三角褐指藻户外高密度培养技术研究毕业论文.doc

本科毕业设计（论文）题目：三角褐指藻户外高密度培养技术研究 学 院 轻工与食品学院 专 业 食品科学与工程（糖工程）学生姓名 魏 峰 学生学号 200930401131 指导教师 魏 东 教授 提交日期 2013年 06月 03日 摘 要三角褐指藻（Phaeodactytuum tricornutunm）是一种常用的海水经济硅藻，生长迅速，易于培养，富含丰富的多不饱和脂肪酸，特别是二十碳五烯酸（C20:5，EPA），是水产动物养殖的优质饵料。目前，三角褐指藻的户外高密度培养技术仍处于研发阶段。为探究不同条件（环境条件和营养盐）对三角褐指藻生长以及其脂肪酸组成和含量的影响，本研究用单一变量法分别对其培养条件进行对比优化实验。主要结果如下：矚慫润厲钐瘗睞枥庑赖。（1）选用不同盐度的培养基对三角褐指藻进行户外高密度培养，盐度设定为3个梯度，20、25、30。结果表明，在盐度为20条件下，三角褐指藻的生长状况要优于其他两种盐度，其OD值最高为0.998、细胞密度最高为6.0106个/mL、细胞干重最高为177.78mg/L。对脂肪酸的测定结果表明，25盐度下三角褐指藻细胞的脂肪酸含量最高（124.95mg/g），20盐度与25盐度基本相同（123.12mg/g），而30盐度最低（105.67mg/g）。聞創沟燴鐺險爱氇谴净。（2）在20盐度下，通入CO2控制培养基的不同pH值，对三角褐指藻进行户外高密度培养。pH值设定为3个梯度，7.5、8.0、8.5。结果表明，控制pH8.0，三角褐指藻的生长状况要远好于其他两种pH值，其OD值最高为1.045、细胞密度最高为5.8106个/mL、细胞干重最高为166.39mg/L。对脂肪酸的测定结果表明，pH值为8.5时三角褐指藻细胞的脂肪酸含量最高（145.91mg/g），pH值为8.0的稍低（134.92mg/g），pH值7.5的脂肪酸含量最低（109.76mg/g）。残骛楼諍锩瀨濟溆塹籟。（3）在20盐度、pH 8.0条件下，分别选用碳酸氢铵和尿素作为氮源对三角褐指藻进行户外高密度培养。结果表明，分别使用碳铵和尿素，三角褐指藻的生长状况基本相同，其最终OD值分别为0.689和0.716，细胞密度分别为3.9106个/mL和4.0106个/mL，细胞干重分别为136.11mg/L和146.11mg/L。但通过对脂肪酸的测定，结果表明当使用碳铵作为氮源时三角褐指藻细胞的脂肪酸含量最高（169.72mg/g），尿素作为氮源时脂肪酸含量则相对较低（109.76mg/g）。酽锕极額閉镇桧猪訣锥。（4）在20盐度，pH8.0，碳铵作为氮源的条件下，当培养基中氮耗尽时，通过一个昼夜24小时对三角褐指藻的取样研究，结果表明，在上午10点钟时，三角褐指藻中所积累的脂肪酸含量最高（136.15mg/g），而在其他时间段，脂肪酸的含量则相对较低。彈贸摄尔霁毙攬砖卤庑。（5）在20盐度，pH8.0，碳铵作为氮源的条件下，通过对三角褐指藻的一个生长周期内的氮磷同化规律研究表明，三角褐指藻户外高密度生长过程中，对氮的需求需求量很大，平均每天要消耗10.4mg/L的碳酸氢铵。而对磷的需求则相对较小，每天平均只消耗0.13mg/L的磷酸二氢钠。謀荞抟箧飆鐸怼类蒋薔。关键词：三角褐指藻；盐度；pH值；氮源；脂肪酸 AbstractPhaeodactytuum tricornutunm is a commonly used seawater economic diatoms, rapid growth, easy to culture, rich in polyunsaturated fatty acids, especially eicosapentaenoic acid (C20: 5, EPA), is Aquatic animal breeding quality bait. Currently, Phaeodactylum outdoor high-density culture technology is still in development stage. To explore the different conditions (environmental conditions and nutrients) on the growth of Phaeodactylum and their fatty acid composition and content of, a single variable method used in this study were to compare their culture conditions optimization experiments. The main results are as follows:厦礴恳蹒骈時盡继價骚。