荧光分析法的应用.ppt

第三章分子发光分析法 第一节分子发光法概述 一 分子发光 MolecularLuminescence 基态分子吸收了一定能量后 跃迁至激发态 而激发态分子以辐射跃迁形式将其能量释放返回基态时 产生分子发光 二 分子发光的类型 1 按激发的模式分类 光致发光化学发光 生物发光热致发光场致发光摩擦发光 2 光致发光按激发态的类型分类 分子发光 荧光fluorescence 磷光phosporescence 1 分子荧光 MolecularFluorescence 分析法 是根据物质的分子荧光光谱进行定性 以荧光强度进行定量的一种分析方法 2 分子磷光 MolecularPhosphorescence 分析法 是以分子磷光光谱来鉴别有机化合物和进行定量分析的一种方法 3 化学发光 Chemiluminescence 分析法 是利用某些化学反应所产生的光发射现象而建立的一种分析方法 本章讨论内容 16世纪 当UV vis照射某些物质 发出各种颜色和不同强度的光 停止照射时 物质的发光随之消失 1852年 Stokes在考察奎宁和叶绿素的荧光时 观察到其荧光的波长比入射光的波长稍微长些 才判断这种现象是这些物质在吸收光能后重新发射不同波长的光 而不是由光的漫射作用所引起的 从而导入了荧光是光发射的概念1867年 Goppelsroder进行了历史上首次的荧光分析工作 应用铝 桑色素配合物的荧光对铝的含量进行测定 20世纪以后 随着荧光仪器的问世 荧光分析方法得到极大的发展 现已成为一种重要且有效的光谱分析手段 第二节分子荧光分析法一 概述 荧光分析法其特点 1 灵敏度高 检测限比吸收光谱法低1 3个数量级 通常在ppb级 2 取样量少 操作简单 3 选择性比吸收光谱法好 能产生紫外 可见吸收的分子不一定发射荧光或磷光 荧光分析法的应用 在药物 临床 环境 食品的微量和痕量分析以及生命科学研究各个领域都具有重要的意义 分子发光分析法属于分子发射光谱法的范畴 具有较高的检测灵敏度 在有机大分子和生物大分子分析中有重要应用 在药物 临床 环境 食品的微量和痕量分析以及生命科学研究各个领域都具有重要的意义 特别是激光诱导荧光分析法因具有超高灵敏度而倍受关注 回顾几个基本概念 反磁性分子 分子电子自旋成对的结果为S 0 单重态若一个分子所有的电子自旋是成对的S 0 那么这个分子所处的电子能态称单重态 有机分子中的电子多为偶数 则分子中的总自旋量子数S 0 即基态分子内的电子是自旋成对的 根据谱线多重度的定义M 2S 1 0 此时这个分子所处的电子能态称为单重态 若电子在激发态与在基态的自旋方向相同 则激发态仍是单重态 此为激发单重态 三重态 若在激发过程中电子自旋方向改变 即与基态时的自旋方向相反 变为平行状态 则S 1 2 1 2 1 M 2S 1 3 这样的激发态为三重态 由于自旋平行比自旋相反的状态稳定 同一激发态中 三重态的能级比相应单重态的能级低 一 分子荧光的产生1 分子发光室温下 大多数分子处于基态的最低振动能层 处于基态的分子吸收能量后被激发为激发态 激发态不稳定 将很快衰变到基态 若返回到基态时伴随着光子的辐射 这种现象被称为 发光 2 激发单重态S与激发三重态T处于分子基态单重态的一个电子被激发时 通常跃迁至第一激发单重态的能级轨道上 也可能跃迁至能级更高的单重态上 这种跃迁是符合光谱选律 如果跃迁至第一激发三重态轨道上 则属于禁阻跃迁 一荧光与磷光的产生过程 术语 电子激发单重态与三重态示意图 在单重激发态中 电子的自旋方向仍然和处于基态轨道的电子配对 