生物制品学实验报告----三价副猪嗜血杆菌油乳剂灭活疫苗的制备及检验.doc

三价副猪嗜血杆菌油乳剂灭活疫苗的制备及检验副猪嗜血杆菌是猪格拉泽氏病(Glassers disease)的病原菌，属于巴斯德菌科嗜血杆菌属， 是一种多形态、非溶血性、不运动、NAD 依赖型、革兰氏阴性细小杆菌。对营养要求比较苛刻，培养时必须供给含有V 因子（NAD）或（NADP)的新鲜血液才能生长。此菌有多种血清型，其中强毒力的有1、 5、10、12、13、14型，常可致死动物；中等毒力的有2、 4、8、15型，多表现为多发性浆膜炎，不致死；低毒力的有3、 6、7、9、11型，常无临床表现和病变。在中国，4型和5型是主要分离株，而澳大利亚和丹麦的主要血清型为5型和13型。在研究2、4、5、12、13和14型间的交叉保护性时发现，除了血清12型制备的单菌和血清2、12型制备的二价苗外，其他型都能对同源菌株产生保护；用血清4型制备的菌苗，可以保护血清5型的攻击；用血清4、5型制备的二价菌苗，可以抵抗血清13、14型的攻击（仔猪病变的严重性和病死率明显降低）。三价灭活疫苗主要用于预防猪副嗜血杆菌病。该苗针对性强，安全可靠，能有效降低发病率和死亡率。一 、实验目的1 了解副猪嗜血杆菌油乳剂灭活苗制作的流程。2 掌握副猪嗜血杆菌油乳剂灭活苗制作的操作技术。二、乳化的原理乳化剂能降低分散物的表面张力，在微滴（粒）表面形成薄膜或双片层，以阻止微滴（粒）的相互凝结。三、材料，试剂，培养基（1）器材：不锈钢锅（或瓷锅）、电炉、乳化器、量筒、玻璃棒、离心机、吸管等。（2）试剂：、甲醛（灭活剂）、白油（抗原油相）、Span-80（油相乳化剂）、Tween-80（抗原水相乳化剂）、硬脂酸铝（稳定剂）、4、5、13型分离菌株（抗原）。（3）培养基的制备：1、配制0.2%的V因子准确称0.2g的NAD（辅酶I）加入100mlddH2O，用0.22um的细菌过滤器过滤除菌，4C保存备用。2、制备TSA培养基称16gTSA加入348ml双蒸水， 121C高压灭菌20min，当温度到50C左右时（放入50C水浴锅）加入0.2%的V因子，使V因子浓度达100ug/ml，然后加入32ml的灭活新生牛血清100ml-4g TSA-5ml V因子-8ml血清3、TSB培养基称3gTSB于87 ml双蒸水中溶解。121C高压灭菌15min，冷却至50C左右，加入已配制的0.2%的V因子5ml，再加入灭活的新生小牛血清8ml，使血清浓度达0.8%100ml-3g TSB-5ml V因子-8ml血清四 、实验内容（1）菌株菌液制备及培养繁殖将副猪嗜血杆菌三株菌种按分别划线接种于TSA固体培养基平板上，37C恒温培养18-24h，挑取单个菌落接种于TSB液体培养基中，37C振荡培养12-16 h后，再将此菌液按l%的比例加入新配制的TSB液体培养基，37振荡培养12-16h后，按平板菌落计数法计数。培养24h后，收集菌液，用分光光度计法测定细菌总菌含量。经检验合格者作为制苗抗原。（2）制苗抗原的浓缩和细菌的灭活将纯检合格的制苗抗原培养物以超滤器浓缩，作为制苗用浓缩抗原。然后按TSB液体培养基总体积加入终浓度为0.2%的甲醛（先10倍稀释），充分摇匀后，37C温箱中灭活14h或分别在4、8、12、16、20h和24h取灭活菌液于TSA固体培养基划线培养，置普通恒温箱中37培养48h，观察细菌灭活效果。37C灭活14h可达到较好的效果。