(1) selection of different salinity media on Phaeodactylum outdoor high-density culture, salinity gradient is set to 3, 20 , 25 , 30 . The results showed that under the conditions of salinity of 20 , Phaeodactylum growth conditions better than the other two salinity, its highest OD value of 0.998, the highest cell density 6.0 106 个 / mL, the highest cell dry weight was 177.78mg / L. The results show that for the determination of fatty acids, 25 salinity Phaeodactylum cell fatty acid content of the highest (124.95mg / g), 20 and 25 salinity salinity is basically the same (123.12mg / g), and 30 salt lowest (105.67mg / g).茕桢广鳓鯡选块网羈泪。(2) at 20 salinity, leads to CO2 control medium at different pH values of Phaeodactylum outdoor high-density culture. pH gradient value is set to 3, 7.5,8.0,8.5. The results show that the control pH8.0, Phaeodactylum growth conditions far better than the other two pH values, the OD values of up to 1.045, the highest cell density of 5.8 106 个 / mL, cell dry weight up to 166.39mg / L. The measurement results show that the fatty acid, pH value of 8.5 Phaeodactylum highest fatty acid content of the cell (145.91mg / g), pH 8.0 is lower (134.92mg / g), pH of the fatty acid content of 7.5 minimum ( 109.76mg / g).鹅娅尽損鹌惨歷茏鴛賴。(3) at 20 salinity, pH 8.0 conditions, were selected ammonium bicarbonate and urea as a nitrogen source for Phaeodactylum outdoor high-density culture. The results show that the use of ammonium bicarbonate and urea, respectively, Phaeodactylum basically the same growth conditions, the final OD values were 0.689 and 0.716, the cell density was 3.9 106 cells / mL and 4.0 106 个 / mL, cell dry weight were 136.11mg / L and 146.11mg / L. But through the fatty acids measured, the results show that when using ammonium bicarbonate as a nitrogen source Phaeodactylum cell fatty acid content of the highest (169.72mg / g), urea as a nitrogen source when the fatty acid content is relatively low (109.76mg / g) .籟丛妈羥为贍偾蛏练淨。