表现出抗磁性 其平均寿命为10 5 10 8s 在三重激发态中 两个电子平行自旋 表现出顺磁性 其平均寿命为10 4 1s 3 分子荧光 磷光 产生示意图每个分子具有一系列严格分立的能级 称为电子能级 每个电子能级中又包含了一系列的振动能层和转动能层 图中基态用S0表示 第一电子激发单重态和第二电子激发单重态分别用S1 S2表示 0 1 2 3 表示基态和激发态的振动能层 见下图 第一 二电子的激发三重态分别用T1和T2表示 S2 S1 S0 T1 吸收 荧光 磷光 系间窜跃 内转化 振动弛豫 能量 l2 l1 l 3 l3 T2 内转化 分子内的光物理过程 辐射跃迁的类型 荧光 10 8sec磷光 1 10 4sec 无辐射跃迁的类型 振动弛豫 VR 10 12sec内转化 ic S2 S1能级之间有重叠系间窜跃 isc S1 T1能级之间有重叠 V 0 1 2 3 1 V 0 2 3 4 常用术语 1 振动弛豫 在同一电子能级上 分子由较高振动能级向该电子态的最低振动能级的非辐射跃迁 其过程速率极大 在10 14 10 12内即可完成 2 内转化 相同多重态的两个电子态之间 如S2S1 的非辐射跃迁 其转化速率取决于两能级之间的能量差 相邻单重激发态之间能级较近 其振动能级常发生重叠 内转化很快 在通常情况下 分子被激发到任一个电子激发态 经内转化和振动弛豫都会跃迁至最低电子激发态的最低振动能级上 而且时间极短 10 13 10 11 3 体系间的窜跃 不同多重态的两个电子态间的非辐射跃迁 单重激发态S1的最低振动能级同三重态T1的较高振动能级重叠 因此就可以产生体系间的窜跃 由此体系间的窜跃改变电子的自旋方向 属于禁阻跃迁 因而跃迁速率较小 使得三重态有较长的寿命 约为10 3 10s 4 荧光的产生处于第一电子激发单重态最低振动能级的分子 以辐射跃迁的形式返回基态各振动能级时 就产生了分子荧光 由于激发态中存在振动弛豫和内转化现象 消耗了其吸收光子的能量 因此产生的荧光光子能量较之与分子受激发所吸收的光子能量低 那么其荧光波长总大于激发波长 5 磷光的产生处于激发三重态的分子跃迁返回基态时所产生的辐射 在同样的分子轨道上 处于三重态分子能量低于相应单重态分子 为什么 再加上体系间的窜跃和振动弛豫消耗光子的能量 那么其磷光l3 大于所发出的荧光l3 且这种跃迁属于禁阻跃迁 其发光速率较慢 因而磷光较之荧光有较长的寿命 当激发光停止后 荧光立即消失 而磷光则将持续一段时间 10 4 1s 光致发光的主要过程 如表总结了光致发光的主要过程 第二节分子荧光分析法 一 荧光光谱1 荧光光谱的产生2 荧光光谱的基本特征3 荧光效率和荧光物质4 影响荧光强度的环境因素5 化合物的结构与荧光 1 荧光光谱的产生分子吸收辐射后可能激发为第一电子激发态 或更高激发态 的任一振动能级 这种激发态分子以热的形式损失其振动能后下降为第一电子激发态的最低振动能级 无辐射跃迁 然后再以辐射的形式跃迁为电子基态的任一振动能级 即产生荧光 并进一步以无辐射跃迁形式回到基态的最低振动能级 二分子荧光的性质 荧光和磷光都属于光致发光 级激发光 吸收光 和发射光 因而也具有两种特征光谱 激发光谱和发射光谱 定性和定量的依据 激发光谱 固定荧光的发射波长 测定波长 不断改变激发光波长 即入射光 的波长 并记录相应的荧光强度 的到的荧光强度对激发光波长的谱图称为荧光的激发光谱 反应了某一固定的发射波长下所测量的荧光强度与激发光波长之间的关系 发射光谱 emissiomspectrum 