荧光定量pcr技术在临床检测中的应用.ppt

荧光定量PCR技术在临床检测中的应用 中山大学中山医学院生物化学教研室达安基因股份有限公司首席科学家朱振宇医学博士 教授 博士生导师Tel020 37656430 九十年代中期PCR临床应用在国内全面展开1998年荧光定量PCR技术开始在中国应用于临床检测 1983Cetus公司的KaryMullis于12月16日第一次成功实验发明了PCR1985关于PCR的文章首次由KaryMullis及其同事等人在 Science 上发表198912月 Science 杂志将PCR和它所使用的TaqDNA聚合酶命名为第一个 年度分子 1993KaryMullis NobelPrizeinChemistry 1995PerkinElmer公司研制出荧光定量PCR技术 循环次数DNA的链数121222243238102101024202201 048 576302301 073 741 82410亿 PCR循环次数与DNA产量关系 PCR循环 PCR特点 高效扩增 忠实复制 灵敏度高快捷简便对样品纯度要求低可以相对定量 PCR反应的特点 Ct值的意义 Ct值与重复性同一样本在相同条件下同时进行96次扩增 FQ PCR Ct值与浓度不同的模板达到荧光域值时的Ct值不同 感染性疾病的诊断母婴传播的控制与观察遗传疾病的诊断肿瘤的诊断法医学鉴定 荧光定量PCR的临床应用 早期诊断病情评估和预后判断抗病毒药物疗效的观察 指导新药验证 一感染性疾病1 病原体含量与病情之间的关系2 病原体含量与用药之间的关系3 药物及疗法的研究与开发4 新的病原体分子诊断标准5 新的愈后指标6 传染病发病的监控 预测与预防 临床应用 临床应用 二肿瘤1 肿瘤标志物 癌胚抗原 同功酶 抗体 激素 细胞因子 受体等2 肿瘤相关基因表达的检测 包括癌基因抗癌基因 肿瘤转移基因及转移抑制基因 三遗传病1 等位基因检测2 多基因遗传病的突变检测3 基因表达异常所致遗传病检测 荧光定量PCR在病原体检测中的应用 一肝炎病毒定量检测二性病病原体检测三结核杆菌及呼吸道病原体检测四优生优育 TORCH 相关项目检测 临床应用 肝炎病毒定量检测HBVHCV 临床应用 一 乙型肝炎病毒结构及特点 HBsAg 是HBV感染的主要标志HBsAb 保护性抗体HBcAg 仅存于感染的肝细胞核内 一般不存在于血循环中HBcAb 非保护性抗体 HBcAb IgM提示HBV处于复制状态HBeAg HBV复制及强感染性的指标HBeAb 有一定的保护作用 预后良好 HBV HBV 二 HBV DNA与 两对半 1 两对半 机体的免疫反应状态 2 携带者 大三阳 小三阳 等免疫学指标不能反应体内病毒复制水平与感染程度 FQ PCR 检测的是HBV本身的遗传物质 DNA 是病毒存在和复制的最可靠 最直接的指标 3 血清学指标 不能排除HBV感染 HBV 二 HBV DNA与 两对半 4 也可能出现HBsAg HBV DNA 5 HBsAb HBcAb HBeAb 三抗体阳性与HBVDNA2 5 103copy ml结果解释 HBV 三 HBV DNA定量检测的临床意义 3 HBV DNA定量与预后a 含量高者急性肝炎患者易慢性化b 癌变的几率明显高于含量低者 1 HBV DNA定量与HBV复制水平及传染性 2 HBV DNA定量与乙肝药物疗效a 专家提出 103copy ml做为阴性或临床治愈标准b HBV DNA定量分析与干扰素治疗 前 中 后 c 拉咪呋啶 HBV感染与干扰素治疗 治疗前 a 治疗前HBV低水平复制者对干扰素的反应性明显优于高水平复制者 