(4) at 20 salinity, pH8.0, ammonium bicarbonate as a nitrogen source conditions, when the medium is depleted of nitrogen, 24 hours a day through a pair Phaeodactylum sampling, the results showed that in the morning 10 oclock, Phaeodactylum fatty acid content 預頌圣鉉儐歲龈讶骅籴。of the accumulated maximum (136.15mg / g), while in other time periods, fatty acid content is relatively low.渗釤呛俨匀谔鱉调硯錦。(5) in 20 salinity, pH8.0, under conditions of ammonium bicarbonate as a nitrogen source, through Phaeodactylum during the growth cycle of a law of assimilation of nitrogen and phosphorus that Phaeodactylum outdoor high-density growth in great demand for nitrogen demand, the average daily consumption of 10.4mg / L of ammonium bicarbonate. The demand for phosphorus is relatively small, the average daily consumption of only 0.13mg / L sodium dihydrogen phosphate.铙誅卧泻噦圣骋贶頂廡。Keyword: Phaeodactytuum tricornutunm; Salinity; pH; Nitrogen; Fatty acid擁締凤袜备訊顎轮烂蔷。目录摘 要I贓熱俣阃歲匱阊邺镓騷。AbstractII坛摶乡囂忏蒌鍥铃氈淚。第一章 绪 论11.1国内外微藻及其脂肪酸研究进展1蜡變黲癟報伥铉锚鈰赘。1.2硅藻及三角褐指藻概述21.3硅藻及三角褐指藻培养技术31.4影响硅藻脂肪酸组成和含量的环境因子4買鲷鴯譖昙膚遙闫撷凄。1.5本课题的研背景和意义51.6本课题的研究内容5第二章 实验材料与测试方法72.1实验材料与仪器72.2试验方法72.2.1实验室阶段培养82.2.2户外培养及采收82.3分析与测试92.3.1细胞密度、OD值和细胞干重9綾镝鯛駕櫬鹕踪韦辚糴。2.3.2培养基中氮、磷含量的测定10驅踬髏彦浃绥譎饴憂锦。2.3.3脂肪酸组成与含量的测定11猫虿驢绘燈鮒诛髅貺庑。第三章 不同条件对三角褐指藻生长及脂肪酸积累情况探究13锹籁饗迳琐筆襖鸥娅薔。3.1盐度133.1.1实验方法133.1.2结果分析133.2 pH值163.2.1实验方法163.2.2结果分析163.3氮源种类183.3.1实验方法183.3.2结果分析19第四章 昼夜变化对三角褐指藻脂肪酸组成和含量的影响21構氽頑黉碩饨荠龈话骛。4.1实验方法214.2结果分析21第五章户外培养过程中细胞对氮、磷的同化规律研究23輒峄陽檉簖疖網儂號泶。5.1实验方法235.2结果分析23第五章 结果与展望24参考文献25致 谢27第一章 绪 论1.1国内外微藻及其脂肪酸研究进展微藻是一类体积小、结构简单、生长繁殖迅速的单细胞藻类。微藻在海洋生物生态系统中起着重要的作用，他们是构成海洋初级生产力的重要组成部分，是许多海洋动物的优质饵料【1】。目前在地球上存活的微藻超过20万种，微藻每年固定的CO2大约占全球净光和产量的40%，在能源转化和碳元素循环中起着举足轻重的作用【2】。微藻种类繁多，生物量巨大，富含着丰富的、结构独特的生物活性物质，如抗生素、类胡萝卜素、虾青素、藻红蛋白、不饱和脂肪酸等在医药和保健品的开发应用方面具有巨大的潜力【3】。尧侧閆繭絳闕绚勵蜆贅。微藻脂肪酸组成的研究多集中在多不饱和脂肪酸（PUFAs）。微藻含有大量的多不饱和脂肪酸，PUFAs由于在营养、保健和医学上的重要作用，引起了人们广泛的兴趣，特别是二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA），对维护生物膜的结构和功能，防治心血管疾病、动脉硬化、癌症、风湿关节炎等人类疾病，提高人类的记忆功能都？有明显的效果【4】。