生溶血 这就是现在普遍使用的Ham实验1983年证实PNH患者GPI合成异常1993年pig a基因突变 流式细胞术 原理 X染色体上PIG A 造血干细胞经获得性体细胞基因 突变导致糖化肌醇磷脂 GPI 锚合成障碍导致由GPI锚接在细胞膜上的一组膜蛋白丢失 包括CD16 CD55 CD59等 GPI锚连接蛋白 补体调接蛋白衰变加速因子 DAF或CD55 膜攻击复合物抑制因子 MACIF或MIRL或CD59 补体C8结合蛋白 HRF或C8bp 膜辅助蛋白 MCP 粘附分子淋巴细胞功能相关抗原 3 LFA 3或CD58 Blast 1 CD48 CD67 CD66 GPI锚连接蛋白 酶类红细胞乙酰胆碱脂酶 AchE 中性粒细胞碱性磷酶酸酶 NAP 5 外核酸酶 CD73 受体类中性粒细胞III型Fc受体 FcRIIIb或CD16 单核细胞分化抗原 CD14 尿激酶型纤溶酶原激活物受体 u PAR 血型抗原CD55携带的Comer抗原 AchE携带的Yt抗原 1型细胞CD59完全阳性 补体激活途径 C1C1C2 C4C4b2b C3转化酶 C3C3bP 备解素 PC3bBbC3bB C5转化酶 C4b2b3b或PC3bBbC8C9C6C7C5C5bC5b678C5b 9 MAC CD59 替代途径 经典途径 CD55 Ag Ab 分析 1 红系及粒系FSC SSC设门报告标本中CD55 CD59阴性比例 做20 30份正常人血样划定阳性区 区 范围同型阴性对照界定 区范围 中间的区域即为 区 根据CD59可以将PNH细胞分为3型1型细胞CD59完全阳性正常细胞2型细胞CD59部分阳性补体中度敏感细胞3型细胞CD59完全阴性补体敏感细胞 CD55和CD59同时部分或完全缺失是PNH的典型表现 单GPI缺失不能确诊 CD59重要性大于CD55单CD55缺乏时并不因此改变红细胞对补体的敏感性而造成溶血CD59的缺失会增加补体的敏感性临床上以CD59缺失作为诊断标准是一个趋势 解决了一切以补体溶血为基础的实验诊断方法在诊断PNH的不确定性 意义 其它细胞的PNH检测 PNH患者的红细胞 粒细胞 单核细胞及淋巴细胞上GPI锚连膜蛋白部分或全部丧失 粒细胞 单核细胞 淋巴细胞 红细胞骨髓PNH克隆出现比外周血早 网织红细胞略早于红细胞 其它细胞的PNH检测 应用FSC SSC设门分析时会有许多脱颗粒的中性粒细胞 这时只使用物理特征无法准确设定粒细胞门了 这时必须使用系列标志 SSC设门 CD15 CD33 CD64设门 分析单核CD14 CD55 CD59 PNH病人检测GPI缺乏的血小板不容易分辨不能只根据淋巴细胞上GPI相关蛋白的表达来诊断 与其他实验比较 1 酸溶血试验 Ham试验 患者红细胞与含5 盐酸的正常同型血清混合 pH6 4 37 孵育2小时 溶血明显 本试验特异性高 敏感性差 2 蛇毒因子溶血试验蛇毒因子能通过补体交替途径 使补体敏感的红细胞发生溶血 本试验特异性强 敏感性优于酸溶血试验 3 热溶血试验和蔗糖溶血试验因特异性差 常作为筛选方法 具有PNH克隆的血液病 检测粒细胞GPI锚连蛋白表达病种检测例数缺失例数 AA11525 22 MDS399 23 并发现MDS有PNH表达者ATG 人胸腺细胞免疫球蛋白 治疗有效 AnInternMed1999 131 401 PNH和AA关系 相当密切 可以相互转化且并存AA PNH较多 15 PNH AA少20 30 PNH可伴骨髓再障AA ATG治疗后 PNH10 31 AA PNH综合征16 5 我国 50 AA外周血或骨髓可检出PNH克隆AA PNH生存率要高于PNH AAMDS RA如捡出PNH克隆者预后好 且ATG 人胸腺细胞免疫球蛋白 治疗有效 PNH对AA和MDS的 自然治疗 而 AA救了PNH PNH克隆见于淋巴增殖性疾病 检测病种例数NHL87HD55红细胞CD55 CD59CLL49缺失检出率9 2 ALL22HCL4 HematolJ2001 2 33 PNH克隆见于浆细胞病 检测红细胞CD55 CD59缺失病种检测例数缺失例数 MM626WM72MGUS61HCD21合计7710 12 9 IntJHematol2002 75 40 FLAER 嗜水气单胞菌溶素变异体 FLAER 1998年Diep等报道嗜水气单胞菌 HEC 毒素能特异地与细胞膜上GPI锚连蛋白结合 随后立即聚合成多具体 插入细胞膜脂质双层 在膜上形成孔洞致溶破 PNH细胞缺乏GPI蛋白而抵抗毒素保持细胞完好 FLAER FLAER在所有具有GPI锚连蛋白的白细胞上都有特异性表达 所以正常人及非PNH贫血FLAER成100 阳性 是目前诊断PNH最敏感 特异的方法 FLAER对PNH克隆检出的敏感性为0 1 其它靶向标记检出率的敏感性为1 结果分析 1 设门CD45 SSC2 标记CD15 CD14 CD45 FLAER检测PNH粒 单核及淋巴细胞 报告标本中各系细胞FLAER阴性比例 FLAER 目前FLAER一般用于有核细胞的检测 不能评价红细胞的PNH克隆 由于红细胞表面没有气单胞菌溶素前体产生所需要的蛋白水解酶类 尽管表达在红细胞表面的血型糖蛋白不是锚连蛋白