b 治疗前HBVDNA含量特别高者大多没有疗效 c HBsAg转阴的几乎都是那些治疗前血清HBVDNA含量较低者 HBV感染与干扰素治疗 治疗中 a 病毒复制水平迅速降低者 有望治愈 b 相反 治疗期间HBVDNA复制水平下降较慢 或下降幅度较小 或者变化不明显者 大多是干扰素治疗无效 HBV感染与干扰素治疗 治疗后 a 治疗结束后 采用PCR定量法检测 HBVDNA 103copy ml者 可能不再复发 b 终止治疗后HBVDNA仍保持较低水平者 反跳的可能性较大 PoorResponsetoIFNTherapy CHRONICHEPATITISB 拉咪呋啶 有显著降低高病毒载量作用 近期疗效颇有优势 但是长期使用可导致HBV变异 患者易出现耐受性 而且容易出现停药后反弹 HBV感染与拉咪呋啶治疗 拉米夫定抑制血清HBVDNA HBV 三 HBV DNA定量检测的临床意义 4 HBV DNA定量有助于指导怀孕与孕期 哺乳期检查 6 血液制品和献血员的筛选 病毒特点 1 单正链RNA病毒2 E1和E2区基因高度变异性 一 丙型肝炎病毒特点 HCV 感染特点 HCV在血中含量极微输血后肝炎主要致病因子免疫学标志仅有抗 HCV 非中和抗体 产生时间不一有一部分人感染HCV后 不产生抗 HCV感染易于慢性化 50 85 疫苗研制尚不成功 单链RNA 二 HCV RNA定量检测的临床意义 1 早期诊断a 临床以 80copy ml做为无感染或治愈标准 b HCV感染1 3W 即可检出HCV RNA的存在 c 严格筛选献血员 提高对窗口期感染者的检出率 d 医疗纠纷中的 举证倒置 病人入院前后进行HCV RNA检测 HCV HCV 二 HCV RNA定量检测的临床意义 2 HCV RNA载量与抗 HCV滴度 ALT水平之间的相关性 抗 HCV滴度和ALT异常率随着HCV RNA载量升高而增加 3 HCV RNA是评价抗病毒治疗效果的重要指标 4 慢性丙型肝炎长期抗 HCV阳性 这时如果进行HCV RNA定量检测可以鉴别活动性 复制程度 二常见性传播疾病病原体 一淋球菌 NGH 二沙眼衣原体 CT 三解脲脲原体 UU 四梅毒螺旋体 TP 五单纯庖疹病毒 HSV 六乳头瘤病毒 HPV 七人类免疫缺陷病毒 HIV 八EV71A16通用型 STD 艾滋病 艾滋病是英文AIDS AcquiredImmunityDeficiencySyndrome 的中文译音 全称是 获得性免疫缺陷综合征 它可以由人类免疫缺陷病毒 HIV Human beingImmunityDeficiencyVirus 又称艾滋病病毒引起的疾病 当病毒侵入人体后 经一段时间的潜伏期 破坏人体的免疫力 从而发病 病死率高 是一种严重的传染病 艾滋病是一种有明确病原体的可通过人之间一定传播途径传播的慢性传染病 属于 传染病防治法 中规定的乙类传染病 HIV病毒 多亚型和多变异 HIV 1和HIV 2M组 O组和N组亚性型 A KCRF 基因重组亚型 主要是HIV 1型毒株亚型监测的意义不同亚型与不同传播途径的关系 B主要通过男性同性性行为和静脉注射吸毒传播 C主要异性性接触传播流行地理和传播线路的分析 东南亚区域的C亚型和B亚型重组亚型传播效力变化及对流行的影响 东欧的B A重组流行 泰国的A E重组 艾滋病病毒在外界的抵抗力 HIV病毒一旦离开宿主细胞在外界环境中生存能力很快消失HIV对环境中的物理因素和化学因素抵抗力均较弱 比乙型肝炎病毒 HBV 的抵抗力低得多对HBV有效得消毒和灭活方法均适用于HIV 典型进展者 8 