目前海洋鱼油是EPA和DHA等多不饱和脂肪酸的主要来源，但从鱼油中提取PUFAs会有以下缺点：鱼油中提取的PUFAs普遍胆固醇含量较高，并带有腥味，极大地影响了产品的品质；鱼油中PUFAs的组成和含量会随着鱼的种类、季节、地理环境等条件的变化而改变；鱼油的加工工艺会降低鱼油中PUFAs的产量，导致产品价格昂贵。识饒鎂錕缢灩筧嚌俨淒。其实鱼类并不是PUFAs的真正生产者，它是通过吞食富含PUFAs的藻类后实现体内PUFAs的积累，因此微藻才是PUFAs真正的生产者【5】。早在20世纪50年代，国外就对利用微藻生产多不饱和脂肪酸进行了研究，迄今为止，已测定包括硅藻、红藻、金藻、褐藻、绿藻、甲藻、隐藻、蓝藻和黄藻等在内的上百种脂肪酸含量【6】。目前已经发现小新月菱形藻（Nitzschia closterium）、假微型海链藻（Thalssionema psendonana）、三角褐指藻（Phaeodactylum tricormutum）、小球藻（Chlorlla minutissima）等藻富含EPA。凍鈹鋨劳臘锴痫婦胫籴。利用海洋微藻生产PUFAs的研究起始于20世纪80年代初期，并且多以自养微藻生产EPA和DHA为主，其中三角褐指藻、盐生微小绿藻、紫球藻、球等鞭金藻等被认为最有可能实现微藻生产PUFAs产业化。微藻产业化培养主要有开放大池培养和密闭式光生物反应器培养两种方式。目前国内外研究人员对利用微藻异养培养生产PUFAs进行了大量研究。Swaaf等研究了柯氏隐甲藻（Crypthecodiniumcohii）异养培养生产DHA，得到了11.7g/L的高产率【7】。微藻异养生产PUFAs具有相当好的商业应用开发前景，国际上已有Markek和Omega Tech等公司利用微藻异养培养生产PUFAs。我国微藻养殖方面发展较快，大都是采用开放式或半开放式的培养一些可以作为生物饵料或是食品添加剂的藻类，但是关于微藻工业化生产PUFAs研究得不多。恥諤銪灭萦欢煬鞏鹜錦。1.2硅藻及三角褐指藻概述硅藻是一类单细胞真核生物，硅藻与其他大多数海洋微藻不同的是它们具有一层高度硅质化的细胞壁，从而形成一个坚硬的壳体，壳体由上、下两个半壳组合而成。硅藻的光合作用色素主要包含叶绿素a、叶绿素c和胡萝卜素、岩藻黄素、硅藻甲黄素等，因此，硅藻的色素体会呈黄绿色或黄褐色【8】。硅藻大多以单细胞形式存在，也有两个或多个细胞个体连结而成的其他形式的群体。硅藻的形态多种多样，生长速度快，通常以一分为二的繁殖方法产生。硅藻是一类重要的海洋浮游生物，其生长分布极其广泛，在地球上的各大海洋中，几乎都有硅藻的踪迹，特别是在热带、亚热带以及温带的大部分海区。硅藻的种类繁多，数量庞大，素有海洋的“草原”的美誉。鯊腎鑰诎褳鉀沩懼統庫。硅藻富含丰富的营养物质，易于消化，特别是脂肪酸含量非常高，硅藻是浮游动物、小鱼、小虾和贝类的优质饵料。所以，硅藻等浮游类生物的数量多少对水产养殖业起着至关重要的影响。另外，根据许多数据显示，微藻等海洋浮游生物每年大约可以产生氧气360亿吨，这个数值大约占到了地球上大气氧含量的70%，硅藻又是这些浮游生物中最庞大的群体，可以占到海洋初级生产力的40%左右，所以，硅藻的作用可想而知。硕癘鄴颃诌攆檸攜驤蔹。三角褐指藻（Phaeodactytuum tricornutunm）在分类学上属于硅藻门、羽纹纲、褐指藻目、褐指藻属【9】。三角褐指藻的主要存在形式有三种类型，分别为卵形、梭形和三出放射形，在不同的环境条件下，这三种不同的细胞形态可以互相转变。在正常的人工培养基条件下培养，三角褐指藻大多是三出放射形细胞和少量的梭形细胞。三出放射形细胞的长度大约为10-18微米（两臂之间的垂直距离），细胞中心部分有一个细胞核，有1-3片黄褐色的色素。梭形细胞一般长约20微米，两臂末端较钝。卵形细胞长约8微米，宽约3微米，有一个硅质壳面，而缺少另一个壳面，也没有壳环带。三角褐指藻的繁殖通常也是一分为二的方式【10】。阌擻輳嬪諫迁择楨秘騖。三角褐指藻是一种典型的硅藻，同时更是一种非常具有经济价值的海洋经济类硅藻。三角褐指藻富含丰富的多不饱和脂肪酸，特别是二十碳五烯酸（EPA），是许多鱼、虾和贝类幼体的优质饵料，尤其是EPA，是这些水产动物所必须的营养物质【12】。氬嚕躑竄贸恳彈瀘颔澩。三角褐指藻易于生长，其对环境的适应范围较广，在9-92的盐度范围内都能正常生存，其最适盐度为20-24。适温范围为5-30，最适温度为18-24，即使是在0的条件下仍会有少量三角褐指藻繁殖，但如果超过了35细胞就会停止生长，最终全部死亡。三角褐指藻适应的光照强度范围为1000-80000勒克斯，其最适的光照范围为10000-30000勒克斯，但是如果在小型规模下培养三角褐指藻，切忌使用人工光源直接照射【11】。釷鹆資贏車贖孙滅獅赘。1.3硅藻及三角褐指藻培养技术目前国内外硅藻各种规模的培养方式如表1-1所示。