（3）制苗用水相的制备根据培养24h后的分光光度计法或麦氏比浊管测定的总菌数结果，参照培养12-16h的平板菌落计数法计数结果。取灭活的三种血清型按照一定的比例（等量）混合抗原液96份， 然后过滤, 除去沉渣及杂物, 加入4份即终浓度为4%灭菌的Tween-80(964) 充分混匀, 边加边搅拌，使其充分融化（可加热助溶，温度低于37）, 作为制苗用水相，水相要摇匀，让吐温-80充分溶解。（4）制苗用油相的制备取10号白油93份（先加一部分，后补足）置于不锈钢锅中缓慢加热后，加入硬脂酸铝1份，边加边搅拌，直到透明为止，再缓慢加入6份Span-80(司本-80)，充分混匀， 121高压蒸汽灭菌3Omin，冷却至室温备用。或者按比例将工业白油94份置于不锈钢锅（或瓷锅）中加热后，缓慢加入6份 Span-80，混合后按总量加入2%硬脂酸铝，溶化后，继续升温至160，维持10min，待冷却后即可制苗。切勿用少量的白油与硬脂酸铝混合后边煮边搅拌，那样很容易烧焦冒烟。（5）疫苗的制备（乳化工艺） 按油相与水相2：1（v/v）混合乳化。即1份水相配2份油相在高速搅拌器中搅拌。先将处理好的油相2份置于高速搅拌器中，低速搅动油相，同时缓慢加入水相l份(油水= 21)，乳化时胶体磨转速由慢变快，最后以8，000一10，OO0r/mln高速乳化2一5min，使水油充分乳化。乳剂混匀，分装于灭菌疫苗瓶中。在乳化过程中亦可根据乳剂黏稠度适当调整油、水相比。制成乳白色的W/O型油乳佐剂疫苗。（6）油乳剂检验：油乳剂检验项目包括乳剂类型检查、黏度测定、稳定性测定、粒度大小及分布检测等，生产实际中以黏度测定与稳定性测定为主。在每批苗分装过程的前、中、后各抽样2瓶供物理性状检验及安全检验。1 无菌检验： 将制备好的灭活油乳苗分别接种于普通肉汤培养基和血琼脂培养基中 , 于37 温箱中培养10 d, 观察有无细菌生长。均应无菌生长方合格。2 物理性状检验 : 观察疫苗颜色：眼观应为均匀一致的乳白色黏稠乳剂。3 稳定性检测 ：1）离心加速法，将疫苗置于 10m l 离心管内, 3 000 r/min离心15min水油不分层，可保存1年以上不破乳。2）加速老化法，疫苗于37储存10-30d不破乳，说明其稳定性良好。4 黏度检验：最简易的方法是在室温条件下用吸管吸取1ml乳剂, 然后垂直放出, 记录放出0. 4ml所需时间。垂直放出0.4ml所需要的时间作为黏度单位，以0.4ml 2-6s为合格，说明黏度适中, 适合于注射应用，不得多余10-15s。5剂型检测：将疫苗数滴滴于冷水表面, 观察油滴扩散情况，即观察疫苗滴于水中是否呈油滴状且不分散。滴于水中油滴呈规则的圆形, 未见扩散现象, 说明疫苗为油包水剂型。6安全检验：对最小使用日龄靶动物一次单剂量接种的安全性灭活疫苗接种途径只有一种，就是肌肉注射。每批三价灭活苗随机取样3瓶,等量混合后接种兔2只,每只肌肉注射2mL；接种14日龄哺乳仔猪，每组5头，每头猪接种2ml，另设5头猪作为阴性对照，于耳后肌肉注射5-10 mL, 观察仔猪的临床表现，并每日测定体温，持续2周。五、小结（1）副猪嗜血杆菌对营养要求比较苛刻，培养时必须供给含有V 因子（NAD）或（NADP)的新鲜血液才能生长。且具有非常多的血清型，纯化非常困难。故对菌的纯化及灭活和疫苗的安全性试验是生产灭活苗的关键环节。由于副猪嗜血杆菌，在菌液制备的过程中容易生长杂菌，我们纯化了很多次菌，液体仍然很浑浊，使得实验进展延后。（2）注意事项：1 细菌灭活过程中，甲醛浓度越高，碱性溶液中的抗