10年潜伏期后成为艾滋病人 80 90 快速进展者 CD4细胞2 5年内迅速下降 HIV病毒载量一直维持较高水平 而且分离的HIV有均一性 长期存活者 又称长期不进展者 维持15年以上 而且CD4计数维持正常 在所有感染者中比例一般在8 10 HIV感染的三种结局 艾滋病的诊断 HIV感染者 确定HIV感染的个体抗体检测 初筛和确认辅助诊断艾滋病病人 临床诊断标准见国家标准 HIV AIDS的诊断标准和防治原则 GB16000 1995 荧光定量PCR的应用为艾滋病的初筛和辅助检查提供了有力的工具 NGH 淋球菌感染与致病 1 人是淋球菌的惟一宿主 2 发病率最高 在所STD疾病中 高达60 左右 3 发病趋势 a 男性多于女性 b 城市走向农村 c 高收入阶层向低收入阶层扩展 4 人对淋球菌感染无天然抵抗力 免疫不持久 再感染和慢性患者普遍存在 5 如母亲为淋病患者 婴儿出生时易患上淋球菌性结膜炎 CT 沙眼衣原体感染与致病 1 严格的细胞内寄生 2 不仅可致眼部感染 肺部感染 也是STD的主要病原体 3 近年来在欧美等国 沙眼衣原体的感染率和危害性已超过淋球菌而居STD之首 4 在我国 在非淋球菌性尿道炎中 居首位 5 泌尿生殖道感染 妨碍妊娠 6 盆腔感染 可致生殖能力损害 UU 解脲脲原体感染与致病 合成尿素酶 分解尿素 2 在非淋球菌性尿道炎其感染率仅次于衣原体感染 居第二位 3 流产超过4次以上者 检出率高达80 4 有30 40 男性尿道炎是由感染UU所致 5 与男性不育相关 男性不育患者精液中 脲原体检出率高达66 6 检出率随精子数减少和精子活动力下降而升高 1 非培养或形态学检查的诊断技术 快速 特异 敏感 2 对无症状或症状轻者 可以早期确诊 3 对NGH CT UU等混合感染者 诊断和鉴别诊断 4 指导用药 考核疗效 荧光定量PCR诊断NGH CT UU的意义 NGH CT UU NGH CT UU 荧光定量PCR诊断NGH CT UU的意义 5 不孕不育 优生优育 6 流行病学调查 为性传播疾病的监控提供依据 7 CT UU是FDA批准的PCR检测试剂盒 可作为首选方法 在临床推广应用 人乳头瘤病毒感染与致病 1 HPV具有宿主和组织特异性 只能感染人的皮肤和黏膜上皮细胞 人是HPV的惟一宿主 2 有100多个型 3 低危型 HPV6 11引起良性病变 尖锐湿疣 喉乳头瘤等 HPV 人乳头瘤病毒感染与致病 HPV 4 高危型 HPV16 18引起恶性肿瘤 宫颈癌 肛门癌 口腔癌等 5 免疫原性低 易形成持续性感染 6 新生儿产道感染 HPV 1 对典型病例可以明确诊断 2 对临床表现和组织病理改变都不典型的病例同样可以做出诊断 3 对亚临床和隐性HPV感染做出诊断 4 基因分型 5 考核疗效与预后 6 病毒载量与患癌症风险 HPV 荧光定量PCR检测HPV的意义 HPV 手足口病 hand foot mouthdisease HFMD 为全球性传染病 世界大部分地区均有流行的报道 1957年在加拿大首次报告 新西兰Seddon于1957年最早加以描述 1958年加拿大Robinson从患者粪便和咽拭中分离出CoxA16 同时患者血清抗体有四倍增长 初步查明CoxA16为本病病原 1959年提出HFMD命名 HFMD在全球广泛流行 无明显的地域分布 之后世界各地均经常发生由各型柯萨奇 埃可病毒和EV71引起的手足口病流行 发热 不适 咽喉肿痛 口腔 手 脚侧面及掌心 屁股出现小泡传染性极高病程约1周 HFMD的病原 手足口病可由多种肠道病毒所引起 其中包括CoxA5 A10 A16 