如果激发光的波长和强度保持不变 不断改变荧光的测量波长 所得到的荧光强度对发射波长的谱图则为荧光的发射光谱 反应了某一固定激发波长下所测量的荧光波长的分布 可选择最佳发射波长 2 荧光光谱的基本特征 a Stokes位移在溶液中 分子的荧光发射光谱的波长总比激发波谱的长 分子荧光的发射相对于吸收位移到较长的波长处 称为Stokes位移 原因 激发与发射之间产生了能量损耗 2 荧光光谱的基本特征 b 发射光谱的形状与激发波长无关所发射的荧光光谱由第一激发单重态和基态之间的能量差决定 与激发波长无关 c 镜像规则通常荧光发射光谱与它的激发光谱形状呈镜像对照关系 3 荧光效率 物质发荧光的能力 通常用荧光效率 或称荧光量子产率 来描述荧光辐射跃迁几率的大小 荧光效率定义为发荧光的分子数与激发态分子数目的比值 荧光效率 f 发荧光分子数 激发态分子数 f决定于物质的分子结构 也受化学环境的严重影响 温度 溶剂 酸度 荧光效率及其影响因素荧光效率 f 又称为荧光量子产率 它是用来描述辐射跃迁概率的大小 其定义 荧光效率越高 辐射跃迁概率越大 物质发射的荧光也就越强 若以各种跃迁的速率常数来表示 则 Kf 荧光发射过程的速率常数 取决于物质的化学结构 非辐射跃迁速率常数之和 取决于化学环境和化学结构 定量分析的原理 荧光强度正比于吸收的光量和荧光量子产率 If Ia据Beer定律 Ia I0 It I0 1 e lC 代入上式整理得 If 23 I0 lc在一定条件下 If Kc故 荧光强度与荧光物质的浓度成之正比 前提 低浓度样品 A 0 05 定量分析的原理 定量分析的基础 If Kc定量分析的方法 标准曲线法比较法 荧光分子 能产生荧光的分子称为荧光分子 荧光物质通常为含有苯环或稠环的刚性结构有机分子 典型的如荧光素的分子结构 且提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移 3 荧光物质 1 跃迁的类型 荧光与分子结构关系 对于有机荧光物质 n max 100平均寿命10 5 10 7sec max 104平均寿命10 7 10 9sec n 是有机化合物产生荧光的主要跃迁类型 强荧光的有机化合物具备下特征 具有大的共轭 键结构 共轭体系越大 电子离域性越强 越易被激发而产生荧光 且随共轭体系的增大 荧光效率提高 荧光峰向长波方向移动 如下表所示 具有刚性的平面结构 分子的刚性平面结构有利于荧光的产生 是因为刚性平面结构可以减少分子振动和碰撞去活的可能性 即使得外转移能量损失减少 有利于荧光产生 如 f 1 f 0 2 芴 联苯 a 给电子取代基加强荧光 产生p 共轭 可使共轭体系增大 导致荧光增强 取代基效应 NH2 NHR NR2 OH OR CN 弱荧光 强磷光S1 T1的系间窜跃产率接近1 b 吸电子取代基减弱荧光 加强磷光 C O COOH NO2 不产生p 共轭 不产生荧光 弱磷光 含有O S N等杂原子的有机物 如喹啉和芳酮等 都含有未键合的非键电子n 电子跃迁类型多为n 跃迁 系间窜越强 荧光若或无 不含有O S N等杂原子的荧光有机体 电子跃迁类型多为 跃迁 电子自旋允许 荧光强 10000 在刚性溶剂中常有相当强度的磷光产生 分子产生荧光的必备条件 分子必须具有与所照射的辐射频率相适应的结构 才能吸收激发光 吸收了与其本身特征频率相同的能量后 还必须具有一定的荧光效率 荧光量子产率 4 影响荧光强度的环境因素 a 溶剂的影响除对光的折射 散射外 溶剂的影响主要表现在溶剂的极性 氢键及配位键的形成等 