表1-1各种硅藻培养技术的优点和缺点【12】培养类型 示例 优点 缺点室内 密封条件下用人工配制 可人为控制光照， 成本高培养基培养 温度，营养元素； 避免污染、天敌 和其它竞争藻类户外 用高级农业肥料在户外 成本低 难以控制其生长池塘中培养 环境封闭系统 封闭的培养瓶中培养 可避免污染 成本高开放系统 池塘、水池和跑道池 成本低 容易被污染无菌系统 消毒玻璃培养皿 存活率高，不易污染 成本高，难以长期维持无菌系统非无菌系统 成本低 容易被污染连续培养 仅限于小规模的室内 高效，可连续生产 操作困难，复杂培养 高品质硅藻细胞 设备费用高半连续培养 室内或室外培养系统 简单，效率稍高 产品质量不统一 批量培养 由试管到池塘培养 简单、可靠、灵活 效益低，质量不统一，在初始接种和早期生长期间有污染风险，收获、清洁、消毒和接种容器比较麻烦硅藻的户外大规模培养主要有四大类型：大型水池培养、大型水箱培养、带有旋转混合器的圆形培养池培养和跑道池培养。目前硅藻，特别是三角褐指藻高密度户外培养技术仍处于初级开发阶段，国内乃至世界上都还没有一套较为成熟的培养体系，也很难找到较大规模的硅藻海洋饵料生产实例。所以，要想实现其大规模高密度户外培养，就必须在实际生产过程中对各种培养条件不断地进行优化改进。目前硅藻户外高密度培养存在的主要问题就是自然环境中光照与温度的难以控制性，以及各种污染带来的影响。因此，本研究将对三角褐指藻的户外高密度培养条件进行系统的优化，以确定最适宜的培养条件，从而大规模的生产出高质量的三角褐指藻海洋饵料。怂阐譜鯪迳導嘯畫長凉。户外硅藻大规模的培养产品目前主要是应用于水产养殖行业，作为鱼、虾和贝类幼体的饵料。硅藻是饲养海洋双壳类软体动物（蛤、牡蛎、扇贝等）的重要饵料，其富含丰富的脂肪酸，特别是EPA，是这些水产动物的必须营养物质。硅藻海洋饵料多种多样，其中最为优质的饵料包括角毛藻、海链藻和三角褐指藻等。根据目前的数据统计表明，在双壳贝类的饲养饵料中海洋微藻类饵料的数量已经超过了90%，其中大多数水产养殖者都选用以上3种硅藻作为首选饵料【12】。同时许多研究也表明在鱼、虾以及贝类的饲养过程中，如果采用多种饵料混合的养殖方法，通常情况下，饵料中的硅藻会被优先摄入，这表明了硅藻饵料可以在鱼、虾以及贝类的生长过程中提供充足的营养，并且易于捕食，应当是水产养殖业的首选饵料。谚辞調担鈧谄动禪泻類。1.4影响硅藻脂肪酸组成和含量的环境因子（1）硅藻自身的影响：硅藻的脂肪酸组成及含量受自身遗传因素的影响，不同种类硅藻的脂肪酸组成差别很大。硅藻的主要脂肪酸为C14:0、C16:0、C16:1、C16:3和C20:5（EPA），以上5种脂肪酸总含量可以占到总脂肪酸的80%以上。其中饱和脂肪酸以C16:0所占比例最大，不饱和脂肪酸C16:1（n-7）、C16:3（n-4）和C20（n-3）含量较高。硅藻中C16:1（n-7）的含量要高于C16:0，并且有较高水平的EPA，C16:3（n-4）的含量也要高于其他藻类【13】。嘰觐詿缧铴嗫偽純铪锩。（2）培养基主要成分氮、磷、硅的影响：培养基对硅藻脂肪酸组成和含量的影响主要集中在氮、磷、硅。对多数硅藻来说培养基中氮的含量及其来源对硅藻脂肪酸组成及多不饱和脂肪酸含量有较大影响【14】。Yongmanitchai等研究发现，三角褐指藻在利用铵、硝酸盐和尿素等作为氮源时，EPA的含量分别占总脂肪酸的25.2%、10.0%、31.8%【15】。熒绐譏钲鏌觶鷹緇機库。磷是硅藻生长繁殖的必需元素，磷存在于单细胞藻的原生质和细胞核中，参与藻的光合作用、促进酶的活性、起调节作用等【16】。Yongmanitchai等研究发现，磷对三角褐指藻PUFAs的积累影响很明显，当培养基中磷酸盐的浓度在0.05-0.5g/L的范围内对生物量的影响不大，但大于0.5g/L时，细胞则不能生长。磷酸盐浓度在0.1-0.5g/L范围内，EPA达到最佳水平【15】。鶼渍螻偉阅劍鲰腎邏蘞。硅是硅藻生长必不可少的营养元素，除了作为细胞壁结构成分外还参与光合色素、蛋白质、DNA的合成和细胞分裂等多种代谢和生长过程【17】。硅限制能够导致硅藻脂肪酸百分比组成变化，EPA百分含量增加【18】。纣忧蔣氳頑莶驅藥悯骛。（3）温度：温度对硅藻中脂类种类的形成起着重要的作用，温度变化也会导致硅藻脂肪酸组分的变化。温度对硅藻脂肪酸的组成因种而异，总体的趋势是随着温度的降低脂肪酸的不饱和度会增加，这可能是因为温度降低，藻类会通过生产更多的PUFAs来保持细胞膜的流动性【19】，但当温度降低时又会导致硅藻生长缓慢，生物量降低。（4）盐度：盐度对硅藻脂肪酸组成的影响也因种而异。Yongmanitchai等研究发现，当三角颖刍莖蛺饽亿顿裊赔泷。