A19 EV71 以及部分埃可病毒和柯萨奇B组病毒 以CoxA16和EV71最为常见传播途径 粪 口途径传播 唾液与粪便 呼吸道传播 空气飞沫 接触传播疱疹液中含大量病毒 疱疹破溃后病毒排出 HFMD为全球性传染病 在全球广泛分布 无明显的地域分布 但近年EV71在东南亚一带流行 引起较多的重症和死亡病例 在80年代和90年代 中国手足口病的流行主要以CoxA16为主 2008年 CoxA16和EV71共循环引起手足口病爆发 EV71在大部分省市为优势病毒 人肠道病毒感染的一般致病机制 致病特点 隐性感染多见 很少引起腹泻 婴幼儿 免疫力低下的成人易感 病毒在机体肠道中增殖 很少引起肠道症状 是以消化道为原发灶的全身感染 不同人肠道病毒可引起相同症状 同一种人肠道病毒可引起不同临床表现 感染过程中形成病毒血症 中国HFMD的流行 1981年 我国在上海首次报道了HFMD病例1987年在中国分离到CVA161995年以来 我国陆续在武汉 深圳 上海 重庆 山东和安徽等地的HFMD患者中分离到EV71病毒 2007年 山东发生了手足口病爆发流行 累计报告HFMD病例39 606例 其中14例病例死亡 实验室检测发现EV71是引起山东临沂HFMD的主要病原 同时还检测到Echo3和 或CVA16 2008年全国出现HFMD爆发流行 以HEV71为优势 CVA16还有其它EV共循环引起 加强HFMD病原检测和监测的十分必要 依据台湾1998 2008和中国大陆2007 2008年的经验掌握手足口病病原谱 特别是EV71感染所占的比例 对析判断HFMD疫情导致重症和死亡的比例有重要的科学参考价值 手足口病的实验室检测 手足口病的诊断一般是通过采集适当的临床标本后进行基因检测 抗原检测 血清学抗体检测 病毒分离和病毒鉴定 如果没有采到合格的临床标本 或无法进行实验室检测 很多血清型的肠道病毒能引起手足口病 不同细胞系对不同病毒的敏感性是有所不同的 而不同时期肠道病毒的流行株也不同 通常用于肠道病毒分离的细胞系为RD HEp 2 Vero等 联合使用上述的两种或更多细胞有助于分离到更多的肠道病毒 病毒实验室检测类型 病毒实验室诊断方法 检测抗体 抗原 检测病毒 检测核酸 ELISA HI PA 蛋白印迹 病毒分离 ELISA 电镜 中和试验 RT PCR 实时荧光定量PCR 套式PCR LAMP 免疫荧光 基因芯片 每种方法各有优势 依据病毒来定检测策略 Newmoleculartoolsforepidemiologystudiesanddiagnosis 三结核杆菌与呼吸道病原体检测 TB TuberclebacilliCP ChlamydiapneumoniaMP MycoplasmalpneumoniaSARS severeacuterespiratorysyndromeH1N1甲型流感呼吸道合胞病毒 结核杆菌流行现状 1 罗伯特 科赫 德国细菌学家 结核杆菌发现者结核病是一个全球性的问题 近年来在世界范围内出现流行 且呈增长的趋势 TB 结核杆菌流行现状 2 我国结核病的疫情仅次于印度而居世界第二位2000年 全国人口结核感染率为44 5 其中15 44岁人群占了53 每年约有25万人死于结核病 结核杆菌引起的感染 肺部感染 原发性肺结核 开放性肺结核 肺外感染 脑 肾 骨 关节 生殖结核 肠结核 结核性腹膜炎 全身性结核 常规结核病实验室诊断方法及不足 1 痰涂片作抗酸染色 阳性率低 费时2 细胞培养 金标准 周期太长 3 4W 3 血清学诊断 a 接种BCG可出现阳性b 不能区分活动性结核病和治愈后留下损伤灶的病人c 