溶剂极性增大 通常使荧光光谱红移 氢键和配位键的形成 改变荧光强度和形状 4 影响荧光强度的环境因素 b 温度的影响温度增加 溶剂分子与荧光分子激发态的碰撞频率增加 外转换去激发的几率增加 荧光量子产率下降 低温荧光分析可提高分析的灵敏度 c 溶液pH对含有酸碱基团的荧光分子 荧光发射受pH影响较大 需严格控制溶液pH 4 影响荧光强度的环境因素 d 内滤效应是指分子发射的荧光通过溶液时 被未激发的荧光物质分子所吸收 自吸收 而引起的荧光强度下降的现象 被测物浓度越高 则内滤效应越严重 4 影响荧光强度的环境因素 e 荧光猝灭是指荧光分子与溶剂分子或其它分子之间相互作用 从而使荧光强度减弱的现象 与荧光物质分子相互作用而引起荧光强度下降的物质称为荧光猝灭剂 三 荧光分析法的应用1 荧光分析法的特点2 定量分析的原理3 荧光分析法的应用 1 荧光分析法的特点 灵敏度高 检出限比吸收光度法低2 4个数量级选择性较强 对有机物而言 试样量少 与光度分析相比 荧光物质较少 应用受限制 2 定量分析的原理 定量分析的基础 低浓度下If Kc定量分析的方法 标准曲线法比较法 3 荧光分析法的应用 a 具荧光特性的有机化合物 生物及药物化合物可直接测定 如 肾上腺素 青霉素 普鲁卡因等药物b 不产生荧光的甾族化合物 经浓硫酸处理后测定 使环状醇类结构变成产生荧光的分类结构 3 荧光分析法的应用 c 本身不具荧光的无机化合物 可与有机荧光试剂配位构成发光体系后进行测量 大约可测60余种元素 常用的荧光试剂 8 羟基喹啉 2 羟基 3 萘甲酸 2 2 二羟基偶氮苯及安息香等 3 荧光分析法的应用 d 生物和基因检测DNA因自身荧光效率低而不易检测 但用某些荧光分子作探针进行标记后 可通过探针分子的荧光变化来研究DNA 常用荧光探针 溴化乙锭 吖啶类荧光染料 钌的配合物等 基因检测领域 荧光染料正逐步取代同位素标记物 荧光分析仪器的基本结构 激发光源 作用 提供连续辐射 激发样品要求 光源强度足够 强度与波长无关种类 汞弧灯 氢灯或氙灯激发单色器 作用 选择激发光的波长 荧光分析仪器的基本结构 样品池 石英制成 正方形 长方形或圆形发射单色器 用于选择投射到检测器的荧光波长检测器 荧光或磷光的强度较弱 要求检测器灵敏度高 荧光分析仪器的基本结构 第三节分子磷光分析法 一 磷光分析法概述二 磷光分析法的原理三 磷光分析仪器四 磷光分析法的应用 一 磷光分析法概述 磷光是分子从亚稳的三重态跃迁至基态时所产生的辐射 磷光分析法是以分子磷光光谱来鉴别有机化合物和进行定量分析的一种方法 1975年以前 大多磷光分析工作在低温下进行 之后才相继出现室温分析方法 使得其在药物分析 临床分析等领域的应用日益广泛 二 磷光分析法的原理 1 磷光的产生和磷光强度2 低温磷光的测量3 重原子效应4 室温磷光测量 1 磷光的产生和磷光强度 磷光是由处于激发三重态的分子跃迁返回基态时所产生的辐射 由于分子的第一电子激发三重态 T1 的能量低于其第一电子激发单重态 因此磷光辐射的波长比荧光长 1 磷光的产生和磷光强度 由第一电子激发三重态 T1 向基态 S0 的跃迁属禁阻跃迁 跃迁速率小 使得T1态稳定性强 所以磷光的寿命长于荧光 同样由于T1态的稳定性强 寿命长 所以以非辐射跃迁方式损失的能量多 因而磷光物质在室温溶液中产生的磷光一般比较弱 1 磷光的产生和磷光强度 当磷光物质浓度很小时 磷光强度和磷光物质浓度之间的关系为 Ip 2 3 pI0kbc p为磷光效率 I0为激发光强度 k为磷光物质的摩尔吸收系数 