褐指藻的培养基中NaCl浓度为3-5g/L时，EPA含量保持稳定；但当NaCl浓度超过5g/L时，EPA百分含量会迅速降低【15】。但无论哪种硅藻，当其处于不适的盐度当中，都会产生一些代谢物以保护自身不受盐分伤害并且保持与环境的渗透平衡【20】。濫驂膽閉驟羥闈詔寢賻。（5）光照强度：光照强度是硅藻培养中影响其生长和生化组分变化的重要元素之一。早期的研究表明，增加光照强度能刺激C16和C18不饱和脂肪酸的合成，主要是C16:2（n-6）、C16:3（n-6）、C16:4（n-3）、C18:2（n-6）和C18:3（n-3），增加光照强度还能显著增加甘油三酯的含量【1】。光照强度对硅藻脂肪酸的组成影响因种而异，多数硅藻在低光照强度时具有较高水平的EPA，DHA含量则随着光照强度的降低而减少【21】。銚銻縵哜鳗鸿锓謎諏涼。（6）pH：不同硅藻生活的最佳pH值不同，偏离最佳pH值，硅藻生长和体内有关代谢活动即受抑制，海洋硅藻生长的最佳pH值与海水的pH值相近约为8.0【22】。一些研究学者认为pH会影响光合作用中CO2的可用性和硅藻对有机碳源的利用效率，并影响培养基中微藻细胞对离子吸收和利用以及细胞膜的渗透性【23】。目前有关pH值对海洋硅藻脂肪酸组成和含量的影响的报道较少。挤貼綬电麥结鈺贖哓类。1.5本课题的研背景和意义三角褐指藻是一种常见的海水经济硅藻，具有适应性强、易于培养的特点，广泛应用于藻类生理、生态研究以及水产养殖和医药行业。特别是在水产养殖行业，三角褐指藻作为优质的硅藻海洋饵料，发挥着极其重要的作用。硅藻富含丰富的高度不饱和脂肪酸（PUFAs），特别是二十碳五烯酸（20:5n-3，EPA）和二十二碳六烯酸（22:6n-3，DHA）是许多鱼类幼体、对虾幼体以及双壳类幼虫的所必须脂肪酸，关系到其幼虫和幼体的生长发育及存活。EPA和DHA虽然对有些动物并非必需，但在饵料中适当添加这些物质，可以提高投喂动物的生长速度和存活率。三角褐指藻中所富含的脂肪酸中EPA所占的比重非常大【】，这就意味着三角褐指藻必将会是水产动物养殖的重要饵料，具有很大的开发和利用潜力。赔荊紳谘侖驟辽輩袜錈。硅藻中脂肪酸的组成除了受到其自身遗传因素的控制之外，还受到很多培养条件的影响，例如环境因素（营养盐、光照、温度、盐度、pH值）都可导致脂肪酸，特别是EPA含量的变化。三角褐指藻的生物技术应用及大规模的商业化生产仍处于初级开发阶段，因此户外高密度培养三角褐指藻的条件优化研究对于其大规模商业化生产具有重要意义。塤礙籟馐决穩賽釙冊庫。1.6本课题的研究内容三角褐指藻户外高密度培养条件优化研究，主要分为以下5部分内容：（1）三角褐指藻户外高密度培养的盐度优化研究：在一级跑道池（2.5平方米）中，在接种密度及其他条件相同的条件下，分别用20、25和30盐度的消毒海水配制培养基以培养三角褐指藻。通过对细胞生长速度、细胞密度以及脂肪酸的积累情况进行分析对比，确定户外高密度培养三角褐指藻的最适宜盐度。裊樣祕廬廂颤谚鍘羋蔺。（2）三角褐指藻户外高密度培养的pH值优化研究：在一级跑道池（2.5平方米）中，在接种密度及其他条件相同的条件下，通过通入CO分别控制培养基pH在7.5、8.0和8.5以培养三角褐指藻。通过对细胞生长速度，细胞密度以及脂肪酸的积累情况进行分析对比，确定户外高密度培养三角褐指藻的最适宜pH值。仓嫗盤紲嘱珑詁鍬齊驁。（3）三角褐指藻户外高密度培养的氮源种类优化研究：在一级跑道池（2.5平方米）中，在接种密度及其他条件相同的条件下，分别用碳铵和尿素做氮源培养三角褐指藻，比较氮源种类，通过对细胞生长速度，细胞密度以及脂肪酸的积累情况进行分析对比，确定户外高密度培养三角褐指藻的最适宜的氮源种类。绽萬璉轆娛閬蛏鬮绾瀧。（4）昼夜变化对三角褐指藻脂肪酸组成和含量的影响研究：在接种密度及其他条件相同的条件下，用碳铵做氮源培养三角褐指藻直到氮源用尽，分析对比在氮饥饿条件下每3小时取样一次，通过对细胞密度以及脂肪酸的积累情况进行分析对比一个昼夜周期中的变化情况，确定三角褐指藻合成脂肪酸与氮源浓度和昼夜变化之间的关系。骁顾燁鶚巯瀆蕪領鲡赙。（5）户外高密度培养过程中细胞对氮、磷同化规律研究：在一级跑道池（2.5平方米）、二级跑道池（10平方米）、三级跑道池（40平方米）进行三角褐指藻的户外高密度培养。在一个生长周期内，通过分析得出三角褐指藻户外高密度培养基中氮磷含量与细胞数、OD值、细胞干重以及脂肪酸变化情况的关系。瑣钋濺暧惲锟缟馭篩凉。第二章 实验材料与测试方法2.1实验材料与仪器藻种：三角褐指藻由广东海洋大学黄翔鸿教授赠与。使用培养基配方（终浓度mg/L）9：碳酸氢铵139.5、NaH2PO4 10、NaSiO9HO 60、EDTANa 4.35、FeSO7HO 3.25、ZnSO7HO 0.022、MnCl4HO 0.18、NaMoO2HO 0.0065、CuSO5HO 0.00975、CoCl6HO 0.01。