交叉反应 假阳性不能早期诊断 容易漏诊 误诊 TB 荧光定量PCR检测TB DNA的意义 1 能稳定检测10copy的TB DNA 灵敏度高 特异性强2 早期 快速 准确地诊断结核病 痰液 肺及支气管灌洗液 肺结核血液 播散性结核和各脏器的结核病脑脊液 中枢神经系统结核病宫颈拭子 尿道拭子 泌尿生殖道结核病 TB 3 荧光定量PCR检出结核杆菌阳性率显著高于痰涂片抗酸染色和改良罗氏培养法 4 TB DNA浓度可用于判断疗效 痰标本中结核杆菌的数量呈逐渐下降趋势 TB DNA拷贝数下降 根据病原体DNA浓度 对药物治疗及疗效观察提供参考依据 TB 荧光定量PCR检测TB DNA的意义 CP MP感染可致咽炎 支气管炎和肺炎 潜伏期约2 3周 通常起病较缓慢 持续性咳嗽 肺炎衣原体 CP 肺炎支原体 MP 感染与致病 CP MP MP肺炎约占非细菌性肺炎的1 3以上 或各种原因引起的肺炎的l0 MP感染与小儿支气管哮喘密切相关 CP感染与冠心病存在密切的关系 肺癌 支气管扩张患者中CP感染率相对较高 荧光定量PCR用于非典型性肺炎的诊断 意义 1 直接检测病原体 早期 快速 特异诊断非典型性肺炎 2 治疗方案与细菌 病毒感染的治疗方案不同3 流行病学调查 TB MP CP已被许多医院尤其是妇幼保健医院和儿童医院纳为肺部感染的常规检测项目 MP CP SARS 甲型H1N1流感 流行性感冒简称流感 是由甲 乙 丙三种流感病毒引起的急性呼吸道传染病 甲型流感病毒根据其表面 H和N 结构及其基因特性的不同又可分成许多亚型 至今甲型流感病毒已发现的血凝素有16个亚型 H1 H16 神经氨酸酶9个亚型 N1 N9 猪流感 更名为 甲型H1N1流感 世界卫生组织4月30日宣布 从当日起 该组织不再使用 猪流感 一词指代当前疫情 而开始使用 A H1N1 型流感 一词 与之相对应 我国的官方文件从5月1日起相继用 甲型H1N1流感 代替原来的 人感染猪流感 世界卫生组织发言人说 之所以更改叫法 是因为 猪流感 一词容易误导消费者 美国和墨西哥等国的猪肉及猪肉制品已明显受到其他国家进口禁令影响 世界卫生组织的声明说 根据目前掌握的科学依据 此次流行的病毒仅在人际间传播 尚无证据表明它在猪群内传播 或由猪向人传播 也无证据表明人因食用猪肉或相关产品染病 病原学 甲型H1N1流感病毒属于正粘病毒科 典型病毒颗粒呈球状 直径为80nm 120nm 有囊膜 囊膜上有许多放射状排列的突起糖蛋白 分别是血凝素HA 神经氨酸酶NA和M2蛋白 病毒颗粒内为核衣壳 呈螺旋状对称 直径为10nm 甲型H1N1流感病毒为单股负链RNA病毒 基因组约为13 6kb 由大小不等的8个独立片段组成 流行病学特点 传染源主要为病猪和携带病毒的猪 感染猪流感病毒的人也被证实可以传播病毒 感染这种病毒的动物均可传播 传播途径主要为呼吸道传播 也可通过接触感染的猪或其粪便 周围污染的环境或气溶胶等途径传播 某些毒株如H1N1可在人与人之间传播 其传染途径与流感类似 通常是通过感染者咳嗽或打喷嚏等 易感人群普遍易感 患者多数年龄在25岁至45岁之间 目前报道以青壮年为主 应注意老人和儿童 临床表现 潜伏期一般1至7天左右 较流感 禽流感潜伏期长 人感染甲型H1N1流感后的早期症状与普通人流感相似 包括发热 咳嗽 喉痛 身体疼痛 头痛 发冷和疲劳等 有些还会出现腹泻或呕吐 肌肉痛或疲倦 眼睛发红等 部分患者病情可迅速进展 来势凶猛 突然高热 体温超过39 甚至继发严重肺炎 急性呼吸窘迫综合征 肺出血 胸腔积液 全血细胞减少 肾功能衰竭 败血症 