b为试样池的光程 在一定条件下 p I0 k b均为常数 因此可据上式制作磷光强度对磷光物质浓度的标准曲线 进而用于定量分析 2 低温磷光的测量 由于三重激发态的寿命长 激发态分子与溶剂分子发生碰撞去激发的几率增大 使磷光强度减弱甚至完全消失 为减少这些影响 就需要在低温下测量以保持较大的荧光强度 2 低温磷光的测量 低温测量一般在液氮温度 77K 下进行 溶剂应具有低的磷光背景 且在低温下具有足够的黏度以便能形成透明的刚性玻璃体 以减少磷光的碰撞猝灭 常用溶剂EPA的组成乙醇 异戊烷 二乙醚 2 5 5 v 3 重原子效应 使用含有重原子的溶剂 如碘乙烷 溴乙烷 或在磷光物质中引入重原子取代基 都可以提高磷光物质的磷光强度 这种效应称为重原子效应 前者称为外部重原子效应 后者称为内部重原子效应 4 室温磷光测量 低温测量在实际操作和溶剂选择上有诸多不便 因此促进了室温磷光测量方法的建立 当前主要有 固体基质法溶剂胶束增稳法敏化溶液法 固体基质法 固体基质法是将磷光物质吸附在固体载体上直接进行测量 磷光物质吸附固化后 分子的刚性增加 三重态的碰撞去活化概率大大将小 因而增加了室温下的磷光强度 常用载体 滤纸 硅胶 氧化铝 乙酸钠 纤维素膜等 溶剂胶束增稳法 向溶液加入适当的表面活性剂 由于形成了表面活性剂胶束 改变了磷光物质的微环境 增强了定向约束力 使其昂性增强 减小了内转换和碰撞能量损失等非辐射去激发过程的发生几率 明显增强了三重态的稳定性 从而导致磷光强度显著增大 实现室温下磷光测量 敏化溶液法 向溶液中加入能量受体组分 分析组分作为能量给予体将能量转移给能量受体 引发受体在室温下发射磷光 磷光不是分析组分而是能量受体发射 需要选择合适的能量受体 三 磷光分析仪器 与荧光分析仪器类似 三 磷光分析仪器 特殊部件 试样室 低温磷光测量时需将试样池放在盛液氮的杜瓦瓶内 固体表面室温分析则需要特制的试样室 磷光镜 在既有磷光又有荧光的体系中 使用叫磷光镜的一种机械切光装置 利用荧光和磷光寿命的差异消除荧光干扰 达到测定磷光的目的 四 磷光分析法的应用 稠环芳烃和石油产物的分析农药和生物碱的分析如DDT 萘乙酸等药物分析和临床分析如阿司匹林 普鲁卡因等 第四节化学发光分析法 一 化学发光法概述二 基本原理三 化学发光反应的类型四 化学发光分析仪器五 化学发光法的应用 一 化学发光法概述 化学发光是利用某些化学反应所产生的光发射现象而建立的一种分析方法 在化学发光中 发光物质所需的激发能不是光能 热能或电能 而是化学反应过程所提供的化学能 一 化学发光法概述 化学发光分析的突出特点在于 灵敏度很高测定的线性范围宽 一般有5 6个数量级仪器设备简单 无需激发光源和单色器 分析速度快 流动注射化学发光分析每小时可测定100多个试样 但试剂种类有限 机理尚待研究 二 基本原理 1 化学发光的产生在化学反应中 某一反应产物的分子接受反应能被激发 形成电子激发态 当它们由激发态返回到基态时 以辐射的形式将能量释放出来 A BC DC C hv 二 基本原理 某些化学发光反应需加入 能量受体 该物质不参与反应 但可接受化学能跃迁到激发态 返回基态时发射出一定波长的光 此为间接发光的过程 A BC D C XF X XX hvX为能量受体 C 为能量给予体 二 基本原理 产生化学发光必备条件 能快速地释放出足够能量 可见光区的化学发光需能170 300kJ mol 这些能量能被某种物质吸收产生电子激发态 足够的光量子产率 二 基本原理 2 化学发光效率 CL等于生成激发态分子