鎦诗涇艳损楼紲鯗餳類。主要仪器与设备：见表2-1表2-1 主要仪器与设备名称 型号 生产厂家盐度计 ATC 上海淋誉贸易有限公司笔式pH计 MT-8062 Exact Instrument可见分光光度计 721 上海佑科仪器仪表有限公司生物显微镜 PH100 中国江西凤凰光学集团公司电子天平 BS224S Sartorius冷冻干燥机 Modulyod Thermor Eletron Corporation气相质谱联用仪 6890-5975i 氨氮测定仪 HI96715 Hanna Instruments高速离心机 TDL-4013 上海安享科学仪器厂掌上离心机 20B02450江苏省海门市其林贝尔仪器制造有限公司光照强度测定仪 1339R TaiWan微型漩涡混合仪 WH-1 上海沪西分析仪器厂有限公司2.2试验方法本研究分别采用一级跑道池（底面积2.5平方米）、二级跑道池（底面积10平方米）、三级跑道池（底面积40平方米）进行三角褐指藻的户外高密度培养条件优化研究，每级跑道池可以达到的培养液水深都为20cm。栉缏歐锄棗鈕种鵑瑶锬。培养基用水都是经过0.5微米微孔滤膜过滤并用10ppm二氧化氯消毒后方可使用（空池及器具消毒采用50ppm二氧化氯消毒）。辔烨棟剛殓攬瑤丽阄应。培养基的配制及使用严格按照f/2培养基配方用量及使用方法（N、P、Si为f用量）。三角褐指藻高密度培养过程是由实验室250mL三角瓶培养开始，当藻液数量达到6至7个18L桶时，将藻液在一级池中首先接种，然后由一级池到二级池再到三级池分为三个阶段扩大培养，并采用培养与采收循环的模式，即采收后在原池中留有部分藻液继续添加培养基培养，从而达到三角褐指藻的高密度连续培养的目的，降低生产成本。峴扬斕滾澗辐滠兴渙藺。三角褐指藻户外高密度培养的主要目的是获得富含多不饱和脂肪酸（尤其是EPA）。本研究的另外一个重点就是分析对比在三角褐指藻处于氮饥饿的条件下一个昼夜周期内脂肪酸，特别是EPA的变化情况，从而找到三角褐指藻积累脂肪酸与昼夜变化之间的关系。詩叁撻訥烬忧毀厉鋨骜。2.2.1实验室阶段培养三角褐指藻的实验室阶段培养主要包括培养基配制、扩种以及在实验室人工光源的条件下连续培养。在实验室中三角褐指藻最初由250mL的小三角瓶的藻种要扩种培养到18L的饮用水大桶中，要注意的是接种前要对用具和培养基进行严格的消毒。三角褐指藻在实验室培养过程中每天要保持连续光照并且不断通入空气进行混合搅拌。当培养到6-7个大桶时即可接种到一个一级池中进行户外培养。则鯤愜韋瘓賈晖园栋泷。2.2.2户外培养及采收户外培养主要包括三角褐指藻由一级池到三级池的户外培养以及采收工作。在户外培养过程中每级跑道池的接种密度要达到起始OD680在0.2到0.3之间，接种时间一般选在早上光照不强的时间，接种以及培养过程中添加的培养基使用配方与实验室培养阶段培养基配方相同，但其中碳酸氢铵、硅酸钠、磷酸二氢钠以及EDTA要使用工业级产品。胀鏝彈奥秘孫戶孪钇賻。在户外培养的过程中要尽量避免生物污染，特别是变形虫的污染，所以各个阶段都要严格做好水体、跑道池以及使用器具的消毒工作。配制培养基用的海水通过自来水稀释浓缩海水获得。配制培养基之前海水要经过微孔滤膜过滤系统进行过滤，并用二氧化氯进行消毒过夜，第二天方可使用。鳃躋峽祷紉诵帮废掃減。在户外培养过程中人工可以控制的培养条件有培养基水深、培养基盐度以及培养基的pH值，这些都要根据三角褐指藻的实际生长状态和实验要求进行调整。培养过程中藻液和培养基的输送都采用空气隔膜泵进行，空气隔膜泵使用前后要进行清洗消毒。稟虛嬪赈维哜妝扩踴粜。三角褐指藻户外培养采收时采用循环培养的模式，即浓缩得到的高浓度藻液进行灌装冷藏，浓缩过程的透过培养液则排入培养池中循环使用，但培养液的使用最多可以持续3批次的生长周期，其一个生长周期定义为OD值由0.3一下增长到1.3以上的过程。陽簍埡鲑罷規呜旧岿錟。采收过程采用二级过滤的采收模式，即藻液首先通过20微米的预过滤装置除去藻液中较大的杂质，再经过0.5微米的微滤膜组件来浓缩藻液，藻液会被挡在0.5微米的沩氣嘮戇苌鑿鑿槠谔應。10滤膜外，而培养液则会通过微孔滤膜，从而达到藻液与培养液分离的目的。这样通过连续循环浓缩后藻液达到预期浓度，最后将浓缩藻液灌装后冷藏备用。钡嵐縣緱虜荣产涛團蔺。图2-1 一级培养池图2-2 超滤采收装置2.3分析与测试2.3.1细胞密度、OD值和细胞干重藻液OD值得测定：在试验阶段每天早上8点和晚上6点钟分别取样，取样要在藻液搅拌混合均匀的情况下用灭菌后的烧杯取藻液约50mL，取到的藻液分别装入3个5mL懨俠劑鈍触乐鹇烬觶騮。