休克及Reye综合征 呼吸衰竭及多器官损伤 导致死亡 实验室检查 外周血象 白细胞总数一般不高或降低 重症患者多有白细胞总数及淋巴细胞减少 并有血小板降低 血清学诊断 可使用间接ELISA 抗原捕捉ELISA 荧光免疫法等 反转录 聚合酶链式反应 RT PCR 由于PCR技术具有简便 快速 灵敏 特异性强等特点 已用于猪流感病毒基因的检测和分子流行病学调查等 4病毒分离 从患者呼吸道标本中 咽拭子 口腔含漱液 鼻咽或气管吸出物 痰或肺组织 分离甲型H1N1流感病毒 常用的方法有鸡胚接种法和细胞培养法 现有的诊断方法中 病毒分离法是较敏感的 但需要2 3周时间 人感染猪流感的诊断标准 医学观察病例 曾到过甲型H1N1流感疫区 或与病猪及甲型H1N1流感患者有密切接触史 1周内出现流感临床表现者 列为医学观察病例者 对其进行7天医学观察 根据病情可以居家或医院隔离 2疑似病例 曾到过疫区 或与病猪及甲型H1N1流感患者有密切接触史 也可流行病学史不详 1周内出现流感临床表现 呼吸道分泌物 咽试子 痰液 血清H亚型病毒抗体阳性或核酸检测阳性 临床诊断病例 被诊断为疑似病例 且与其有共同暴露史的人被诊断为确诊病例者 确诊病例 从呼吸道标本或血清中分离到特定病毒 RT PCR对上述标本检测 有甲型H1N1病毒RNA存在 经过测序证实 或两次血清抗体滴度4倍升高 可确诊为人感染甲型H1N1流感 四TORCH感染特点与检测 TOX ToxoplasmagondiiRV RubellavirusCMV HumancytomegalovirusHSV Herpessimplexvirus TORCH TORCH感染特点 1 母 胎传播的主要病原体2 引起胎儿畸形新生儿缺陷的重要原因3 自然状态下呈隐性感染4 怀孕 多次输血 AIDS等易发生显性感染5 可致多发性 全身性感染6 只有风疹可获得长久的免疫力 可用疫苗预防 TORCH 一 弓形虫感染与致病 滋养体如弓形 广泛分布 人兽共患 寄生在有核细胞中 猫和猫科动物是终宿主易感者多 免疫者少我国智力低下儿的弓形虫感染率28 畸形儿的弓形虫抗体IgM阳性率12 25 艾滋病患者约有20 80 合并弓形虫感染 造成艾滋病死亡的一个重要并发病 TORCH TOX 人群自然感染率达到60 90 多为隐性感染免疫功能低下 怀孕 多次输血 器官移植 AIDS 发生显性感染可发生垂直传播 是宫内感染和胎儿畸形的主要病毒之一围生期感染血 尿 乳汁 精液 分泌物中都可检出病毒 二 人巨细胞病毒感染与致病 TORCH CMV 风疹是一种世界性的病毒传染病 是造成畸胎及先天性疾病的病毒之一出疹前1周至出疹后5天均有传染性人是风疹病毒的唯一宿主风疹感染后可获得持久的免疫力 临床显性再感染并不多见 三 人风疹病毒感染与致病 TORCH RV 先天性风疹感染往往发生在母体初次感染之时 可致先天性风疹综合症 CRS 三联症 白内障 耳聋 心脏病 妊娠时体内皮质类固醇激素的增加以及细胞免疫功能的减弱 这种对正常人无害的再感染有可能造成病毒蔓延以至影响胎儿 TORCH RV 三 人风疹病毒感染与致病 HSV原发感染多为隐性 大多无临床症状或呈亚临床表现HSV 1主要引起口唇疱疹 疱疹性结膜炎 脑炎 皮肤性疱疹HSV 2主要引起原发性生殖器疱疹 80 HSV感染后大多数个体不能彻底消灭病毒 也不能阻止复发 病毒以潜伏状态长期存在宿主体内 TORCH HSV 四 人单纯疱疹病毒感染与致病 妊娠期妇女因HSV 1被激活 可通过胎盘感染胎儿 引起胎儿畸形 智力低下 流产等 围产期感染可引发新生儿疱疹 死亡率