的比色皿中，比色皿使用前必须用蒸馏水清洗3次，在用待测藻液润洗三次，取另外一个清洗过的比色皿装入蒸馏水作为参照，用可见分光光度计在680纳米波长的光波下测得三个平行样的OD值并计算平均值，即为测得的藻液的OD值。要注意的是，当第一次测得OD值超过0.8的时候，就要将藻液稀释一倍再测定其OD值并乘以2，即为最终的OD值。謾饱兗争詣繚鮐癞别瀘。细胞密度的测定：在生物显微镜下，通过血球计数板计数获得，分别计数四个角与中央方格共五个方格内的细胞数，然后将数得的数值乘以5再乘以10的4次方得到的数即为每毫升藻液中所包含的细胞数，即细胞数C=X5104个/mL，细胞计数要进行3次平行计数，取平均值得到最终的细胞密度。要注意的是，当细胞数过多的时候，要对藻液稀释适当的倍数在进行细胞计数。呙铉們欤谦鸪饺竞荡赚。细胞干重的测定：取样后的藻液通过4000转的台式离心机离心8分钟后，弃上清，藻泥用蒸馏水清洗一次进行2次离心，再用少量蒸馏水清洗取藻泥并入2ml离心管中。上清液用7000转掌上离心机离心10分钟，得到的藻泥进行冷冻干燥，然后用分析天平准确称量干燥后藻粉的质量，通过计算得出每升藻液中含有的细胞干重，G=X/0.36mg/L。莹谐龌蕲賞组靄绉嚴减。2.3.2培养基中氮、磷含量的测定碳酸氢铵中铵态氮含量的测定通过氨氮测定仪测得。取样后的藻液通过4000转的台式离心机离心8分钟后，取上清液，用7000转掌上离心机离心10分钟，得到更为澄清的上清液，稀释10倍后，用氨氮测定仪测定其铵态氮的含量。氨氮测定仪测得的数据为铵态氮的含量，通过计算得出f/2培养基中碳酸氢铵所对应的测试结果为15.89ppm。麸肃鹏镟轿騍镣缚縟糶。尿素氮含量的测定采用丁二酮肟比色法24。需要的试剂有：（1）0.2%氨基硫脲：0.2g氨基硫脲溶于100mL；（2）丁二酮肟：0.3g丁二酮肟加入10mL强酸，浓硫酸：85%磷酸=2:3；（3）尿素标准液：准确称取尿素0.1g，加水定容至1000mL，用时稀释10倍，即10mg/L。测定方法为：（1）制作标准曲线：准确吸取尿素标准溶液0、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL于15mL试管中，加水定容至4mL，再加入0.2mL的0.2%氨基硫脲和0.8mL的丁二酮肟，置于沸水浴中煮沸10分钟，取出后用流动水冷却，加蒸馏水至10mL，用分光光度计在520nm处测吸光度（A520）。绘制标准曲线，用最小二乘法进行回归，得到回归方程，尿素的浓度为Y（mg/L）=40.917A520+0.1104（R2=0.997）。納畴鳗吶鄖禎銣腻鰲锬。（2）样品测定：藻液离心后取上清液，稀释适当的倍数，准确吸取1mL样品，用制作的标准曲线的方法进行测定，根据回归方程计算培养基中残留尿素的含量。風撵鲔貓铁频钙蓟纠庙。图2-3 丁二酮肟比色法测定尿素浓度标准曲线磷酸盐含量的测定采用磷钼蓝比色法【16】。方法为：藻液离心后取上清液，稀释适当的倍数，取25mL上清液与试管，加入2.0mL的混合溶液，混匀。再加入0.5mL的抗坏血酸溶液，混匀，放置10分钟。在分光光度计上于882纳米波长处测吸光值A，查标准曲线。灭嗳骇諗鋅猎輛觏馊藹。图2-4 磷钼蓝比色法测定磷酸二氢钠浓度标准曲线2.3.3脂肪酸组成与含量的测定脂肪酸的测定，首先要配制试剂：（1）内标液：准确称量10mg内标（C19:0），加入10mL二氯甲烷，混匀后分别分到5个2mL的离心管中，密封。铹鸝饷飾镡閌赀诨癱骝。（2）饱和NaCl溶液：准确称量50gNaCl，加入200mL去离子水，混匀。（3）饱和KOH-CH3OH溶液：准确称量6g氢氧化钾，加入150mL甲醇，混匀。（4）BF3-CH3OH（体积比为1:4）：准确量取35mL三氟化硼加入140mL甲醇，混匀。（5）正己烷：色谱纯测量方法：准确称取10mg藻粉于10mL螺口试管中，加入100L内标液，静止干燥，待藻粉干燥后加入2mLKOH-CH3OH溶液，75摄氏度水浴加热15分钟，冷却后加入2mLBF3-CH3OH，再在75摄氏度中水浴加热15分钟，待冷却后加入1mL饱和NaCl和2mL正己烷，然后涡旋1分钟进行混匀，并在4000转下离心8分钟，取上清液1mL过0.22m滤膜于进样瓶中。制作好样品后通过高效气相色谱仪测得各脂肪酸的组成与含量，最后进行数据分析处理。攙閿频嵘陣澇諗谴隴泸。第三章 不同条件对三角褐指藻生长及脂肪酸积累情况探究目前三角褐指藻的户外高密度培养技术仍处于开发阶段，没有一个相对成熟的培养体系，也没有比较成功的生产实例。为了得到一个三角褐指藻户外高密度培养的最佳培养体系，本研究将对三角褐指藻户外高密度培养的主要条件进行优化研究。研究主要包括：盐度的优化实验，pH值的优化实验，氮源种类的优化实验，昼夜变化对三角褐指藻脂肪酸组成和含量的影响实验以及三角褐指藻生长过程中氮、磷同化规律的研究实